一种肝微粒体中羟基安非他酮浓度的uplc/ms/ms检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物的检测方法，具体涉及肝微粒体中羟基安非他酮浓度的UPLC/MS/ MS检测方法。
【背景技术】
[0002] CYP450酶是参与药物代谢的主要酶系，包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、 CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4等与药物代谢密切相关的同工酶。研究表明，大部分药物-药 物相互作用的发生与CYP450酶活性的诱导和抑制相关，其中主要由酶抑制引起。利用体外 方法进行药物代谢研究，可有效缩短新药研发周期，直接观察酶对底物的选择性代谢和底 物对酶的诱导和抑制，确定药物代谢途径，预测体内潜在的药物相互作用。目前，常用的体 外方法为探针药物法，该方法通过建立肝微粒体温孵体系，从而建立了药物代谢研究模型。
[0003] 羟基安非他酮（2S，3S-Hydroxybupropione)是CYP2B6探针底物安非他酮的代谢 产物。因此，目前亟需一种肝微粒体中羟基安非他酮浓度的检测方法。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种肝微粒体中羟基安非他酮浓度的UPLC/MS/MS 检测方法，包括以下步骤：
[0005] (1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的羟基安非他酮对照品，制备 标准曲线样品；
[0006] 2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；
[0007] 色谱条件如下：
[0008] 色谱柱：C18色谱柱；
[0009] 流动相：流动相A为0. 1 %甲酸水溶液，流动相B为0. 1 %甲酸乙腈溶液；
[0010] 梯度洗脱条件为：
[0011]
[0012] 运行时间为3分钟；
[0013] 质谱条件如下：
[0014] 离子源：电喷雾离子源；
[0015] 检测方式：正离子多反应监测；
[0016] 根据检测结果得到羟基安非他酮的标准曲线；
[0017] ⑶按照步骤⑴相同的方法，将底物安非他酮与肝微粒体温孵体系共温孵，制备 得到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤（2)相同 的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的羟基安非他酮浓度。
[0018] 其中，温孵的时间为20min。
[0019] 优选地，所述内标物为邻甲苯海拉明。
[0020] 优选地，所述色谱条件中，流动相的流速为0. 3mL/min。
[0021] 优选地，所述色谱条件中，柱温为40°C。
[0022] 优选地，所述色谱条件中，色谱柱为ACQUITYUPLC-BH1C18色谱柱，规格为 1. 7μm, 2. 1X50mm〇
[0023] 优选地，所述色谱条件中，进样量为0. 2μL。
[0024] 优选地，所述正离子多反应监测中，羟基安非他酮的母离子-子离子对为m/ z256. 08 -m/z238. 02,锥孔电压为15V，碰撞电压为14V;邻甲苯海拉明的母离子-子离子 对为m/z270. 10 -m/z181.08，锥孔电压为15￥，碰撞电压为12￥。
[0025] 优选地，所述质谱条件中，毛细管电压为3000V，离子源温度为150°C，去溶剂化温 度为350°C，去溶剂化气体流速为650L/h。
[0026] 优选地，所述质谱条件中，锥孔气体流速为150L/h，雾化气压力为6.Obar。
[0027] 优选地，所述步骤（1)的标准曲线样品制备方法为：将羟基安非他酮加入肝微粒 体温孵体系，所述肝微粒体温孵体系包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶、MgCl2、PBS和NADP，再加入含内标的乙腈溶液，混匀，离心，取上清液，即得标准曲线样 品。
[0028] 其中，标准曲线样品的制备可以按照下述方法进行：分别将系列浓度的对照标准 品羟基安非他酮加入肝微粒体温孵体系（包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸 脱氢酶、MgCl2、PBS和NADP)，再加入含内标的乙腈溶液，充分混匀3min，于4°C，13000rpm离 心lOmin，取上清液即得。肝微粒可以采用人、大鼠、小鼠、犬、恒河猴、食蟹猴的肝微粒。
[0029] 本发明专一地检测对肝微粒体中的羟基安非他酮浓度，色谱分析时间仅需3分 钟，进样量仅需0.2μL，分析时间短、灵敏度高、进样量小。同时，本发明检测方法专属性强、 基质效应小、线性范围广、批内和批间准确度与精密度高、进样盘稳定性高、工作液稳定性 高，符合方法学验证要求，适用于肝微粒体温孵样本中羟基安非他酮浓度的测定，具有广泛 的应用前景。
