N?甲酰基?3,4?亚甲二氧基苄基?γ?丁内酯在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了N?甲酰基?3,4?亚甲二氧基苄基?γ?丁内酯（KNK437）的抗乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）的作用。具体分析步骤为：将三种细胞系经过KNK437不同浓度处理一定时间或者特定浓度处理不同时间，随后分别收集细胞培养上清、细胞内总RNA和细胞中DNA，利用酶联免疫法、荧光定量PCR依次检测，发现其可以显著降低乙肝相关抗原分泌，并抑制乙肝病毒在细胞内的转录和复制，表明该药在乙肝治疗方面具有极大的临床应用前景，不同于传统的抗HBV药物的作用靶点，KNK437有望解决核苷酸类似物药物的副作用大、应答率低和容易形成耐药株等不足。
【专利说明】
N-甲酰基-3,4-亚甲二氧基苄基-γ -丁内酯在制备抗乙型肝 炎病毒的药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及N-甲酰基-3,4-亚甲二氧基苄基-γ-丁内酯 (ΚΝΚ437)的药物新用途，具体是其在制备抗乙型肝炎病毒的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)是一种能通过反转录进行复制的小分子 DNA病毒，它能感染宿主引起乙型病毒性肝炎(Hepatitis B)疾病。HBV感染是世界性的公共 健康问题，全球大约有20亿人曾感染过HBV，其中约3亿5千万发展为慢性乙型肝炎。然而慢 性感染会导致肝纤维化、肝硬化和肝癌。1992年起，我国实施了新生儿免费接种疫苗的政 策，注射疫苗以后5岁以下儿童携带率已降到0.96%，接种疫苗是一种很有效预防乙肝的方 式，但其保护率不能达到100 %。
[0003] 目前，临床上治疗慢性乙型病毒性肝炎的方式主要有两种:干扰素 α的注射和核苷 (酸)类似物如恩替卡韦、拉米夫定、阿地福韦等药物的服用。但是这两种方式都存在一些不 足，干扰素 α，这类药物疗程短，通常为6个月到1年，疗效显著，但是应答率低，通常在20 %左 右，副作用大等缺点。而研究发现拉米夫定3TC持续用药1年后耐药性的发生概率为23%，5 年后，耐药性的发生概率高达70%。阿德福韦持续用药2年和5年后，耐药性的发生概率分别 为3 %和29 % ATV持续用药1年和5年后耐药性发生概率分别为0 %和1.2 %。说明核苷(酸） 类似物药物容易引起耐药性及停药反弹等缺点，所以急需寻找新型的抗乙型肝炎病毒药 物。
[0004] ΚΝΚ437是由日本的Kaneka公司合成的一种化学试剂，别名N-甲酰基-3,4-亚甲二 氧基苄基-γ-丁内酯，或者3-(1，3_亚苄基内酰胺-5-基甲基)-2_氧代-1-吡咯烷羧。其化学 结构见下图，KNK43 7能够通过影响热休克因子HSF和HSE的相互作用，来抑制热休克蛋白的 mRNA和蛋白的积累，以及影响热休克蛋白在HeLa细胞、结肠癌、鳞状细胞癌和成胶质细胞瘤 的培养细胞中诱导耐热功能。
[0005] KNK437对于乙肝病毒直接的抑制作用还没有任何报道。
[0006]
[0007] KNK437的化学结构
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供N-甲酰基-3,4-亚甲二氧基苄基-γ -丁内酯(KNK437)在制备 抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
[0009] 本发明通过利用ΚΝΚ437对肝癌细胞系中的乙肝病毒进行控制，发现其可以显著降 低乙肝相关抗原分泌，并抑制乙肝病毒在细胞内的转录和复制，表明该药在乙肝治疗方面 具有极大的临床应用前景。
[0010]具体采用以下实验：
