养殖业中经常使用，食品检测 时易超标，研制的试纸条检测灵敏度较高等=方面因素，选择了SD、SM2、SMP=种药物进行 实际样品添加回收实验，鉴于同一动物源性食品中会有多种横胺药物残留的可能性，实验 中配制了常用的SD、SM2、SMD、SMZ、SMM、SQX等六种药物的混标，同时在实际样品中进行混 标添加回收实验，具体方法如下： 猪肉、鱼肉等组织样品；取22个离屯、管，分别编号为1~22,称取一定量的样品于各离屯、 管中，1、2号管作样品空白，3~6号管分别加入SD标准品，使其浓度分别为20ng/g、35ng/ g、50ng/g、100ng/g，7~10号管分别加入SM2标准品，使其浓度分别为10ng/g、20ng/g、30 ng/g、50ng/g，ll~14号管分别加入SMP标准品，使其浓度分别为10ng/g、20ng/g、30ng/ g、50ng/g，15~18号管分别加入6种药物的混标，使其浓度为30ng/g、50ng/g、80ng/g、100 ng/g，设置19、20、21、22号管分别作为4、8、12、17号管的平行管，来检验方法的重复性，各 标准品加入到实际样品中W后，先充分混匀，然后进行样品前处理，所得样品提取液用试纸 条进行检测，根据实验结果判定待测物的添加回收情况。
[0043] 牛奶样品；牛奶样品在进行加标回收实验时，选用了其中的离屯、法进行检测，具体 方法为：准确移取牛奶样品2mU分别向牛奶中添加SD、SM2、SMP、六种混标等标准品，每种 标准品添加至不同的终浓度，充分混匀，12000r/min离屯、5min，取80yL样品进行试纸条测 试，观察显色情况，判断试纸条的实用性。
[0044] 向S种实际样品中分别添加不同终浓度的SD、SM2、SMP及6种常用药物混标，经样 品前处理，试纸条测试，其中，牛奶样品测试结果见图6,猪肉样品测试结果见图7,鱼肉样 品测试结果见图8,鱼肉样品加标提取时，个别离屯、管有淡黄色物质提取出来，加样后会层 析到吸水垫位置，不影响试纸条显色。由实验结果可知，牛奶样品中，SM2含量超过lOng/mL 时，试纸条可W检出，SD、SMP含量超过20ng/mL时，试纸条可W检出，混标含量超过50ng/mL 时，试纸条可W检出；猪肉及鱼肉样品中，SM2含量超过20ng/g时，试纸条可W检出，SD、SMP 含量超过35ng/g时，试纸条可W检出，混标含量超过80ng/g时，试纸条可W检出，各平行实 验检测结果一致，综合W上数据可W得出；当样品中SM2、SD、SMP、6种横胺药物（SD、SM2、 SMD、SMZ、SMM、SQX)混标的浓度高于国家限量的100yg/kg时，试纸条均可W检出，说明样 品前处理方法可行，研制的试纸条具有实际应用价值，可W检测多种横胺药物残留。
[0045] 本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应 认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包 被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫 依次搭接在所述PVC底板上，其特征在于：所述结合垫包被设有磺胺类单克隆抗体-胶体金 标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有磺胺类药物抗 原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。2. 如权利要求1所述的一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其 特征在于：包括以下步骤： 步骤一、胶体金的制备：取1个250 mL烧杯，加入100 mL 0.01%氯金酸溶液，于恒温磁 力搅拌器上使用温度档350 °C对其进行加热，转速为300r/min，加热至沸腾状态后，沸腾 时的实际温度为100 °C，向烧杯中快速加入500 ML 1%柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变 为红色后再加热10 min，直至溶液透亮，冷却至室温，4°C密封保存，即制得胶体金； 步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为7. 4的所述胶体金I mL于I. 5 mL离心 管中，向离心管中加入3Pg/ml的磺胺类药物单克隆抗体，用涡旋仪涡旋10 min后静置20 min;向离心管中加入100 ML 10% BSA溶液，用涡旋仪涡旋lOmin，静置10 min，制得金标抗 体，即磺胺类药物单克隆抗体-胶体金标记物； 同时，将制得的金标抗体溶液于4 °C 2500 r/min，离心10 min，去除下层沉淀，将上清 液转到另一离心管中，于4 °C 9000 r/min，离心30 min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释 溶液稀释至原体积的1/20,于4 °C保存备用； 步骤三、试纸条的组装：（1)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC底 板上，吸水垫压住NC膜上方1-2 mm ; (2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切 割成4 mm宽的试纸条；（3)将样品垫和结合垫切成4 mm宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗 体溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫；（4)烘干后的金标垫剪成I cm长的小块并贴于PVC 底板上，金标垫压住NC膜下方1-2 mm，同时用样品垫压住金标垫下方1-2 mm，根据试纸条 长度修剪样品垫；（5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被磺胺类药物抗原和羊抗鼠 IgG，分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速 度40mm/s，单位喷量：检测线为0. 8 yL/cm，质控线为I. 0 yL/cm，使得磺胺类药物抗原包被 浓度为〇? 05 mg/mL ;羊抗鼠IgG包被浓度为0? 8 mg/mL。3. 如权利要求2所述的一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其 特征在于：在所述步骤三（3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫 与金标结合垫用切条机分别切成4 mm宽的长条，用含有5%的蔗糖、5% BSA和终体积浓度为 0. 1%的pH为7. 4的0. 01 mol/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37 °C条件下 烘干12 h备用。4. 如权利要求2所述的一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其 特征在于：还包括步骤一之前对试验所用容器的清洗：首先将试验所用容器在重铬酸钾洗 液中浸泡24 h，取出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器 于二氯甲硅烷含量为5%的氯仿中浸泡I min后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放 置于室温条件下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37°C进行干燥处理，备 用。
【专利摘要】本发明公开了一种检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫依次搭接在所述PVC底板上，所述结合垫包被设有磺胺类单克隆抗体-胶体金标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有磺胺类药物抗原，所述质控线包被有羊抗鼠IgG；本发明同时公开了上述胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括胶体金的制备、金标抗体的制备及纯化及试纸条的组装步骤。本发明的胶体金免疫层析试纸条具有特异性强、灵敏度高、操作简便，检测快速、准确并适合现场使用的特点。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN104977411
【申请号】CN201510257681
【发明人】李健, 苏文金, 苏国成, 周常义, 曹爽
【申请人】集美大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年5月20日