5M、pH值为6.0的MES缓冲液将碱性憐酸酶标记的鼠抗人I姐二抗稀释到0.1-2.0ug/ml。
[002引巧)制备校准品 取I姐蛋白，用0.1M、pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液配制成0、0.35、0.7、3.5、17.5、50、lOOIU/ml的校准点。
[00巧](6)制备质控品 取I巧蛋白，用0.lM、pH值为7.4的化is-HCl缓冲液配制成0.7、17.5lU/ml的质控品。
[0030] (7)试剂盒组装 将生物素标记的猫毛过敏原溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液、碱性憐酸酶 标记的鼠抗人I巧二抗溶液、校准品和质控品组装成试剂盒。
[0031]本发明的试剂盒中未详细提及的试剂组分(例如清洗液、一些必要的缓冲液等）、 试剂盒的外包装W及各试剂组分的独立包装容器等均可W按照所属领域的常规操作进行， 符合相关行业规定即可。
[0032] 实施例 提供了一种纳米磁微粒全自动化学发光法定量检测血清猫毛过敏原特异性I姐抗体试 剂盒的检测方法，检测在全自动化学发光仪Lumiray系列化umiray1200、Lumiray1220、 Lumiray1260、Lumiray1280等)上进行，具体仪器操作步骤如下： (1)将试剂盒放入全自动化学发光分析/测定仪试剂仓相应位置，试剂盒信息通过条形 码扫描仪输入仪器系统，也可通过仪器配套软件设定。
[0033] (2)将校准品置于仪器样本仓。通过条形码扫描仪识别校准品信息，并在仪器系统 中分配校准品位置。 (3)将质控物/待测样本置于仪器样本仓，通过仪器配套软件编辑相应检测信息。
[0034] (4)启动运行程序，所有校准品/质控物/待检样本处理步骤将自动执行。
[0035]本发明提供的一种纳米磁微粒全自动化学发光定量检测血清猫毛过敏原特异性 I巧抗体试剂盒还可W在半自动化学发光仪上实现，具体的样本检测步骤如下： (1)在检测管中依次加入40ul待测血清或I姐校准品、50ul生物素标记的猫毛过敏原、50ul链霉亲和素标记的纳米磁微粒，混匀后，在37°C下共解育15分钟，样本中猫毛特异性 I巧抗体被捕获，并固着在纳米磁微粒表面。
[0036] (2)外加磁场作用下，磁微粒沉降下来，去除上清，加入500ul清洗液，去除磁场后， 震荡使磁微粒重悬;重复此清洗步骤3次W除去未结合的生物素标记的鼠抗人I巧抗体。
[0037] (3)加入lOOul碱性憐酸酶标记的鼠抗人I巧二抗溶液，混匀，37°C下解育15分钟。
[0038] (4)外加磁场作用下，磁微粒沉降下来，去除上清，加入500ul清洗液，去除磁场后， 震荡使磁微粒重悬;重复此清洗步骤3次W除去未结合的酶标抗体及其它杂质。
[0039]巧)加入150ul酶促化学发光底物，去除磁场，充分混匀后，37° C解育5分钟，测定发 光值。
[0040] (6)数据的处理:通过校准品的浓度值和检测到的发光值，通过四参数非线性拟合 获得标准曲线，将样本的发光值代入图1所示的标准曲线获得相应的浓度值。
[0041]本发明的工作原理:待测血清样本与生物素标记的猫毛过敏原、链霉亲和素标记 的纳米磁微粒共解育，待测血清样本中猫毛特异性I巧抗体与生物素标记的猫毛过敏原特 异性结合，同时借助生物素-链霉亲和素放大体系，血清样本中猫毛过敏原特异性I姐结合 到固相载体纳米磁微粒上；外加磁场作用下，磁分离洗涂去除多余的生物素标记的猫毛过 敏源;加入碱性憐酸酶标记的鼠抗人I巧二抗，形成生物素标记的猫毛过敏原-猫毛特异性 I巧-抗I巧二抗的免疫复合物结构;外加磁场作用下，多次磁分离洗涂去除未结合的酶标抗 体及其它杂质；加入酶促化学发光底物，测定发光强度;使用已知浓度的校准品标准曲线， 根据发光强度对照标准曲线，计算得出待测样本中猫毛特异性I巧抗体的含量； 实施例四： 所述试剂盒的性能评估： 1、猫毛过敏原特异性I巧抗体(E1)检测试剂盒(纳米磁微粒全自动化学发光法)分析性 能和稳定性，具体见下表。
[0042] 2、请参阅图2,猫毛过敏原特异性I姐抗体(El)检测试剂盒(纳米磁微粒全自动化 学发光法)与进口试剂的性能对比。
[0043] 3、猫毛过敏原特异性I巧抗体(E1)检测试剂盒(纳米磁微粒全自动化学发光法)临 床参考值范围，具体见下表，W正常人样本检测值的双侧95百分位数作为参考值。
[0044]本发明的有益效果是: 一、本发明W碱性憐酸酶(AP)为标记酶，通过化学反应标记抗体，并使用凝胶层析分离 未反应的酶、抗体或抗原，提高反应的灵敏度； 二、W免疫磁微粒为固相，W链霉亲和素偶联磁性微球，作为通用的分离试剂，不仅使 免疫反应更容易混匀和分离，而且大大提高了反应速度； Ξ、W新型化学发光底物AMPPD为底物，该底物是辉光型底物，而且快速达到平台期，有 利于信号的检测，提高了最终试剂盒的灵敏度和特异性性能;并进一步优化了化学发光增 强体系，保证了终产品的信号灵敏度高和稳定性好、变异小； 四、采用AMPPD发光底物的优点在于灵敏度高和平台稳定期长。
[0045]W上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发 明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领 域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
【主权项】