[0011] 运用了三种肝癌细胞系模型:HepG2 · 2 · 15细胞系、瞬时转染1 · I XHBV(pCH9-3091) 质粒的Huh7细胞系和1.3 XHBV(pGEM-l. 3 XHBV)质粒的Huh7细胞系。适当浓度的KNK437处 理细胞后，用CCK-8的方法测定了药物的细胞毒性、酶联免疫法检测了表面抗原HBsAg和 HBeAg的分泌、荧光定量PCR的方法检测了细胞内HBV DNA和RNA水平的变化，
[0012] 本发明揭示了KNK437的一种新的生物学功能，能够抑制HBV HBsAg和HBeAg的分 泌，而且能够抑制HBV的复制和转录，KNK437具有抗乙肝病毒活性，不同于传统的抗HBV药物 的作用靶点，KNK437可能作为一种新颖的靶向热休克蛋白的抗HBV药物，有望解决核苷酸类 似物药物的一些不足，比如，副作用大、应答率低和容易形成耐药株等。
【附图说明】
[0013] 图1为KNK437对HepG2.215和Huh7细胞系的细胞毒性。
[0014] 图2为KNK437对细胞上清中HBsAg分泌的影响。
[0015] 图3为KNK437对细胞上清中HBeAg分泌的影响。
[0016] 图4为KNK437对细胞内病毒RNA合成的影响。
[0017] 图5为KNK437对细胞内病毒DNA复制能力的影响。
【具体实施方式】
[0018] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0019] 实验材料：
[0020] HepG2.215细胞和Huh7细胞均购买于中国典型培养物保藏中心(CCTCC);
[0021] 1.3XHBV(pGEM-1.3HBV)质粒由以色列魏兹曼科学院的Yosef Shaul教授惠赠，该 质粒含有一个1.3倍HBV基因组片段(4195bp，血清型为adw);
[0022] 1.1 XHBV(pCH9_3091)质粒则由德国弗莱堡大学的Michael Nassal教授惠赠，该 质粒含有一个1.05倍的HBV基因组片段(3375bp，血清型为ayw);
[0023] KNK437购买于德国的Calbiochem公司；
[0024] 治疗HBV的常用药物恩替卡韦（entecavir-triphosphate，ETV)购买于美国的 Biochemicals 公司；
[0025] CCK-8试剂购买于上海的东仁化学科技公司；
[0026]抗原HBsAg和HBeAg水平检测使用的是上海科华生物工程股份有限公司生产的乙 型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)诊断试剂盒和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)诊断试剂盒；
[0027] Invitrogen公司的TRIzol reagent试剂；
[0028] TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq II试剂盒。
[0029]【实施例1】KNK437对HepG2.215和Huh7细胞系的细胞毒性
[0030] 将HepG2.2.15和HuH7细胞以IO4个细胞/孔的量接种于96孔板中，培养12h后，加入 不同浓度的KNK437进行刺激，KNK437的浓度依次为:0μΜ、0. ΙμΜ、ΙμΜ、10μΜ、20μΜ、50μΜ、100μ Μ、500μΜ;处理时间分别为2天、4天、6天，最后检测时，去除上清，PBS洗三次，再加入新鲜不 含血清的培养基，其中含有10%的CCK-8溶液，继续孵育2h，即可在酶标仪测定各孔OD490吸 光值。以未加药对照吸光值作为细胞生长速率的相对值1，其它各孔吸光值与之比较，得到 各自细胞生长速率相对值。
[0031] 实验结果（图1)可以看出，KNK437在检测浓度100μΜ以内，对两种细胞几乎没有毒 性。当药物处理2天和4天时，HepG2.215细胞的相对值都超过95%，说明细胞的生长不受影 响。而当KNK437的浓度达到500μΜ处理6天后，细胞相对值分别下降了 15%左右，表明KNK437 对HepG2.215和Huh7细胞没有毒性，在低浓度范围内不影响细胞的生长。
