-b1tin，Thermo)溶液 300yL，置于 25 °C 摇床，反应 2h。以 110，000g(BeckmanSW41 转头)，4°C，离心 1.5h，收集沉淀，加入 PBS(137mM NaCl, 2.7mM KC1,8.1mM Na2HP04,1.5mM KH2P04,pH 7.5)缓冲液悬浮；经不连续蔗糖密度梯度(20%，30%，40%，50%和60%)，以110，000g，4°C，离心1.5h;分别收集各层的病毒，加PBS洗涤后，110，000g离心1.5h，收集沉淀；悬于1mL的TE(1mM Tris-Cl1ImM EDTA,pH 7.4)缓冲液中，取病毒悬液负染制样，电镜(JEMl230)观察，选取颗粒形态均一、结构完整且数量较多的病毒悬液备用，获得生物素化无囊膜病毒。
[0037]3)将GCF细胞传代于35mm玻璃底小皿中，培养16h后，细胞长成单层，去掉上清，接种ΙΟΟμΙ生物素化的无囊膜病毒置于4°C孵育30min用含有0.1%牛血清的PBS清洗3遍，再加入10yL的5nM带亲和素的量子点(605nm DQs，Invitrogen) ；4°C孵育15min，用含有0.I %牛血清的PBS洗3遍。选561nm激光束激发DQs 605(呈红色)，用617/73滤光片，在高速激光共聚焦显微镜下观察，获量子点标记无囊膜病毒。
[0038]4)经4 %多聚甲醛固定，用SMReV编码外衣壳蛋白基因表达产物所制备的小鼠抗血清(ant1-VP7)作为一抗，再对无囊膜病毒进行免疫荧光染色(呈绿色)，荧光显微镜下观察(见图1)，红、绿色重叠(呈黄色)信号确定为量子点标记无囊膜病毒。经Image Pro Plus软件计算，黄色荧光信号与红色荧光信号之比的百分数为标记效率，量子点所标记无囊膜病毒的效率大于75 %。
[0039]实施例2:
[0040]—种无囊膜病毒量子点标记方法在无囊膜病毒的入侵示踪中的应用
[0041]I)将实施例1步骤3)中接种了量子点标记无囊膜病毒的单层细胞，用细胞质膜染料(CellMask?，Invitrogen)进行染色；
[0042]2)随即将小皿置于高速激光共聚焦显微镜附带的培养系统中，进行在线培养和荧光观察；
[0043]3)选561nm激光束激发DQs 605，用617/73滤光片观察量子点标记的无囊膜病毒(红色)；选640nm激光束激发Ce I IMask?，用685/40nm滤光片观察细胞膜(绿色)；
[0044]4)连续或间隔一定时间拍照，利用图像软件获取单个无囊膜病毒颗粒运动轨迹及在相应时间与细胞膜共定位(黄色)或相对位置的系列图像(图2)，即可实时获得SMReV入侵GCF细胞的运动轨迹。
[0045]结果如图2所示:量子点标记无囊膜病毒SMReV吸附(a，示完整细胞)和穿过细胞膜进入胞质的时序变化(0s，7s，Ils和13s，细胞膜局部放大)。刚开始量子点标记无囊膜病毒SMReV与囊膜共定位(a和Os，呈黄色)，随时间延长，量子点标记无囊膜病毒(红色)逐渐脱离细胞膜(绿色)，进入胞质中(13s)。
[0046]实施例3:
[0047]无囊膜病毒在细胞内体一溶酶体系统中的时空示踪
[0048]I)在多个玻璃底的小皿中，传代培养GCF细胞，至长成单层；
[0049 ] 2)分别转染pRFP_Rab5质粒标记早期内体，转染pRFP_Rab7质粒标记晚期内体，用绿色焚光探针染料(LysoTracker Green，Invitrogen)标记溶酶体；
[0050]3)再接种实施例1中步骤2)中获得的生物素化的无囊膜病毒SMReV，用量子点DQs705 (武汉珈源)对无囊膜病毒SMReV进行标记；
[0051 ] 4)将各小皿培养不同时间(30min、60min和90min)后，分别用4%的多聚甲醛固定细胞；
[0052]5)选488nm激光束激发DQs 705，用685/40nm滤光片观察观察量子点标记无囊膜病毒(红色伪彩)；选561nm激光束激发pRFP-Rab5和pRFP-Rab7荧光，用617/73滤光片观察细胞内体和溶酶体(绿色伪彩);
[0053]6)获取系列不同时间无囊膜病毒颗粒与细胞组分共定位(黄色)图像。
[0054]7)3]\?^￥在30111丨11时主要与早期内体(1^匕5)共定位，在60111丨11时主要与晚期内体(Rab7)共定位，90min时主要与溶酶体(Lysosome)共定位(见图3)。显示无囊膜病毒SMReV经内体一溶酶体系统进行胞质内运输。完成无囊膜病毒感染过程在宿主细胞内的时空示踪。
