一种基于乙二胺四乙酸模拟酶试剂盒的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于化学生物传感以及生物检测技术领域，具体涉及一种基于乙二胺四乙酸模拟酶试剂盒的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]毒品滥用已成为日益严峻的全球问题，毒品犯罪给全社会带来严重的危害。冰毒化学名称为甲基苯丙胺，是一类属于中枢神经兴奋剂。因其特殊的生理作用，成为最为流行的合成毒品在全球蔓延，也是在我国发展速度最快的毒品。大量的事实表明，冰毒滥用将给个人和社会带来严重的危害，急需建立一种针对冰毒的超高灵敏度快速分析方法。前列腺癌是全球第二大男性恶性肿瘤，过去在我国发生率较低，但随着人口老龄化和生活方式的改变，我国前列腺癌的发病率急剧上升，已经跃居男性恶性肿瘤的第6位，成为泌尿外科中发病率最高的肿瘤，因而前列腺癌的早期诊断和治疗仍是亟待解决的最重要的医学问题之
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[0003]我们的研究表明乙二胺四乙酸具有一定的光催化能力，在乙二胺四乙酸的存在下，H2O2被快速催化分解。由氯金酸通过H2O2还原法可以方便地制备出各种不同粒径的纳米金颗粒，其颜色依直径大小而呈红色至蓝色。同时，金纳米颗粒随直径的变化呈现出不同的颜色，其紫外-可见吸收峰也会相应发生变化。在金纳米颗粒的制备中，双氧水溶液是重要的反应物之一，而乙二胺四乙酸能催化分解双氧水，之后双氧水的浓度发生改变，金纳米颗粒就会呈现出不同的颜色，从红色、紫红色至蓝色。基于此，我们建立一种双模检测的新方法，既可利用颜色变化对待测物进行可视化半定量检测，又可以通过吸光度的大小对待测物的准确含量进行定量检测。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一在于提供一种基于乙二胺四乙酸模拟酶试剂盒的制备方法。该试剂盒为超高灵敏度试剂盒，它能快速准确地检测冰毒以及前列腺癌抗原，使乙二胺四乙酸成功取代传统的酶联免疫吸附反应中的生物酶。小分子的乙二胺四乙酸在存储运输、价格、稳定性等方面有生物酶大分子无可比拟的优点，更重要的是，乙二胺四乙酸不存在生物蛋白酶容易失去生物活性的问题。另一方面，引入金纳米颗粒不同状态下表现出不同颜色，建立可视化检测，此外，金纳米粒子的高消光系数为这种检测方法提供了极高的检测灵敏度，甚至可检测到空气中的分子水平的毒品分子，与传统的酶联吸附方法相比，显著提高检测的灵敏度以及稳定性。
[0005]本发明的上述目的是通过如下的技术方案来实现的:该基于乙二胺四乙酸模拟酶试剂盒的制备方法，包括如下顺序的步骤:
[0006](I)将冰毒抗体或者前列腺癌抗体接到96孔聚苯乙烯微孔板上，4°C下反应10小时，三次PBS缓冲溶液冲洗后，加入终止缓冲溶液即浓度为lmg/mL BSA的PBS缓冲溶液反应I小时；
[0007](2)三次PBS缓冲溶液冲洗后，再在不同微孔板中对应加入各种浓度的样品稀释液，反应I小时；所述样品稀释液为稀释成浓度为1X10 12至2X10 18mg/mL的冰毒溶液或者稀释成浓度为I X 10 12至I X 10 16mg/mL的前列腺癌抗原溶液；
[0008](3)三次PBS缓冲溶液冲洗后，再对应加入乙二胺四乙酸标记的冰毒抗体或者乙二胺四乙酸标记的前列腺癌抗体，反应I小时；
[0009](4)再用PBS缓冲溶液冲洗三次，然后加入柠檬酸三钠溶液以及双氧水溶液，反应40分钟后，加入氯金酸溶液；30分钟后，观察不同微孔板中溶液颜色的变化，与对比实验中生成的显色底物金纳米颗粒溶液即柠檬酸三钠溶液、双氧水溶液和氯金酸溶液所制备的金纳米颗粒溶液的颜色进行对比；并用酶标仪记录不同浓度的样品稀释液在波长550nm处的吸光度值，与对比实验中生成的显色底物金纳米颗粒溶液的吸光度值进行对比，即能得到检测结果，实现冰毒以及前列腺癌抗原的快速检测。
[0010]具体的，步骤(3)所述乙二胺四乙酸标记的冰毒抗体是:使用活化剂EDC和NHS对乙二胺四乙酸进行活化之后，将冰毒抗体加入到活化后的乙二胺四乙酸溶液中，反应I小时，透析处理24小时所得；步骤(3)所述乙二胺四乙酸标记的前列腺癌抗体是:使用活化剂EDC和NHS对乙二胺四乙酸进行活化之后，将前列腺癌抗体加入到活化后的乙二胺四乙酸溶液中，反应I小时，透析处理24小时所得。