[0032] 后续实施例中采用KNK437的最高浓度为20μΜ，该药物浓度不会影响细胞生长。 [0033]【实施例2】ΚΝΚ437处理三种肝癌细胞系细胞上清中HBsAg和HBeAg检测（1)将 HepG2 · 2 · 15和转染了 1 · 1/1 · 3 XHBV质粒的Huh7细胞培养液中加入ΙμΜ、ΙΟμΜ和20μΜ ΚΝΚ437，以及30ηΜ恩替卡韦(ETV)作为抗HBV阳性对照药物处理6天，每两天换液，收集6天后 细胞上清于-40 °C待用；
[0034] (2)将HepG2.2.15和转染了 1.1/1.3 XHBV质粒的Huh7细胞培养液中加入20μΜ的 ΚΝΚ437，分别处理细胞2天、4天、6天，以及阳性对照30nM ETV处理6天，每两天换一次新鲜培 养液，并收集细胞上清于-40 °C待用；
[0035] (3)将（1)和(2)中所收集的细胞上清解冻后1000 Og离心5分钟以去除细胞残渣，随 后将上清于37°C温箱中预热30分钟；
[0036] (4)每个样品取出500μ1使用上海科华HBsAg酶联免疫试剂盒检测上清中乙肝s抗 原含量，检测过程严格按照产品说明书进行；
[0037] (5)每个样品取出500μ1使用上海科华HBeAg酶联免疫试剂盒检测上清中乙肝e抗 原含量，检测过程严格按照产品说明书进行。
[0038] (6)重复（1)~（5)实验步骤两次，得到3批实验数据，实验数据导入GraphPad Prism 6绘图软件，绘制柱状图并计算p值，分析用药组与未用药组间是否存在差异；
[0039] 从图IA中可以看到，1μΜ、10μΜ、20μΜ三种浓度的KNK437处理HepG2.2.15细胞6天 后，细胞分泌上清中HBsAg没有明显的变化。从图IB中可以看出，在相同浓度KNK437的刺激 下，细胞分泌上清中H B s A g也没有明显的变化。综上所述，K N K 4 3 7的刺激不能够引起 H印G2 · 2 · 15细胞HBsAg的分泌。
[0040] 从图2A中可以发现，ΙμΜ、10μΜ、20μΜ浓度的KNK437刺激HepG2.2.15细胞6天后，上 清中HBeAg的分泌降低，并且随着KNK437浓度的递增，HBeAg降低的趋势增大。20μΜ KNK437 刺激6天后，上清中H B e A g的水平已降至阴性对照的7 0 %左右。如图2 B所示，2 0 μ M浓度的 ΚΝΚ437刺激HepG2.2.15细胞2至6天后，上清中HBeAg的水平均降低，其降低程度随着刺激时 间的增加而增大。综上所述，KNK437的刺激能够引起HepG2.2.15细胞HBeAg分泌的降低，并 且表现出一定的时间和剂量依赖性。
[0041 ]由图2C中可以看出，Huh7细胞转染l.lxHBV质粒后，不同浓度的KNK437处理细胞6 天后，上清中HBsAg的表达水平不存在明显的变化。当浓度达到最高20μΜ时，HBsAg的表达水 平只下降了25.8%。如图2D所示，20μΜ ΚΝΚ437刺激I. IxHBV质粒转染的Huh7细胞后，不同时 间均引起上清中HBsAg分泌减少，但是减少的幅度不是很大。综上所述，KNK437的刺激能够 轻微影响I. IxHBV质粒转染的Huh7细胞的HBsAg分泌。
[0042] 由图2C中可以看出，1μΜ、10μΜ、20μΜ三种浓度的KNK437刺激6天后，细胞上清中 HBeAg的分泌水平下降，其下降程度随着ΚΝΚ437浓度的增加而增大。20μΜ ΚΝΚ437刺激6天 后，上清中HBeAg的水平已降至阴性对照的40%左右。从图2D中可以发现，I. IxHBV质粒转染 的Huh7细胞在20μΜ ΚΝΚ437刺激下，随着刺激时间的递增，其上清中HBeAg的分泌水平依次 降低。综上所述，ΚΝΚ437能够抑制I. IxHBV质粒转染的Huh7细胞分泌HBeAg，并且具有剂量和 时间依赖性。
