浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01 mol/L 的 PBST, pH 值范围 7.0-7.5 之间。
[0020]基于上述制备的试剂，本发明用于检测苯达松的酶联免疫试剂盒包括如下材料:
(1)96孔酶标板XI块；
(2)标准液X 6 瓶:(lmL/瓶)0 ng/mL、0.5 ng/mL、1.5 ng/mL、4.5 ng/mL、13.5 ng/mL、40.5ng/mL ；
(3)抗体工作液7 mL ；
(4)酶标二抗工作液7 mL ；
(5)底物液A7 mL ；
(6)底物液Β7 mL ；
(7)终止液7 mL ；
(8)10X浓缩稀释液 40 mL;
(9)10 X浓缩洗涤液 40 mL。
[0021]本发明的试剂盒用于检测样品中苯达松残留量时，通过以下步骤实施:样品预处理、用本发明试剂盒进行检测、分析结果。
[0022](1)样品预处理
称量20 g研磨过滤后的样品加入40 mL乙腈-甲醇溶液，在密封的容器里混合，震荡润旋1 min ;室温离心4000r/min以上，lOmin ;耳又lml上清液;以1:9的比例稀释上清液,混匀待测。
[0023](2)用本发明试剂盒检测待测样品中苯达松残留量
取包被有苯达松抗原的酶标板，加标准品/样本50μ?7孔到对应的微孔中；加入酶标二抗工作液，50μ?7孔，然后加入苯达松抗体工作液，50μ?7孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25°C避光环境中反应30 min ;小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ L/孔，充分洗涤4飞次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；加入底物液A 50 μ?ν孔，底物液B 50 μ?ν孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15 min;加入终止液50 μ?7孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630 nm检测，测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据)；对比待测样品与标准品的吸光度值大小，定量分析待测样品中苯达松残留量。
[0024](3)分析结果
百分吸光度值的计算，标准品或样本的百分吸光度值等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值(%) = B/B0X100%
其中B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值，B。一0 ppb标准溶液的平均吸光度值。
[0025]以苯达松的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，求出直线方程。将样本的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中苯达松的实际浓度。
【主权项】
1.检测苯达松的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括苯达松酶标板、苯达松标准品、苯达松抗体工作液、苯达松酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩样品稀释液和浓缩洗涤液。2.检测苯达松的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括以下步骤:苯达松酶标板的制备、苯达松标准品的制作、苯达松单克隆抗体及其工作液的制备、苯达松酶标二抗工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩样品稀释液的制备。3.根据权利要求2所述的检测苯达松的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于:所述的苯达松包被抗原是将苯达松半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将苯达松抗原稀释成1:20000比例，100 μ L/孔，37°C放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μ L /孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150 μ L /孔，37°C放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4°C下保存。4.根据权利要求2所述的检测苯达松的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于:所述的苯达松标准品浓度分别为 0 ng/mL、0.5 ng/mL、1.5 ng/mL、4.5 ng/mL、13.5 ng/mL、40.5ng/mL。5.根据权利要求2所述的检测苯达松的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于:所述的苯达松抗体工作液是采用苯达松人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1:50000比例制备。6.根据权利要求2所述的检测苯达松的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于:所述的苯达松酶标二抗工作液用酶标二抗稀释液稀释成1:5000比例；所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含 0.5% 吐温-20，0.01 mol/L 的 PBST, pH 值范围 7.0-7.5 之间。7.权利要求2所述的检测苯达松的ELISA试剂盒的制备及检测方法，基于抗原抗体进行间接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤: (1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中； (2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20?25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀； (3)取包被有苯达松抗原的酶标板，加标准品/样本50μ L /孔到对应的微孔中； (4)加入苯达松酶标二抗工作液，50μ L /孔，然后加入苯达松抗体工作液，50 μ L /孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25°C避光环境中反应30 min ； (5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μ L /孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)； (6)加入底物液A50 μ L /孔,底物液Β 50 μ L /孔,轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25 °C避光环境中反应15min ； (7)加入终止液50μ L /孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据)； (8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中苯达松的含量。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品: (1)配制乙腈-水溶液(体积比为1:1); (2)研磨代表性样品(使50%的样品可以通过一个20目的滤网)；(3)称量20g研磨过滤后的样品加入40 mL乙腈-水溶液，样品稀释比为1:2(w/v)； (4)在密封的容器里混合，震荡涡旋1min ；(5)室温离心4000r/min以上，lOmin;取1ml上清液到离心管中，50 ~60 °〇水浴氮气吹干； (6)加入1mL稀释后的样品稀释液充分振荡混合30 s，混匀待测。
【专利摘要】一种快速检测农作物中苯达松含量的试剂盒。本发明为检测苯达松的ELISA试剂盒的制备及其检测方法，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。苯达松检测试剂盒的原理是固相间接竞争酶联免疫反应，把提取的样品、酶标二抗工作液和抗体工作液加入对应的酶标孔中，孵育一段时间后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下孔里将会出现蓝色，加入终止液，颜色由蓝色变为黄色。显色的深浅与标准品或样品中苯达松的含量成反比例关系。该方法可直接用于检测农作物（大豆、水稻、小麦、大麦等）中的苯达松含量。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/535
【公开号】CN105319365
【申请号】CN201410319595
【发明人】杜道林, 戴蔚蔚, 薛永来
【申请人】江苏维赛科技生物发展有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年7月7日