专利名称：木霉生物农药的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种木霉生物农药的制备工艺，尤其是一种防治农作物根腐病的微生物农药的制备方法，属生物农药技术领域。
背景技术：
由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，白绢菌(Sclerotium rolfsii)，腐霉菌(Pythium spp.)，镰刀菌(Fusarium spp.)，疫霉(Phytophthoraspp.)等病原菌引起的植物根腐病，是造成植株根部乃至全株腐烂枯死的重要原因，也是一类分布广、危害严重，难以防治的植物病害。该病对粮食作物、经济作物及林木的危害十分严重。常用的化学防治具残留，污染食品和环境。木霉(Trichoderma spp.)是一类重要的拮抗微生物，对上述植物病原真菌具有明显的抑制作用。木霉对植物病原真菌的生防机制包括竞争、抗生、重寄生、诱导抗性。已发现有许多木霉能产生对病原真菌细胞壁具有降解作用的几丁质酶，从而可抑制孢子萌发，并引起菌丝和孢子崩解，最终导致病菌的死亡。此外，木霉还有刺激植物生长，增加产量的作用。试验表明，木霉生物制剂对许多农作物、蔬菜、花卉、烟草的猝倒病、立枯病、白绢病、黑胫病、根腐病、霜霉病、赤星病等有良好的防治效果。应用木霉生物制剂防治上述土传病害是目前国内外提倡的防治技术，该技术安全、无污染。但现有木霉生物制剂主要存在着以下问题1、有效成分主要为分生孢子和菌丝段，在土壤中寿命短，容易死亡。2、因不同土壤、气候等环境条件的差异，会造成生态学障碍，从而影响木霉在土壤中的增殖和定殖能力，导致木霉生物制剂对农田环境的适应性狭窄、防效欠佳，效果不稳定，推广应用困难。
发明内容
为克服现有木霉制剂存在的适应性差，防效不佳，效果不稳定等不足，本发明提供一种能促进厚垣孢子产生、增加木霉在土壤中的活性和生物量，提高木霉在土壤中的增殖和定殖能力，提高木霉在固体发酵产物中的孢子含量的木霉制剂的制备方法。
本发明通过下列技术方案实现一种木霉生物农药的制备工艺，包括木霉菌的扩繁培养及液体发酵，其特征在于液体发酵后采用下列工艺步骤实现A、将液体发酵物按液体发酵物∶固体培养基＝15～25∶100的质量比接种于下列质量比的固体发酵培养基中甘蔗渣30～40％麦麸 30～35％米糠 30～35％在相对湿度60-80％，温度25～28℃条件下，培养4-5天后，在12℃以下低温培养2～3天。
B、将A步骤所得培养物在40～50℃温度下干燥12～24小时，按培养物∶促进剂＝100∶8～12的质量比，加入下列质量比的促进剂硅藻土35～64.9％麦麸 35～64.8％硫磺 0.1～0.2％混合均匀，粉碎后过40目筛，即得木霉粉剂和粉粒剂。
所述木霉菌通过下列常规方法进行扩繁培养、液体发酵a、将木霉菌置于下列斜面培养基中马铃薯200g葡萄糖20g琼脂 18～20g加水至1000ml；在25℃温度下，培养4-5d，之后再用相同培养基、相同培养条件进行孢瓶扩繁；
b、将扩繁培养后的木霉菌培养物接种于下列质量比的液体发酵培养基中糖蜜 1％酵母粉0.25％NaNO30.7％MnCl24H2O 0.25％MgSO47H2O 0.15％KH2PO40.36％余量用水补足，在25～28℃温度下，以培养基∶空气＝1∶1.5-2的体积比通气并搅拌培养48-60h，该搅拌为连续搅拌或者间隔搅拌。
本发明使用的木霉菌种可用浙江大学生物技术研究所的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)菌株NF9，该菌株已送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其寄出日期2006年7月14日，保藏号为CGMCCNo.1860；或者采用保藏号为CGMCC No.0955的哈茨木霉菌菌株。
本发明具有下列优点和效果一、采用上述固体发酵的培养基配方中，主要原料——甘蔗渣，不仅价廉物美，而且还含有优质的纤维素，能增加固体培养基的疏松通透性，提高固体发酵产物中的孢子含量。
采用上述固体发酵的培养方法，其所述控制条件能促进厚垣孢子的产生，厚垣孢子可抵抗不良环境条件，延长木霉的存活期(见表1)。
采用上述方法在固体发酵产物中加入促进剂，能增加木霉在土壤中的活性和生物量，提高木霉在土壤中的增殖和定殖能力(见表2)。
二、用本发明方法制得的产品经检验其结论如下<1>pH 5-7.5，水份含量10-12％，孢子含量2×108cfu/g，保存期为1年以上。<2>根据农药急性毒性分级标准，本木霉制剂急性经口毒性LD0＞5000.00mg/kg、急性经皮毒性LD0＞2000.00mg/kg均为低毒。<3>根据农药眼刺激强度分级标准，本木霉制剂眼刺激强度属中度刺激性级。<4>根据农药皮肤刺激强度分级标准，本木霉制剂皮肤刺激强度属无刺激性级。<5>根据农药致敏强度分级标准，本木霉制剂致敏强度为I级，属弱致敏物。因此，安全，无污染。