[0043]由图2E结果可知，不同浓度KNK437处理瞬时转染1.3xHBV质粒的Huh7细胞6天后， 当KNK437浓度达到最高20μΜ时，HBsAg的表达水平才有明显下降，下降了56.4%。由图2F结 果可知，20μΜ ΚΝΚ437处理瞬时转染1.3x HBV质粒的Huh7不同时间后，上清中HBsAg的表达 水平与KNK437存在时间依赖性，处理最长时间6天时，下了54.6%。综上结果可知，KNK437能 够抑制1.3xHBV质粒转染的Huh7细胞分泌HBsAg。
[0044]由图2E所示，可以看出1.3xHBV质粒转染Huh7细胞经KNK437刺激6天后，只有 KNK437浓度为20μΜ时，上清中HBeAg水平才明显下降，下降了54.9%。从图2F中可以看出，20 μΜ ΚΝΚ437刺激1.3xHBV质粒转染Huh7细胞2天后，上清中HBeAg水平出现下降的情况，并且 刺激时间越长，HBeAg下降越明显。综上所述，1.3xHBV质粒转染Huh7后，HBeAg分泌减少需要 较高浓度KNK437的刺激。
[0045]【实施例3】KNK437处理三种肝癌细胞系细胞内病毒mRNA水平检测 [0046] (1)将接种于六孔板内的HepG2 · 2 · 15和转染了含1 · 1/1 · 3 XHBV质粒的Huh7细胞培 养液中加入1μΜ、10μΜ和20μΜ KNK437,以及30nM恩替卡韦（ETV)作为抗HBV阳性对照药物处 理6天，每两天换液，6天后每孔细胞中加入相应的RNAiso Plus裂解液，一般六孔细胞培养 皿，每孔加 Iml RNAiso Plus裂解液。室温放置5min，使细胞充分裂解，将细胞吹散均匀，然 后收集到1.5ml无 RNase的离心管；
[0047] (2)将接种于六孔板内的HepG2.2.15和转染了I. l/1.3xHBV质粒的Huh7细胞培养 液中加入20μΜ的KNK437,分别处理细胞2天、4天、6天，以及阳性对照30nM ETV处理6天，每两 天换一次新鲜培养液，培养一定时间后每孔细胞中加入相应的RNAiso Plus裂解液，一般六 孔细胞培养皿，每孔加 Iml RNAiso Plus裂解液。室温放置5min，使细胞充分裂解，将细胞吹 散均勾，然后收集到1.5ml无 RNase的离心管；
[0048] (3)将（1)和(2)步骤中收集的细胞裂解液加入1/5体积的氯仿，剧烈颠倒混匀，室 温放置5min;
[0049] (4)将（3)中所得到的样品在4°C离心机，12000rpm/min，离心15min，小心取出样 品，样品分为三层:红色的有机相下层、中间DNA薄层、含RNA的上清；
[0050] (5)将(4)中上清转移至新的1.5ml无 RNase离心管，不要将上清取的太干净，避免 取到DNA薄层；
[0051] (6)向（5)取出的上清中加入等体积的异丙醇，剧烈颠倒混匀，室温静置IOmindX 淀RNA。离心后可看见底部有白色沉淀，弃上清，向管中加入1ml 70%乙醇(DEPC水配制），上 下颠倒，洗涤沉淀。然后4°C，12000rpm/min，离心5min;
[0052] (7)将(6)中上清丢弃，将沉淀放置室温5min，干燥沉淀。加入20μ1 DEPC处理水，室 温放置5min，使沉淀充分溶解。然后将得到的mRNA置于-80°C保存或直接进行后续反转录实 验；
[0053] (8)将（7)提取的RNA样品，严格按照Vazyme公司的HiScript Q RT SuperMix forqPCR(+gDNAwiper)试剂盒操作，反转录成cDNA;
[0054] (9)将(8)中的cDNA严格按照Vazyme公司的AceQ qPCR试剂盒，配制荧光定量PCR反 应体系；
[0055] (10)将（9)配制好的反应体系在Roche公司的LightCycler 96Real_Time PCR system仪器上进行反应。以管家基因 Actin作为内参，相比较得出样品的相对值；
[0056] (11)重复（1)~（10)实验步骤两次，得到3批实验数据，实验数据导入GraphPad Prism 6绘图软件，绘制柱状图并计算p值，分析用药组与未用药组间是否存在差异；
