1/4头份剂量，对照组注射206佐剂。
[0036] 3.采血分离血清:小鼠于免疫后第28天眼窝采血，4°C，5000r/min离心10min，分离 血清。
[0037] 4.血清抗体阻断ELISA检测将小鼠血清用PBST稀释，从1:4开始，2倍系列稀释至1: 512，于反应板的每孔加量50yL;然后每孔再加入50yL稀释至工作浓度的0型抗原，混匀4°C 反应过夜；取以上50yL抗原抗体反应物加入至包被兔抗口蹄疫抗体（中国农科院兰州兽医 研究所)的另一块96孔反应板中，37°C作用1小时，弃液，PBST洗涤5遍，加入豚鼠抗血清工作 液，37°C作用30min，弃液，PBST洗涤5遍，加入酶标二抗，37°C作用30min，弃液，PBST洗涤5 遍，然后加入0PD底物反应液，37°C作用5~lOmin，加入终止液，酶标读数测定结果0D (492nm)〇
[0038] 5.结果计算:根据阻断ELISA计算方法，确定阳性临界值，高于临界值为阴性，小于 等于临界值为阳性，如某样品稀释至1:256孔的值低于临界值，1:512孔的值高于临界值，则 确定阻断ELISA值为1:256。
[0039] 6.判定:首先将阻断ELISA值换算成以-l〇g1QX的抗体效价，然后计算同组5只老鼠 抗体效价的平均值及SD值，并计算变异系数(C.V) = SD值/平均值，当1头份剂量组平均值大 于2.0，C.V低于12%则判为合格。
[0040] 按此操作测定了4批经本动物免疫攻毒检验合格的口蹄疫0型灭活疫苗，结果均判 为合格。
[0041 ] 表1 4批口蹄疫0型灭活疫苗免疫小鼠血清抗体结果(-l〇g1QX+SD)
[0042]
[0043] 实施例二
[0044] 口蹄疫0型Asial型二价灭活疫苗;的小鼠免疫血清学检测
[0045] 1.实验动物:选取8~10周龄SPF级Balb/c系小鼠，分为4组，其中3个实验组，1组对 照组，每组5只小鼠。
[0046] 2.疫苗及疫苗免疫：口蹄疫二价灭活疫苗(0型+AsiaI型)选取3组动物为实验组， 分别免疫1头份剂量，1/2头份剂量，1/4头份剂量，对照组注射206佐剂。
[0047] 3.采血分离血清:小鼠于免疫后第28天眼窝采血，4°C，5000r/min离心10min，分离 血清。
[0048] 4.血清抗体阻断ELISA检测：将小鼠血清用PBST稀释，从1:4开始，2倍系列稀释至 1:512，于反应板的每孔加量50yL;然后每孔再加入50yL稀释至工作浓度的0型抗原，混匀4 °C反应过夜；取以上50yL抗原抗体反应物加入至包被兔抗口蹄疫抗体（中国农科院兰州兽 医研究所)的另一块96孔反应板中，37°C作用1小时，弃液，PBST洗涤5遍，加入豚鼠抗血清工 作液，37°C作用30min，弃液，PBST洗涤5遍，加入酶标二抗，37°C作用30min，弃液，PBST洗涤5 遍，然后加入OPD底物反应液，37°C作用5~lOmin，加入终止液，酶标读数测定结果0D (492nm)。同样按此方法检测小鼠血清中亚洲I型抗体。
[0049] 5.结果计算:根据阻断ELISA计算方法，确定阳性临界值，高于临界值为阴性，小于 等于临界值为阳性，如某样品稀释至1:256孔的值低于临界值，1:512孔的值高于临界值，则 确定阻断ELISA值为1:256。
[0050] 6.判定:首先将阻断ELISA值换算成以-l〇g1QX的抗体效价，然后计算同组5只老鼠 的抗体效价的平均值及SD值，并计算变异系数(C. V) = SD值/平均值，只有当1头份剂量组0 型和Asia I抗体效价平均值均大于2.0，C.V低于12%，疫苗判为合格。
[0051 ]按此操作测定了3批经本动物免疫攻毒检验合格的口蹄疫三价灭活疫苗（0型+ Asia I型+A型），结果均判为合格。
[0052] 表2 3批口蹄疫二价灭活疫苗（0型+Asia I型）免疫小鼠血清抗体结果(_l〇g10X+ SD)
[0053]
[0054] 实施例三
[0055] 口蹄疫三价灭活疫苗(0型+Asia I型+A型）的小鼠免疫血清学检测
[0056] 1.实验动物:选取8~10周龄SPF级Balb/c系小鼠，分为4组，其中3个实验组，1组对 照组，每组5只小鼠。
