一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法

一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品安全检测领域，具体涉及一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱 检测食品中副溶血性弧菌的方法。
【背景技术】
[0002] 副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus)系弧菌科弧菌属，革兰氏染色阴性，兼 性厌氧菌，多为形态杆菌或稍弯曲弧菌。它是一种海洋嗜盐细菌，主要来自海产品，如墨鱼、 海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品。人们在食用了生的或是未煮熟的感染 了副溶血性弧菌的海产品后，可能出现腹泻、头痛、呕吐、恶心、腹部绞痛等胃肠炎反应。在 美国、日本、东南亚等国家，发生副溶血性弧菌引起的食物中毒事件较多。在我国由副溶血 性弧菌引起的食物中毒多发生在沿海地区，华东沿海水产品携带该菌率可高达60. 4%。由 副溶血性弧菌所引发的食物中毒，在细菌性食物中毒中占有重要地位，从而被公认为是一 种世界范围内的重要的食源性病原菌。因此建立准确、灵敏、快速的副溶血性弧菌检测技术 对于食品安全具有重要意义。
[0003] 目前已知的副溶血性弧菌检测方法中，传统的微生物检验需要经历增菌培养、分 离培养、生化试验、血清学试验和神奈川试验，虽然对实验设备要求不高，但操作复杂，既耗 时又不灵敏，不能达到快速检测的要求；新发展起来的实时荧光定量PCR技术，虽然能缩短 检验时间，但前期需要提取细菌总DNA，且灵敏度仍然不高；免疫学方法如酶联免疫吸附分 析法、酶联荧光分析法、时间分辨荧光免疫分析（TrFIA)、化学发光免疫分析法等，具有特异 性强、灵敏度高、易于观察等优点，但制备抗体的时间比较长，成本高，且不稳定。近些年来， 由于寡核苷酸适配体（aptamer)较之抗体有诸多优点：成本低，稳定性好，易于修饰等等， 因此被作为抗体分子的前景性替代分子，受到很多领域的关注。再加上其在标记技术上和 稳定性方面的优势，近10多年来，适配体被当做抗体的替代性分子广泛地应用于生命科学 等各个领域的研究工作中，诸如对疾病的诊断与治疗等。
[0004] 拉曼散射由于蕴含分子振转能级的丰富信息，已成为物质分析的有力工具，特别 是表面增强拉曼散射（SERS)技术的出现，使其检测灵敏度获得了极大的提高。近年来， SERS光谱以其高分辨率、高灵敏度、溶液干扰性小、稳定性好等特点被广泛应用于物理、材 料、表面科学、环境化学、生物化学、有机化学甚至生物学的分析和研究。