[0057] 由图3A中可以看出，1μΜ、10μΜ、20μΜ三种浓度的KNK437刺激6天后，HepG2.215细胞 内的RNA水平下降，其下降程度随着KNK437浓度的增加而增大。20μΜ KNK437刺激6天后，RNA 水平已降至阴性对照的65.7%。从图38中可以看出，2(^]?1(疆437处理!^62.215细胞不同 时间后，细胞内HBV RNA水平在处理2天后明显下降，下降了60.4%，接着处理4天和6天后并 没有明显的进一步下降。综上所述，ΚΝΚ437能够抑制HepG2.215细胞内RNA的转录，并且具有 剂量依赖性。
[0058]由图3C中可以看出，三种浓度的KNK437刺激I. IxHBV质粒转染的Huh7细胞6天后， 细胞内RNA水平下降，其下降程度随着KNK437浓度的增加而增大。20μΜ KNK437刺激6天后， 细胞中RNA的水平已降至阴性对照的76 %左右。从图3D中可以发现，I. IxHBV质粒转染的 Huh7细胞在20μΜ ΚΝΚ437刺激下，随着刺激时间的递增，其细胞中RNA水平依次降低。综上所 述，ΚΝΚ437能够抑制I. IxHBV质粒转染的Huh7细胞内RNA水平，并且具有剂量和时间依赖性。 [0059]由图3E中可以看出，三种浓度的KNK437刺激1.3xHBV质粒转染的Huh7细胞6天后， 细胞内RNA水平下降，其下降程度随着KNK437浓度的增加而增大。20μΜ KNK437刺激6天后， 细胞内RNA水平已降至阴性对照的73 %左右。从图3F中可以发现，1.3xHBV质粒转染的Huh7 细胞在20μΜ KNK437刺激下，随着刺激时间的递增，其细胞中RNA水平依次降低。综上所述， ΚΝΚ437能够抑制1.3xHBV质粒转染的Huh7细胞内RNA水平，并且具有剂量和时间依赖性。 [0060]【实施例4】KNK437处理三种肝癌细胞系细胞内病毒DNA水平检测 [00611 (1)将接种于六孔板内的HepG2.2.15和转染了含1.1/1.3 XHBV质粒的Huh7细胞培 养液中加入1μΜ、10μΜ和20μΜ KNK437,以及30nM恩替卡韦（ETV)作为抗HBV阳性对照药物处 理6天，每两天换液，6天后收集细胞，冻存于-80°C待用；
[0062] (2)将接种于六孔板内的HepG2.2.15和转染了 1.1/1.3 XHBV质粒的Huh7细胞培养 液中加入20μΜ的KNK437,分别处理细胞2天、4天、6天，以及阳性对照30nM ETV处理6天，每两 天换一次新鲜培养液，培养一定时间后收集细胞，冻存于_80°C待用；
[0063] (3)每一样品中加入NP40裂解液(NaCl 2.19g，lM Tris · HCl(pH8.0)12.5ml，NP40 2.5ml，0.5M EDTA0.5ml，去离子水溶解，定容至250ml，使用时加入1/100的IOOmM PMSF)，冰 上消化20min，使细胞充分裂解。用刮铲刮下细胞收集到1.5ml离心管，4°C，12000rpm/min， 离心10min。将上清转移至新的1.5ml离心管；
[0064] (4)各样品取相同蛋白含量的上清转移至新的1.5ml离心管，依次加入2ylDNAase Ι(5υ/μ1)、1μ1 RNaseA(10mg/ml)、1.6yl IM MgC12(终浓度80mM)，混匀，37°C恒温箱放置 2h，充分去除细胞内基因组DNA和RNA;
[0065] (5)将(4)样品取出，每一样品加入3μ1 0.5M EDTA，在60°C放置lOmin，终止反应， 以免破坏后续释放的病毒DNA;
[0066] (6)接着加入20μ1 10%SDS(1/10体积，终浓度为 1%)，再加入ΙμL Proteinase K (终浓度为I〇〇μg/ml)，混匀，37 °C恒温箱放置2h;
[0067] (7)将样品取出加入1倍体积的Tris饱和苯酚，颠倒混匀，室温下，10000rpm/min， 离心10min;