[0057] 2.疫苗及疫苗免疫：口蹄疫三价灭活疫苗(0型+Asia I型+A型），选取3组动物为实 验组，分别免疫1头份剂量，1/2头份剂量，1/4头份剂量，对照组注射206佐剂。
[0058] 3.采血分离血清:小鼠于免疫后第28天眼窝采血，4°C，5000r/min离心10min，分离 血清。
[0059] 4.血清抗体阻断ELISA检测：将小鼠血清用PBST稀释，从1:4开始，2倍系列稀释至 1:512，于反应板的每孔加量50yL;然后每孔再加入50yL稀释至工作浓度的0型抗原，混匀4 °C反应过夜；取以上50yL抗原抗体反应物加入至包被兔抗口蹄疫抗体（中国农科院兰州兽 医研究所)的另一块96孔反应板中，37°C作用1小时，弃液，PBST洗涤5遍，加入豚鼠抗血清工 作液，37°C作用30min，弃液，PBST洗涤5遍，加入酶标二抗，37°C作用30min，弃液，PBST洗涤5 遍，然后加入OPD底物反应液，37°C作用5~lOmin，加入终止液，酶标读数测定结果0D (492nm)。同样按此方法检测小鼠血清中Asia I型和A型抗体。
[0060] 5.结果计算:根据阻断ELISA计算方法，确定阳性临界值，高于临界值为阴性，小于 等于临界值为阳性，如某样品稀释至1:256孔的值低于临界值，1:512孔的值高于临界值，则 确定阻断ELISA值为1:256。
[0061 ] 6.判定:首先将阻断ELISA值换算成以-l〇g1QX的抗体效价，然后计算同组5只老鼠 的抗体效价的平均值及SD值，并计算变异系数(C. V) = SD值/平均值，只有当1头份剂量组0 型、Asia I型及A型抗体效价平均值均大于2.0，C.V低于12%，疫苗判为合格。
[0062]按此操作测定了3批经本动物免疫攻毒检验合格的口蹄疫三价灭活疫苗（0型+ Asia I型+A型），结果均判为合格。
[0063] 表3 3批口蹄疫三价灭活疫苗（0型+Asia I型+A型）免疫小鼠血清抗体结果（_ logioX+SD)
[0064]
[0065] 注:每批疫苗ro5〇从上到下依次为0型，亚洲I型，A型。
【主权项】
1. 一种口蹄疫灭活疫苗效力检验方法，其特征在于本发明所述的方法是通过口蹄疫阻 断ELISA方法检测血清特异性抗体替代本动物免疫攻毒进行口蹄疫灭活疫苗效力检验。2. 如权利要求1所述口蹄疫灭活疫苗效力检验方法，其特征在于该方法包括：（1)每批 疫苗每个剂量免疫4~8只Balb/c系小鼠，疫苗免疫剂量可分为1头份，1/2头份，1/4头份三 个剂量组，第28天采血，分离血清；（2)通过口蹄疫阻断ELISA方法检测血清特异性抗体，抗 体阻断ELISA效价l 〇g1QX高于2.0以上，变异系数低于12%，即判为合格。3. 根据权利要求1所述的一种口蹄疫灭活疫苗效力检验方法，步骤（1)中Balb/c系小鼠 为8~9周龄。4. 根据权利要求1所述的一种口蹄疫灭活疫苗效力检验方法，步骤（1)中疫苗可为0型、 亚洲I型、A型单价疫苗或二价疫苗或三价疫苗。5. 根据权利要求1所述的一种口蹄疫灭活疫苗效力检验方法，步骤(2)中血清特异性抗 体分为〇型，Asia 1型，A型。
【专利摘要】本发明涉及一种口蹄疫灭活疫苗效力检验方法。本发明所述的方法包括：(1)每批疫苗每个剂量免疫4～8只Balb/c系小鼠，疫苗免疫剂量可分为1头份，1/2头份，1/4头份三个剂量组，第28天采血，分离血清；(2)通过口蹄疫阻断ELISA方法检测血清特异性抗体，抗体阻断ELISA效价-log10X高于2.0以上，变异系数低于12％，即判为合格。本发明为口蹄疫灭活疫苗效力检验提供了一种新的方法，通过上述方法免疫Balb/c系小鼠，检测血清可较好的反映疫苗中有效抗原含量，替代本动物免疫攻毒试验。
【IPC分类】G01N33/53
【公开号】CN105510571
【申请号】CN201510920475
【发明人】赵启祖, 邹兴启, 朱元源, 王琴, 徐璐, 范学政, 张乾义, 丁家波, 冯忠武, 冯忠泽, 印春生, 郎洪武, 杨劲松, 才学鹏, 宁宜宝
【申请人】中国兽医药品监察所
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月11日