TCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3'。
[0025] 所述的单链信号探针ssDNA为5 ' -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAGCACGCATAGG-3 '。
[0026] 所述DNA扩增体系包括缓冲溶液（1^8-!1(：1、]\%(：12、（順4)23〇4)、(1犯1 3和?11丨290嫩聚 合酶。所述核酸外切酶为Exo III核酸外切酶。
[0027] 实施例2
[0028] -种检测金黄色葡萄菌肠毒素 A的方法，具体操作过程如下：
[0029]将各DNA储备液在95°C下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟。然 后，分别取含3.0μηιο1金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体(Apt)的杂交缓冲溶液40yL和3.0μηιο1 信号探针ssDNA的杂交缓冲溶液40yL置于2ml离心管中，在37°C下杂交1小时，生成金黄色葡 萄菌肠毒素 A核酸适体-信号探针杂交物(Apt-ssDNA)。
[0030] 在37 °C下，分别将浓度为0~50ng/mL的金黄色葡萄菌肠毒素 A添加到Apt-ssDNA溶 液中，金黄色葡萄菌肠毒素 A与金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体反应，生成核酸适体-金黄色 葡萄菌肠毒素 A，释放出ssDNA。这时，体系中有ssDNA、剩余(未反应的)APT-ssDNA和核酸适 体-金黄色葡萄菌肠毒素 A等物质。
[0031] 加入 10yL缓冲溶液(缓冲溶液组成为50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2S〇4， pH 7.5)，然后加入dNTP(10mM)18yL。再向体系中加入2yL Phi29DNA聚合酶（lOu/μΙ)，在37 °C下反应15分钟，使得以金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体-信号探针杂交序列(Ap-ssDNA)为 摸板扩增成双链DNA。在65 °C下保持10分钟使Phi 29DNA去活。
[0032] 再向该反应体系中加入2yL Exo III核酸外切酶(20u/yL)，在37°C下反应30分钟， Exo III核酸外切酶使选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，单链探针ssDNA不水解而保 留下来。
[0033] 向反应液中加入25yL lmmol硝酸银和180yL PBS(10mM，pH7.0)。然后，混合物在室 温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入100yL浓度为ImM的新制备的抗坏血 酸溶液。然后在45°C下反应5~10min。
[0034]将溶液转移至微量比色皿，以波长为585nm的光为激发光，测定体系荧光发射 (610-800nm)光谱。体系的荧光发射峰的强度与金黄色葡萄菌肠毒素 A存在线性关系，其线 性方程式为，y = 286.87+96.12C，相关系数r = 0.9988,线性范围0.002~0.20ng/mL，检测限 lpg/mL，回收率在97.5~114.3%。其它细菌毒素等生物小分子对金黄色葡萄菌肠毒素 A的 检测无干扰。
【主权项】
1. 一种检测金黄色葡萄菌肠毒素 A的方法，其特征是，该方法包括如下步骤： 1) 将各DNA储备液在95 °C下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟，然后， 分别取含3.0μηιο1金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体Apt的杂交缓冲溶液40yL和3.0μηιο1信号 探针ssDNA的杂交缓冲溶液40yL置于2ml离心管中，在37°C下杂交1小时，生成金黄色葡萄菌 肠毒素 A核酸适体-信号探针杂交物Apt-ssDNA; 2) 在37°C下，分别将浓度为0~50ng/mL的金黄色葡萄菌肠毒素 A添加到Apt-ssDNA溶液 中，金黄色葡萄菌肠毒素 A与金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体反应，生成核酸适体-金黄色葡 萄菌肠毒素 A，释放出ssDNA;这时，体系中有ssDNA、剩余未反应的APT-ssDNA和核酸适体-金 黄色葡萄菌肠毒素 A物质；所述金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体为5'-AGCAGCACAG AGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3'； 3) 加入 10yL缓冲溶液，缓冲溶液组成为50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2S〇4，pH 7.5，然后加入dNTP(1 OmM) 18yL;再向体系中加入2yL Phi29 DNA聚合酶lOu/μΙ，在37°C下反 应15分钟，使得以金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体-信号探针杂交序列Ap-ssDN为摸板扩增 成双链DNA，在65°C下保持10分钟使Phi29 DNA去活； 4) 再向该反应体系中加入2yL Exo III核酸外切酶20u/yL，在37°C下反应30分钟，Exo III核酸外切酶使选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，单链探针ssDNA不水解而保留下 来;所述的单链信号探针ssDNA为5 ' -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAGCACGCATAGG-3 ' ； 5) 向反应液中加入25yL lmmo 1硝酸银和10mM，pH7.0的180yL PBS，然后，混合物在室温 下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入l〇〇yL浓度为ImM的新制备的抗坏血酸 溶液，然后在45°C下反应5~lOmin; 6) 将溶液转移至微量比色皿，以波长为585nm的光为激发光，测定体系荧光发射(610-800nm)光谱，体系的荧光发射峰的强度与金黄色葡萄菌肠毒素 A存在线性关系，其线性方程 式为，y = 286·87+96·12C，相关系数r = 0·9988，线性范围0·002~0·20ng/mL，检测限lpg/ mL，回收率在97.5~114.3%。其它细菌毒素等生物小分子对金黄色葡萄菌肠毒素 A的检测 无干扰。2. -种检测金黄色葡萄菌肠毒素 A的试剂盒，其特征是，包括:金黄色葡萄菌肠毒素 A核 酸适体、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系，所述金黄色 葡萄菌肠毒素 A核酸适体为5'-AGCAGCACAG AGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3'；所述的单链信号探针DNA为5'-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAG CACGC ATAGG-3' ；所述DNA扩增体系包括缓冲溶液(1^8_ HCl、MgCl2、（NH4)2S〇4)、三磷酸脱氧单核苷酸混合物dNTP和Phi29 DNA聚合酶;所述核酸外 切酶为Exo III核酸外切酶;所述的银离子还原检测体系中还原剂为抗坏血酸。3. -种可用于检测金黄色葡萄菌肠毒素 A的金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体，其碱基序 列为5'-AGCAGCACAG AGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3'。
【专利摘要】本发明公开了一种检测金黄色葡萄菌肠毒素A的方法及检测试剂盒，该方法包括如下步骤：(A)使金黄色葡萄菌肠毒素A核酸适体与单链信号探针DNA杂交，形成DNA杂交链；(B)使该杂交链与待测样品中金黄色葡萄菌肠毒素A时，DNA杂交链与金黄色葡萄菌肠毒素A反应释放出单链信号探针DNA；(C)利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，然后用外切酶催化双链DNA水解成单核苷酸，单链信号探针DNA不水解而保留下来；(D)在单链信号探针DNA诱导下，银离子被维生素C还原生成近红外荧光银纳米簇；测定体系的荧光强度，从而测定待测样品中的金黄色葡萄菌肠毒素A的含量。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105675569
【申请号】CN201610073268
【发明人】王益林, 苏安梅
【申请人】广西大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月2日