[0068] (8)将(7)中上清小心转移至新的1.5ml离心管，然后加入0.5μ1糖原(终浓度0.05μ g/μL)，颠倒混匀；再加入20μ1 3Μ NaAc ΡΗ5.2(1/10体积），颠倒混匀;再加入400μ1 100% 乙醇(2倍体积），颠倒混匀，-20 °C冰箱放置2.5h或者过夜，沉淀DNA;
[0069] (9)取出样品，4°C，12000rpm/min，离心15min。离心后可看见底部有白色沉淀，弃 上清，加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀，4°C，12000rpm/min，离心5min;
[0070] (10)弃上清，将沉淀放置室温IOmin，干燥沉淀。加入20μ1 TEbuf fer，室温放置 IOmin，使沉淀充分溶解，涡旋30s，充分混匀，得到DNA样品；
[0071 ] (11)将（10)中的DNA按照Vazyme公司的AceQ qPCR试剂盒配制荧光定量PCR反应体 系；
[0072] (12)将（11)配制好的反应体系在Roche公司的LightCycler 96Real-Time PCR system仪器上进行反应。以PCH9-3091做标曲，相比较得出样品的相对值；
[0073] (13)重复（1)~（12)实验步骤两次，得到3批实验数据，实验数据导入GraphPad Prism 6绘图软件，绘制柱状图并计算p值，分析用药组与未用药组间是否存在差异；
[0074]由图4A中可以看出，HepG2.215细胞经不同浓度的KNK437刺激以后，细胞内HBV DNA水平明显下降，而随着浓度的升高，下降的程度增大。KNK437浓度升高到20μΜ时，抑制率 95%以上。由图48可以发现，2(^]?1(疆437处理拖？62.215细胞不同时间后，细胞内冊￥0嫩 水平明显下降，随着刺激时间的递增，其细胞中DNA水平依次降低。处理6天时，HBV DNA水平 的抑制率已经高达98.6%。综上所述，ΚΝΚ437能够抑制HepG2.215细胞内DNA水平，并且具 有剂量和时间依赖性。
[0075]由图4C中可以看出，三种浓度的KNK437刺激I. IxHBV质粒转染的Huh7细胞6天后， 细胞内DNA水平下降，其下降程度随着KNK437浓度的增加而增大，但抑制程度比HepG2.215 细胞弱。当浓度升高到20μΜ时，HBV DNA水平抑制率最高，达到了42.7%。从图4D中可以发 现，I. IxHBV质粒转染的Huh7细胞在20μΜ ΚΝΚ437刺激下，随着刺激时间的递增，其细胞中 DNA水平依次降低。综上所述，ΚΝΚ437能够抑制I. I xHBV质粒转染的Huh7细胞内DNA水平，并 且具有剂量和时间依赖性。
[0076]由图3E中可以看出，三种浓度的KNK437刺激1.3xHBV质粒转染的Huh7细胞6天后， 细胞内DNA水平下降，其下降程度随着KNK437浓度的增加而增大。20μΜ KNK437刺激6天后， 细胞内DNA水平已降至阴性对照的66 %左右。从图3F中可以发现，1.3xHBV质粒转染的Huh7 细胞在20μΜ KNK437刺激下，随着刺激时间的递增，其细胞中DNA水平依次降低。综上所述， ΚΝΚ437能够抑制1.3xHBV质粒转染的Huh7细胞内DNA水平，并且具有剂量和时间依赖性。 [0077]综上所述，本发明首次证实KNK437够从转录水平抑制HBV RNA的合成，进而影响到 下游DNA及抗原分泌水平。这一发现不仅拓宽了 HBV治疗的思路，而且增加了联合用药的选 择，对其临床使用具有一定的理论指导意义。
【主权项】
1.N-甲酰基-3，4-亚甲二氧基苄基-γ -丁内酯在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用。
【文档编号】A61K31/4025GK106074503SQ201610407438
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】胡康洪, 黄亚运, 程智逵, 孙鸽, 魏艳红
【申请人】湖北工业大学