专利名称：棉花半配合育种方法
技术领域：
本发明涉及一种棉花的育种方法，具体是涉及转基因抗虫棉的育种方法。
从国内外转基因抗虫棉的选育过程看，一般外源基因利有农杆菌介导法、花粉管通道法以及基因枪穿透等方法将抗虫基因导入棉花中，由于基因的互作效应，棉花的特征、特性以及农艺性状都会产生分离和变异，需要通过系统选育或杂交、回交等技术加以稳定，一般，从外源基因导入棉花到成为抗性和丰产性均稳定的商品化品种，需要7-8年时间，Harris预测，如果Bt毒素同时在棉花、玉米和高梁上开展使用防治夜蛾科害虫，那么可能在25-75代(3-9年)的时间内，就会由于害虫抗性的产生，而使这种转基因技术变成无用。因此，昆虫产生抗性是对植物转基因工程的一个挑战。如何缩短转基因抗虫棉的选育过程，加速转基因棉花的稳定，延长转基因抗虫棉的使用时间，是急待解决的问题。
发明内容
本发明的目的就是提供一种转基因抗虫棉的育种方法，该育种方法能够快速稳定转基因抗虫棉，缩短转基因抗虫棉的育种过程。
半配合生殖(Semigamy)是介于受精(fertilization)和无融合生殖(apomixis)之间的一种特殊的生殖类型，植物授粉后，雄配子核进入卵细胞，但并不与卵细胞融合，而是彼此独立分裂，最后形成镶嵌有来源于父本和母本组织的异质胚，这种生殖方式称为半配合生殖。
自Turcotte和Feaster(1967年)发现棉花半配合材料后，三十多年来，关于半配合材料的研究只停留在了细胞遗传和胚胎发育等基础理论方面。由于半配合材料的自交后代或用它作亲本杂交的后代均能产生一定比率(6％-20％)的单倍体，也引起了棉花遗传育种专家的注意。单倍体在遗传和育种上具有重要的理论意义和应用价值，例如单倍体经染色体加倍后，可以得到两套染色体完全一样的纯合系，由于染色体纯合，后代便不会再产生分离。
利用单倍体的上述特性，如果在杂交育种中把杂种一代或二代已发生基因重组的单倍体配子或植株的染色数经人工或自然加倍，就可以得到稳定的纯合二倍体，而不必再进行多代连续选育得到稳定系，大大缩短了育种进程。
本发明选择棉花半配合材料VSG作母本，与转基困抗虫棉低代材料作父本杂交，将F1中具有转基因的单倍体进行染色体加倍，培育出了纯合二倍体的转基因抗虫棉。
作为母本的棉花半配合材料VSG属海岛棉(G barbadense L)，株高80-100cm，生育期135-140天，叶片3-5列，缺刻较深，颜色发黄，主茎节间长10-15cm，果枝节间长15cm左右，植株松散，呈塔型，单铃籽棉重3g左右，纤维长度35-37mm，衣分28％-30％，籽指10g左右。由于受显性基因Se的控制，其自交或杂交后代中会出现6％-20％的单倍体。本发明所采用的棉花半配合材料VSG由河北省农林科学院棉花研究所引进。
本发明首先选择转Bt基因抗虫棉低代材料95-1作父本与VSG杂交，由于受母本VSG所含的Se基因的控制，在F1中产生了10％左右的具有转Bt基因的单倍体。
父本95-1属陆地棉(G hirsutum L)，是由山西省农科院棉花所利用农杆菌介导法将外源抗虫基因Bt导入晋棉7号获得的转基因抗虫棉低代材料。由于外源基因的导入，产生基因互作效应，植株生长发育过程中生理代谢失调，后代产生分离，抗虫性及其他性状均表现不稳定。株高50-100cm，主茎节间长5-10cm，果枝节间长3-15cm，株型有塔型、筒型等，叶片大小不一，深绿色，5裂叶，生育期110-140天，单铃籽棉重3-5g，纤维长度25-32mm，衣分30-40％，籽指8-11g，抗虫性株间差异较大，需经多年连续选择培育才可稳定。
进而我们选择转Bt基因抗虫棉低代材料95-1与转CPTI基因抗虫棉低代材料9701进行成对杂交，产生出了具有Bt+CPTI转基因的杂种一代，再用杂种一代作为父本，与半配合材料VSG进行杂交，在F1中出现了具有Bt+CPTI双价转基因的单倍体。