[0030] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0031] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0032] 所用肝微粒体为人肝微粒体。
[0033] 图1为母离子和锥孔电压的优选结果。
[0034] 图2的质谱条件为：离子对：m/z256. 08 -m/z238. 02,锥孔电压15V，碰撞电压 14V，也即本发明的质谱条件。
[0035] 图3的质谱条件为：离子对：m/z256. 08 -m/z131. 09 ;锥孔电压15V;碰撞电压 26V〇
[0036] 图4的质谱条件为：离子对：m/z256. 08 -m/z131. 09 ;锥孔电压15V;碰撞电压 26V〇
[0037] 图5为空白样本的色谱图。
[0038] 图6为LL0Q(定量下限）样本色谱图。
[0039] 图7为待测样本色谱图。
[0040] 图8为羟基安非他酮典型标准曲线。
【具体实施方式】
[0041] 实施例1
[0042] 所述试剂和仪器均来自市售的商品。
[0043] 1、对照品及内标
[0044](2S，3S)-羟基安非他酮盐酸盐（0Η-ΒΡ):分子量292. 20,纯度99 %，批号 041M4728V(sigma-aldrich)；
[0045] 柠檬酸邻甲苯海拉明（IS，正离子内标）：纯度99 %，批号 048F0510V(sigma-aldrich)。
[0046] 2、主要仪器
[0047]
[0048] 3、试验所用主要软件
[0049] UNIFI1. 6. 1 :UPLC/MS/MS数据采集及浓度计算。
[0050] 4、检测方法
[0051] (1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的羟基安非他酮对照品，制备 标准曲线样品；
[0052] (2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；检测条件如下：
[0053] 色谱柱：ACQUITYUPLC-BEHC18, 1. 7μm, 2. 1X50mm(Waters公司）
[0054] 流动相：A:0. 1 %甲酸水溶液
[0055] B:0· 1 %甲酸乙腈溶液
[0056] 流速： 0· 3mL/min
[0057] 柱温： 40°C
[0058] 进样盘温度：4°C
[0059] 离子源： 电喷雾离子化源（ESI);
[0060] 内标（IS) :50ng/mL邻甲苯海拉明乙腈溶液
[0061] 梯度洗脱：
[0062]
[0063] 进样量： 0· 2μL
[0064] 运行时间： 3min
[0065] 保留时间：t_HBP)~1. 42min;t[；(15)~1. 57min
[0066] 毛细管电压（Capillaryvoltage) : 3.OOkV
[0067] 离子源温度（SourceTemperature) : 150°C
[0068] 去溶剂化温度（DesolvationTemperature) : 350°C
[0069] 去溶剂化气体流速（Desolvationgasflow) : 650L/h
[0070] 锥孔气体流速（Conegasflow) : 150L/h
[0071] 雾化气压力（Nebulizergaspressure) : 6.Obar
[0072] 检测方式：正离子多反应监测（MRM)
[0073] 离子对：m/z256. 08 -m/z238. 02 (0Η-ΒΡ)，m/z270. 10 -m/z181. 08 (IS)
[0074] 锥孔电压（Conevoltage) :15V(0Η-ΒΡ)和 15V(IS)
[0075] 碰撞电压（Collisionenergy) :14V(0Η-ΒΡ)和 12V(IS)
[0076] 根据检测结果得到羟基安非他酮的标准曲线；
[0077] ⑶按照步骤⑴相同的方法，将底物安非他酮与肝微粒体温孵体系共温孵 20min，制备得到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步 骤⑵相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的羟基安非他酮浓度。
[0078] 在确定本发明的检测方法各项工艺参数中，发明人对本发明方法的色谱条件和质 谱条件进行了筛选，结果如图1-4所示。
[0079] 图1为母离子和锥孔电压的优选结果。
[0080] 三种离子对的检测结果如下：
[0081] (1)图2的质谱条件为：
[0082] 离子对：m/z256. 08 -m/z238. 02,锥孔电压15V，碰撞电压14V，也即本发明的质 谱条件。
[0083] 结果显示强度为74734253。
[0084] (2)图3的质谱条件为：
[0085] 离子对：m/z256. 08 -m/z131. 0