[0055]结果如图3所示:Rab5:在30min时，SMReV主要与早期内体共定位。Rab7:在60min时，SMReV主要与晚期内体共定位;Lysosome:在90min时，SMReV主要与溶酶体共定位。标尺:5ym0
[0056]实施例4:
[0057]一种无囊膜病毒量子点标记方法在鱼类呼肠孤病毒特异抗体筛选中的应用:
[0058]I)用鱼类呼肠孤病毒SMReV免疫动物，制备SMReV抗血清，并用I3BS系列稀释(1:4，1:16,1:64,1:128,1:256) SMReV 抗血清备用；
[0059 ] 2)按实施例3中步骤I)准备多个长有单层GCF细胞的小皿；
[0060]3)按实施例3中步骤2)中所述步骤用pRFP_Rab5标记细胞早期内体；
[0061 ] 4)将实施例1中步骤2)获得生物素化的SMReV，并分别与用PBS系列稀释的SMReV抗血清或无抗血清的PBS(对照)孵育后，各接种到长有单层细胞的小皿中；
[0062]5)再按实施例3中步骤3)，4)和5)，对SMReV进行标记并培养30min、细胞固定及荧光观察。
[0063]无抗血清对照小皿中，量子点标记SMReV能与细胞早期内体共定位，但在高浓度(如稀释度为1:4和1:16)的抗血清小皿中，量子点标记SMReV却不能与细胞早期内体共定位，表明抗血清中存在细胞早期内体的有效抗体。据此，可筛选针对鱼类呼肠孤病毒与细胞早期内体互作的特异抗体。
【主权项】
1.一种无囊膜病毒量子点标记方法，包括如下步骤: 1)在无囊膜病毒悬液中，加入生物素孵育，进行无囊膜病毒的生物素化； 2)超速离心除去不完整的无囊膜病毒颗粒及其他杂质；先将生物素化的病毒悬液离心，收集沉淀，加入PBS缓冲液悬浮，经不连续蔗糖密度梯度离心，分别收集各离心条带，加PBS洗涤后离心，收集沉淀，重悬于TE缓冲液中，负染电镜观察，获得结构均一、生物素化的无囊膜病毒； 3)将步骤2)获得的生物素化无囊膜病毒接种于易感细胞，加量子点孵育，进行无囊膜病毒量子点标记。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的不连续蔗糖密度为20%、30%、40%、50% 及 60%ο3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的无囊膜病毒为大菱鲆呼肠孤病毒。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的离心速度为110,000g，离心温度为4Γ。5.权利要求1所述的方法在监测无囊膜病毒侵染细胞过程中的应用。6.权利要求1所述的方法在研究无囊膜病毒与宿主细胞互作中的应用。7.权利要求1所述的方法在筛选抗无囊膜病毒制剂中的应用。8.根据权利要求5所述的应用，其应用过程包括:量子点标记无囊膜病毒接种细胞，用细胞质膜染料染色，荧光显微镜下对量子点标记无囊膜病毒的运动轨迹进行示踪； 根据权利要求6所述的应用，其应用过程包括:单层细胞先利用融合荧光蛋白或荧光探针对不同细胞组分进行荧光定位，再接种的生物素化无囊膜病毒，再进行量子点标记。9.将细胞培养不同时间后固定，对量子点标记无囊膜病毒与共定位细胞组分进行荧光显微观察，以查明无囊膜病毒运动方向、轨迹及与细胞互作的组分。10.根据权利要求7所述的应用，其应用过程包括:通过量子点标记无囊膜病毒与其他试剂作用后，是否能与特定细胞组分结合，来筛选抗无囊膜病毒的制剂。
【专利摘要】本发明公开了一种无囊膜病毒量子点标记方法及应用。通过将生物素化的病毒悬液离心，获得结构均一、生物素化的无囊膜病毒；再接种于易感细胞，加量子点孵育，即可获得被量子点标记的无囊膜病毒。利用已标记的无囊膜病毒、结合对无囊膜病毒外衣壳蛋白免疫荧光标记、以及对细胞特定组分荧光蛋白定位，实现对无囊膜病毒活体在入侵过程中的动态示踪及无囊膜病毒与宿主细胞互作组分的定位。同时还可用于实时监测病毒入侵宿主细胞途径，特别适用于在鱼类无囊膜病毒与宿主细胞互作组分鉴定，还适用于在抗鱼类呼肠孤病毒制剂筛选和研发中的应用。
【IPC分类】G01N21/64
【公开号】CN105717084
【申请号】CN201610080846
【发明人】张奇亚, 刘佳
【申请人】中国科学院水生生物研究所
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年2月5日