【发明内容】

[0005] 本发明目的在于提供一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血 性弧菌的方法。本发明采用金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料作为基底，将巯基化修饰的 副溶血性弧菌适配体加入到上述制备所得的金包覆二氧化硅的核壳型纳米材料中孵育，从 而将副溶血性弧菌适配体固定在基底上。将被测物与修饰有副溶血性弧菌适配体的金包覆 二氧化硅的核壳型纳米材料混合，加入具有拉曼信号Cy3修饰的副溶血性弧菌适配体进行 孵育，然后进行拉曼光谱扫描。基于适配体与沙门氏菌的特异性结合，实现对食品中副溶血 性弧菌的检测。具体检测原理如图1所示。本方法灵敏度高、特异性强、操作方便，在食品 安全检测领域将具有广阔的应用前景。
[0006] 实现本发明的具体方法： 一种基于适配体识别表面增强拉曼光谱检测食品中副溶血性弧菌的方法，包括以下步 骤： 1) 拉曼增强基底的合成：采用反相微乳法首先制备得到二氧化硅纳米颗粒并进行表 面氨基化修饰，同时利用硼氢化钠还原氯金酸的方法制备得到纳米金种子，然后将一定量 上述制备得到的二氧化娃纳米颗粒与金种子进行反应，合成金包覆二氧化娃的核壳型纳米 材料基底。 2) 适配体的固定化：将一定量疏基化修饰的适配体加入到上述制备所得的金包覆二 氧化硅的核壳型纳米材料中孵育，从而将适配体固定在基底上。 3) 副溶血性弧菌的检测：将待测液与修饰有适配体的金包覆二氧化硅的核壳型纳米 材料混合，加入一定量的具有拉曼信号Cy3修饰的适配体，然后进行拉曼光谱检测。
[0007] 具体的：步骤1)所述拉曼增强基底的合成具体操作为，取lmL正硅酸四乙酯，加 入到445mL乙醇，5mL水，2mL浓氨水中，40°C加热搅拌混匀；然后加入60yL 3-氨丙基三 乙氧基硅烷，70°C恒温搅拌反应3h，制备得到氨基化二氧化娃纳米颗粒。接着取3mL 1 %的 HAuC14溶液，加入200mL 4°C预冷的纯水，lmL 0. 2mol/L的K 2C03,9mL新鲜配制的0. 5mg/mL NaBH4溶液，持续搅拌5min，制备得到金种子。取223 μ L氨基化二氧化硅纳米颗粒逐滴加 入到180mL的金种子溶液中，剧烈搅拌反应2h，得到二氧化硅-金种子。同时将50mg K2C03溶于200mL的PBS缓冲液中，加入3mL 1 %的HAuC14溶液搅拌反应20min。取0. 5mL上述 制备得到的二氧化硅-金种子加入其中，并加入100 μ L H202 (200 μ mol/L)，反应3min，最后 制备得到二氧化娃-金壳，即金包覆二氧化娃的核壳型纳米颗粒。
[0008] 步骤2)所述的适配体固定化操作为，取金包覆二氧化娃核壳型纳米颗粒lmL，加 入50 μ L适配体（10 μ mol/L)，室温孵育16小时。
[0009] 步骤3)所述的检测，不同浓度的副溶血性弧菌样品与适配体修饰的金包覆二氧 化硅核壳型纳米材料于37°C孵育45min，然后加入Cy3修饰的适配体继续孵育45min。之后 于3000r/min离心5min，并清洗两次。样品重悬与缓冲液中上拉曼光谱仪检测。
[0010] 本发明的优点在于： 1. 本发明方法以适配体作为识别元件，相比于免疫分析法中使用抗体作为识别元件， 适配体稳定性好，制备成本低，易于标记且标记后不影响其活性，同时对目标菌体具有高度 亲和力和高度选择性，在很大程度上提高了检测的准确性。 2. 本发明以金包覆二氧化硅的核壳型纳米复合材料作为拉曼增强基底，具有贵金属的 光谱特性，且试样制备快速，成本低等优点。 3. 本发明中提供的检测方法与现有副溶血性弧菌的检测方法相比，具有灵敏度高的特 点，其检测限可达到15cfu/mL。
【附图说明】
[0011] 图1基于适配体识别表面增强拉曼检测副溶血性弧菌的示意图 图2金包覆二氧化硅核壳型纳米材料的透射电子显微镜图（TEM) 图3不同浓度的副溶血性弧菌引起的表面增强拉曼光谱图（A)，相对拉曼强度与副溶 血性弧菌浓度的线性关系图（B)
【具体实施方式】
[0012] 为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合【具体实施方式】对本发明所述的 技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0013] 实施例1 1) 拉曼增强基底的合成 首先制备氨基化二氧化硅纳米颗粒：取45mL乙醇，5mL水，2mL浓氨水于100mL圆底烧 瓶中，40°C加热搅拌混匀。接着逐滴加入lmL正硅酸四乙酯继续搅拌4h，制备得到二氧化硅 纳米颗粒。加入60 μ L 3-氨丙基三乙氧基硅烷，70°C恒温搅拌反应3h。反应结束后以转速 10,000rpm离心20min。弃去上清，加入适量无水乙醇，超声分散洗涤。即制备得到氨基化 二氧化娃纳米颗粒。 接着制备金种子：首先向200mL 4°C预冷的纯水中加入3mL 1%的HAuC14溶液并搅拌， 待分散均匀后加入lmL 0. 2mol/L的1(20)3水溶液，9mL新鲜配制的0. 5mg/mL NaBH4溶液，溶 液由亮黄色变为棕褐色再变为酒红色。继续搅拌5min，得到直径为2nm-5nm的金种子，将