CPTI基因为豇豆胰蛋白酶基因，是一种抑制蛋白酶基因，它可以破坏昆虫的消化系统神经，从而导致昆虫食性下降而死亡。CPTI基因首先由中中农科院生物技术研究所得到，山西省农科院棉花所将其导入晋棉12号，得到了转CPTI基因抗虫棉低代材料9701。9701株高80-100cm，生长期130-135天，株型呈筒形，叶片大，深绿色，5裂叶，主茎节间长5-10cm，果枝节间长10cm左右，单铃籽棉重5g左右，纤维长度29-30mm，衣分38％-40％，籽指10g左右。生长势强，抗枯黄萎病和棉铃虫。
在得到具有转基因的单倍体后，需对其培育以进行染色体加倍。在单倍体的培育过程中，由于单倍体一般都生长缓慢、瘦弱，因此在生长过程中要加强水肥管理，改善生长发育条件。为了扩大单倍体的群体和改善单倍体的营养状况，本发明采用了嫁接的方法，用两个不同的棉花品种为亲本进行杂交，以杂交一代植侏作砧木，用单倍体的幼芽作接穗进行嫁接。由于杂交一代具有明显的杂种优势，水分及营养物质丰富，生理代谢也较旺盛，嫁接后的单倍体可以得到比原来单倍体母体植株上更为充足的水分和营养物质，生长健壮，有利于下一步的染色体加倍。
作为单倍体嫁接砧木杂交一代的两个亲本，可以选择两个非抗虫棉品种，也可以选择一个或两个都是抗虫棉品种，甚至可以将抗虫棉的低代材料作为亲本。例如本发明选择非抗虫棉品种晋棉21号与转基因抗虫棉低代材料GR-2作为亲本，杂交产生的杂交一代植株作为砧木嫁接单倍体幼芽。
染色体加倍的处理方法有两种幼苗加倍和枝条加倍，幼苗加倍是在23-26℃的环境温度下，将单倍体幼苗的顶尖浸入0.03-0.05％的秋水仙碱溶液中浸泡6小时。枝条加倍则是将单倍体幼嫩枝条的生长点浸入由0.03-0.05％秋水仙碱和5％二甲基亚砜组成的混合溶液中浸泡12-24小时，浸泡时环境温度应保持在28-30℃。
单倍体经染色体加倍后，成为纯合二倍体。对纯合二倍体进行抗虫性测定、品质鉴定和产量比较试验后，即成为一个转基因抗虫棉的稳定纯合系。
本发明采用半配合育种方法选育转基因抗虫棉，只需2-3代就可以得到转基因抗虫棉的稳定系，而一般的转基因抗虫棉由于基因的互作效应，需要通过系统选育或杂交，回交等技术加以稳定，需要连续选育5-7代才能得到稳定系。因此，利用半配合育种方法大大缩短了育种进程，提高了育种效率。
由于采用半配合育种方法得到的转基因抗虫棉稳定系的基因纯合，不易产生变异和退化，稳定性能比一般品种好，生产应用的时间也较长。
四、具体实施例以半配合材料VSG为母本，以转基因抗虫棉低代材料为父本进行杂交，得到单倍体植株337株。其中转Bt基因单倍体239株，转(Bt+CPTI)双价基因单倍体98株。经染色体加倍后，共计获得转Bt基因加倍单倍体49株，转(Bt+CPTI)双价基因加倍单倍体21株。
通过田间株行、株系品比鉴定，从生育期、株高、单铃籽棉重、衣分、籽指、皮棉产量等方面进行全面考察分析，并通过网室抗虫性鉴定和经农业部棉花品质监督检验测试中心棉纤维品质测定，从49个转Bt基因加倍单倍体株系中筛选出三个稳定系DHR-1、DHR-2、DHR-3，从21个转(Bt+CPTI)双价加倍单倍体株系中筛选出两个稳定系DHR-4、DHR-5。其中DHR-2在进一步通过区域试验和生产试验后，2002年2月已通过山西省品种审定委员<p>表2
上述品比试验中，对照95-1为转Bt基因抗虫棉低代材料，晋棉10号为非转基因抗虫棉品种。四个稳定系中，DHR-1、DHR-3、DHR-4、抗虫性与95-1相差不大，DHR-5的抗虫性略高于95-1。
针对转Bt基因抗虫棉稳定系DHR-2进行品比试验，在接虫网室隔离条件下，全生育期不治棉铃虫，二年平均皮棉产量58.8kg/亩，比对照晋棉21号(非转基因抗虫棉)增产53.6％，在常规开放栽培条件下，全生育期防治棉铃虫，二年平均皮棉产量61.3kg/亩，比对照晋棉21号增产8.3％。2000年在五个点参加生产试验，小区面积0.5亩，五个点均增产，平均皮棉产量76.5kg/亩，比对照晋棉21号增产12.8％，2001年扩大到八个点参加生产试验，平均皮棉产量88.7kg/亩，八个点均表现增产，比对照晋棉21号增产29.2％。经田间鉴定，DHR-2生长势强，生长整齐而稳健，单株结铃多，棉铃大而均匀，抗虫性强。DHR-2株型紧凑，株高70-80cm，生育期119天，单铃籽棉重5g左右，籽指10.2g，衣分38-40％，叶色深绿，中等大，生长势较强，后期叶絮集中，霜前花率80％以上，纤维结白，经农业部棉花品质检验测试中心测定，2.5％跨长30.3mm，整齐度47.4％，比强度21.1CN/tex，伸长率9.7％，与克隆值402，反射率79.4％，黄度8.6，环缕纱强129，气纱品质1895，达到国家95育种攻关指标，附合纺织工业要求。