[0011]具体的，步骤(4)所述加入柠檬酸三钠溶液、双氧水溶液以及氯金酸溶液中，柠檬酸三钠溶液浓度为4mmol/L，双氧水溶液浓度为320 μ mol/L，氯金酸溶液浓度为2mmol/L，三种溶液的体积比为1:1:1 ;步骤(4)中所述对比实验中生成的显色底物金纳米颗粒溶液是:以浓度为4mmol/L的梓檬酸三钠溶液、浓度为320 μ mol/L的双氧水溶液和浓度为2mmol/L的氯金酸溶液所制备的金纳米颗粒溶液，三种溶液的体积比为1:1:1。
[0012]具体的，对冰毒含量的检测限值为2.3X 10 20mg/mL ;对前列腺癌抗原的检测限值为 I X 10 18mg/mL。
[0013]本发明的目的之二在于提供上述基于乙二胺四乙酸模拟酶试剂盒的制备方法的应用，即应用于人体血清、唾液、尿液或空气中的冰毒含量检测或者人体血清中的前列腺癌抗原含量检测。
[0014]本发明利用乙二胺四乙酸催化并分解双氧水的特性，把乙二胺四乙酸与金纳米颗粒这两种纳米材料有机的结合起来，利用乙二胺四乙酸取代酶联免疫吸附反应中的生物酶，再加上抗体与抗原的特异性结合，形成了“三明治”的夹层结构，成功制备出检测冰毒以及前列腺癌抗原的模拟酶的超高灵敏度试剂盒，且现象明显，操作简便，灵敏度超高，能有效准确的测定出人血清中、唾液、尿液中冰毒的含量以及血清中前列腺癌抗原的浓度。
[0015]通过本发明的方法处理，能得到不同颜色的金纳米颗粒溶液，这种纳米颗粒的颜色变化可根据双氧水的浓度进行调控，通过颜色以及吸光度值的变化达到了对冰毒以及前列腺癌抗原的超痕量检测，并且具有非常高的灵敏度，与现有技术相比，本发明方法简单，成本低，灵敏度高，能够实现快速准确的检测，并且对于其它生物大分子以及疾病的检测都具有十分重要的参比价值，具有很广阔的应用前景。
【附图说明】
[0016]图1为本发明实施例1中对冰毒样品稀释液的检测时的显色底物以及对比实验的显色底物在550nm处的吸光度值柱状图。图1中，每组柱状中右边柱状图表示对比实验的显色底物在550nm处的吸光度值大小。
[0017]图2为本发明实施例1中对冰毒样品稀释液的检测时的显色底物以及对比实验显色底物的颜色变化对照图片。图2中，上一排的溶液为对比实验显色底物。
[0018]图3为本发明实施例1中对冰毒样品稀释液的检测时的显色底物以及对比实验的显色底物在550nm处吸光度值变化的标准曲线图。
[0019]图4为本发明实施例2中将本发明试剂盒应用于6个不同人血清中冰毒含量检测时显色底物以及对比实验显色底物的颜色变化对照图片。图4中，上一排的溶液为对比实验显色底物。
[0020]图5为本发明实施例3中将本发明试剂盒应用于空气中冰毒含量检测时显色底物以及对比实验显色底物的颜色变化对照图片。图5中，上一排的溶液为对比实验显色底物。下排为空气中分散的冰毒所导致颜色变化。
[0021]图6为本发明实施例4中对前列腺癌抗原标准溶液的检测时的显色底物以及对比实验显色底物的颜色变化对照图片。图6中，上一排的溶液为对比实验显色底物。
[0022]图7为本发明实施例4中对前列腺癌抗原标准溶液的检测时的显色底物以及对比实验的显色底物在550nm处吸光度值变化的标准曲线图。
[0023]图8为本发明实施例5中将基于乙二胺四乙酸模拟酶的超高灵敏度试剂盒应用于5个不同人血清中前列腺癌抗原含量检测时显色底物以及对比实验显色底物的颜色变化对照图片。上一排的溶液为对比实验显色底物。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述。
[0025]实施例1:
[0026]参见图1、图2、图3，用于冰毒的检测。首先在96孔聚苯乙烯微孔板中加入冰毒抗体，4°C反应过夜后，用PBS缓冲溶液冲洗三次，加入BSA溶液反应I小时后，用PBS缓冲溶液冲洗三次，再加入不同浓度的冰毒样品稀释液(1X1012?2X10 18mg/mL)反应I小时，再次PBS缓冲溶液冲洗三次之后，加入已经连接上乙二胺四乙酸的冰毒抗体反应I小时，同样用PBS缓冲溶液冲洗三次，加入100 μ L浓度为4mM的柠檬酸三钠溶液和100 μ L浓度为320 μ mol/L的双氧水溶液反应40分钟，再加入100 μ L浓度为2mmol/L的氯金酸溶液。30分钟后，其酶标仪读数以及颜色变化对照图如图1、图2所示。图2中上排没加冰毒，当冰毒的浓度为O时，微孔板中金纳米颗粒的颜色为红色，此时在微孔板中并没有形成三明治的夹心结构，即没有连接上有催化作用的乙二胺四乙酸对双氧水进行分解，生成了红色溶液，作为参比对照。而图2下排是加了不同浓度的冰毒，其冰毒浓度从左至右依次为:2.3X10 21、2.3X 10 20、2.3X10 19、2.3X10 1S、2.3X10 17、2.3X10 16mg/mL。在不同浓度的冰毒的条件下，由于冰毒抗体与抗原的特异性结合作用，在微孔板中形成了夹心结构，在生成金纳米颗粒时，乙二胺四乙酸对双氧水溶液起到了分解的作