1. 一种检测猫毛过敏原特异性IgE抗体的试剂盒，其特征在于，包括的试剂有:校准品、 质控品、生物素标记的猫毛过敏原溶液、碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗溶液、链霉亲和 素标记的纳米磁微粒悬浮液。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的猫毛过敏原溶液的浓 度为0.1~1.0ug/ml，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0.1~1.0mg/ml， 所述碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗溶液的浓度为0.1~2.0ug/ml。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准品的浓度为：0IU/ml、0.35 IU/ml、0.7IU/ml、3.5IU/ml、17.5IU/ml、50IU/ml、100IU/ml，所述校准品是IgE蛋白与 0.1Μ、ρΗ值为7.4的Tris-HCl缓冲液配制得到的；所述质控品的浓度为:0.7IU/ml、17.5IU/ml，所述质控品是IgE蛋白与0.1Μ、ρΗ值为7.4的Tris-HCl缓冲液配制得到的。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述猫毛过敏原为能与人体内猫毛特异 性IgE蛋白结合的抗原，所述生物素标记的猫毛过敏原的制备过程为:将猫毛过敏原按1:20 摩尔比加入到溶于二甲基甲酰胺的生物素中，再用〇.1Μ、ρΗ值为7.4的磷酸盐缓冲液透析得 到。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标记的鼠抗人IgE二抗为能与人体 内IgE蛋白特异结合的抗体，所述碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗的制备过程为:将浓度 为1.0-5.Omg/mL的碱性磷酸酶溶液与鼠抗人IgE二抗按摩尔比为2-10:1进行混合后并纯 化，得到碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗，所述纯化是用pH为8-9的碳酸氢盐缓冲液平衡 并洗脱，再紫外检测和记录纯化图谱，再用〇.〇5M、pH值为6.0的MES缓冲液对碱性磷酸酶标 记的鼠抗人IgE抗体稀释。6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮 液的制备过程为:将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀，再用〇. 〇1Μ、ρΗ值为7.4 的磷酸盐缓冲液重悬，混匀磁分离沉淀，并重复清洗，清洗后的纳米磁微粒分散于0.01M、pH 值为7.4的磷酸盐缓冲液。7. 提供一种纳米磁微粒化学发光法定量检测血清猫毛过敏原特异性IgE抗体的方法， 其特征在于，包括步骤为： (1) 将磁微粒试剂、生物素标记的猫毛过敏原和待检样本混匀并反应，反应后置于磁场 中静置并去上清，得到第一溶液； (2)向所述第一溶液中加入碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗混匀并反应，反应后置于 磁场中静置并去上清，得到第二溶液； (3) 向所述第二溶液中加入发光底物并反应，测发光强度； (4)利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线，根据步骤(3)得到的发光强度对照 所述标准曲线，计算得出待测血清样本中猫毛特异性IgE的含量。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1)中所述反应的条件为37°C下反应 15分钟，所述静置的时间为3分钟;步骤(1)中还包括对所述第一溶液用清洗液进行清洗，置 于磁场中静置并去上清，清洗重复2次;步骤(2)中所述反应的条件为37°C下反应15分钟，所 述静置的时间为3分钟；步骤(2)中还包括对所述第二溶液用清洗液进行清洗，置于磁场中 静置并去上清，清洗重复2次;步骤(3)中所述反应的条件为37°C下反应5分钟，在化学发光 分析/测定仪中测定发光强度。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法在全自动化学发光仪Lumiray系 列上进行，所述Lumiray系列为Lumiray1200、Lumiray1220、Lumiray1260或Lumiray 1280〇10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，包括的步骤为： (1) 将所述试剂盒放入全自动化学发光仪的试剂仓里并进行识别； (2) 将校准品置于所述全自动化学发光仪的仪器样本仓，识别校准品信息，分配校准品 位置； (3) 将质控物或待测样本置于仪器样本仓，编辑检测信息； (4) 启动运行程序，所有校准品/质控物/待测样本自动进行处理得到结果。
【专利摘要】本发明公开了一种检测猫毛过敏原特异性IgE抗体的试剂盒及方法，试剂盒包括校准品、质控品、生物素标记的猫毛过敏原溶液、碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgE二抗溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液，利用所述试剂盒对猫毛过敏原特异性IgE抗体进行检测。通过上述方式，本发明试剂盒中各试剂组分稳定性良好，有效期可至一年以上，检测灵敏度高、特异性能好、变异小。经过大量实验的工艺优化，得到完善统一工艺，并严格按照标准生产操作规程和质量控制规程进行生产。用户仅需按照操作说明进行规范操作，就可得到可靠的结果。在临床研究中与国外进口试剂的符合相关性高达90％以上，且费用仅为其1/2。
【IPC分类】G01N21/76
【公开号】CN105445257
【申请号】CN201510788502
【发明人】罗薇, 钱林, 韩霜, 何晓静, 丁俊荣, 宋孟杰, 李庆春
【申请人】苏州浩欧博生物医药有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年11月17日