经网室鉴定，DHR-2的2代棉铃虫百株幼虫15头，对照晋棉10号百株幼虫63头，比对照减少76.2％，DHR-2百株被害蕾41个，对照晋棉10号百株被害蕾267个，比对照减少84.6％，达到了高抗水平。2000年和200年在2代棉铃虫发生高峰期时，分别对13个点进行生产调查，DHR-2 2代棉铃虫百株幼虫两年平均11.1头，对照晋棉21号为40.2头，DHR-2比对照减少71.3％，百株被害蕾DHR-2两年平均为45.9个，对照晋棉21号为240个，DHR-2比对照减少72.4％，达到高抗水平。DHR-2于2002年2月通过山西省品种审定委员会审定，命名为晋棉34号。
权利要求
1.一种棉花半配合育种方法，其特征在于以棉花半配合材料VSG作母体，与转基因抗虫棉低代材料父本杂交，再将子一代中具有转基因的单倍体进行染色体加倍，培育出纯合二倍体的转基因抗虫棉。
2.根据权利要求1所述的棉花半配合育种方法，其特征在于以棉花半配合材料VSG作母体，以转Bt基因抗虫棉低代材料95-1作父本进行杂交，得到转Bt基因单倍体，染色体加倍后，培育出纯合二倍体的转Bt基因抗虫棉。
3.根据权利要求1所述的棉花半配合育种方法，其特征在于以棉花半配合材料VSG作母本，以转Bt基因抗虫棉低代材料95-1与转CPTI基因抗虫棉低代材料9701杂交的杂种一代作父本进行杂交，得到转(Bt+CPTI)基因单倍体，染色体加倍后，培育出纯合二倍体的转(Bt+CPTI)基因抗虫棉。
4.根据权利要求1所述的棉花半配合育种方法，其特征在于以两个不同的棉花品种为亲本进行杂交，以杂交一代植株作砧木，将单倍体幼芽嫁接进行单倍体的培育。
5.根据权利要求1所述的棉花半配合育种方法，其特征在于作为亲本的两个棉花品种中，有一个品种或两个品种都是抗虫棉品种或抗虫棉低代材料。
6.根据权利要求1所述的棉花半配合育种方法，其特征在于将单倍体幼苗顶尖浸入0.03％-0.05％秋水仙碱溶液中6小时，进行染色体加倍。
7.根据权利要求1所述的棉花半配合育种方法，其特征在于将单倍体幼嫩枝条的生长点浸入0.03％-0.05％秋水仙碱与5％二甲基亚砜的混合溶液中12-24小时，进行染色体加倍。
8.利用权利要求1或2育种方法得到的抗虫棉品种，其特征在于将半配合材料VSG与转Bt基因抗虫棉低代材料95-1杂交，子一代单倍体经染色体加倍后得到转基因抗虫棉品种晋棉34号。
9.利用权利要求1或2育种方法得到的抗虫棉品种，其特征在于将半配合材料VSG与转Bt基因抗虫棉低代材料95-1杂交，子一代单倍体经染色体加倍后得到转基因抗虫棉稳定系DHR-1、DHR-3。
10.利用权利要求1或3育种方法得到的抗虫棉品种，其特征在于将半配合材料VSG与转Bt基因抗虫棉低代材料95-1同转CPTI基因抗虫棉低代材料9701杂交的杂种一代进行杂交，子一代单倍体经染色体加掊后，得到转基因抗虫棉稳定系DHR-4、DHR-5。
全文摘要
一种棉花半配合育种方法，利用半配合生殖特性，以棉花半配合材料VSG作母本，以转基因抗虫棉低代材料作父本进行杂交，在子一代中得到具有转基因的单倍体，对单倍体进行染色体加倍后，培育出纯合二倍体的转基因抗虫棉。用本方法培育转基因抗虫棉，只需2－3代即可得到稳定纯合系，大大缩短了育种过程。本方法已培育出不同转基因的抗虫棉稳定系4个，以及一个转基因抗虫棉新品种晋棉34号。
文档编号A01H1/02GK1404721SQ0213112
公开日2003年3月26日 申请日期2002年10月11日 优先权日2002年10月11日
发明者牛永章, 郭宝德, 黄穗兰, 张名昌, 张原根, 冀丽霞 申请人:山西省农业科学院作物遗传研究所