表1.液-固两相发酵法中所得产物中厚垣孢子的含量
从表1中可以看出，在液-固两相发酵法中采用本发明方法后，使木霉制剂的有效成分中的厚垣孢子数量比现有方法的数量多3倍，从而提高了木霉在土壤中的存活能力。
三、本发明添加自行配制的促进剂，经实际应用，其结果如下1、在土壤中施入加促进剂的木霉产品和施入无促进剂的木霉产品，分别在第0天，第10天，第25天，第55天，第115天进行土壤中木霉菌落形成单位(105cfu/g)的检测，结果如表2。
表2加促进剂和无促进剂的木霉产品在土壤中的种群数量
从表2中可以看出，在0-115天内加有促进剂MN的木霉产品木霉在土壤中出现了两个增殖期。10d时比未加有促进剂MN木霉的增殖幅度高2.5倍；55d时比未加有促进剂MN木霉的增殖幅度高出近3倍；115天时加有促进剂MN的木霉产品木霉的cfu/g比未加有促进剂MN的木霉产品木霉的cfu/g还高2倍。而未加促进剂MN中木霉的cfu/g在土壤中整体呈下降趋势。
2、本发明方法所得产品的防病增产实例例1①实施农药A本发明木霉粉剂。对照农药B根腐灵(生物农药)、C3％广枯灵(化学农药)、D瑞毒锰锌(化学农药)。CK对照(不施农药)②作物百合。
③防治对象由尖镰刀菌(Fusarium oxysporum)和恶疫霉(Phytophthora cactorum)引起的百合根腐病。
④使用方法以1kg/亩的用量，将药剂拌500倍细土或兑水800倍，于发病前或发病初期根施或灌根。
表3木霉制剂防治百合根腐病的实例
结论从表3可以看出，四种供试农药对百合根腐病都有一定的防治效果。木霉粉剂的防治效果达到75.6％，略次于化学药剂广枯灵79.73％的防效。但由于木霉制剂除具有防病作用外，还具有促进植株生长，提早开花挂果，增加产量的作用，因此增产率最高，达到了14.76％。另外一个化学农药瑞毒锰锌无论从防效上和增产率上都低于木霉制剂。生物农药目前能达到如此好的效果实属不易。
例2①实施农药A本发明木霉粉剂。CK对照(不施农药)②作物辣椒。
③防治对象由尖镰刀菌(Fusarium oxysporum)和辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的辣椒根腐病。
④使用方法同例1。
表4木霉制剂防治辣椒根腐病结果
结论从表4可以看出，木霉粉剂对辣椒根腐病的防治效果达到了85.7％。加上木霉还具有促进植株生长，提早开花挂果的作用(材料从略)，因此增加了产量。按一亩计算可增产350千克辣椒，增产率达到了15％。
另外，喷施本发明之产品时，以100g/亩的用量，将药剂兑水500-800倍，于发病前或发病初期喷雾。
具体实施例方式
实施例11、将木霉菌置于下列现有的斜面培养基中马铃薯 200g葡萄糖 20g琼脂20g加水至1000ml；在25℃温度下，培养4-5d；之后再用相同培养基、相同培养条件进行孢瓶扩繁；2、将扩繁培养后的木霉菌培养物接种于下列现有的质量比的液体发酵培养基中糖蜜1％酵母粉 0.25％NaNO30.7％MnCl24H2O 0.25％MgSO47H2O 0.15％KH2PO40.36％余量为水在25℃温度下，按1升培养基∶1.5升空气的量，通入空气搅拌，每2个小时搅拌5分钟，培养60h；3、将15千克液体发酵物接种到100千克的固体发酵培养基中，其中固体发酵培养基由下列质量比的原料组成甘蔗渣 40千克麦麸30千克米糠30千克在湿度60％，温度25℃条件下，培养5天后，在12℃以下低温培养2天。
4、将3步骤所得培养物在40℃温度下干燥24小时，按培养物∶促进剂＝100∶12的质量比，加入下列质量比的促进剂。
硅藻土 35.0公斤麦麸64.8公斤硫磺0.2公斤混合均匀，粉碎后过40目筛，即得筛下的木霉粉剂和筛上的粉粒剂。
实施例21、将木霉菌置于下列斜面培养基中马铃薯 200g葡萄糖 20g琼脂18g加水至1000ml；在25℃温度下，培养4-5d；之后再用相同培养基、相同培养条件进行孢瓶扩繁；2、将扩繁培养后的木霉菌培养物接种于下列质量比的液体发酵培养基中糖蜜1％酵母粉 0.25％NaNO30.7％MnCl24H2O 0.25％MgSO47H2O 0.15％KH2PO40.36％
余量为水在28℃温度下，按1升培养基∶2升空气的量，通入空气搅拌，每3个小时搅拌3分钟，培养48h；3、将25千克液体发酵物接种到100千克的固体发酵培养基中，其中固体发酵培养基由下列质量比的原料组成甘蔗渣 30千克麦麸35千克米糠35千克在相对湿度60-80％，温度28℃条件下，培养4天后，在12℃以下低温培养3天；4、将3步骤所得培养物在50℃温度下干燥12小时，按培养物∶促进剂＝100∶8的质量比，加入下列质量比的促进剂硅藻土 64.9千克麦麸35千克硫磺0.1千克混合均匀，粉碎后过40目筛，即得筛下的木霉粉剂和筛上的粉粒剂。
权利要求
1.一种木霉生物农药的制备工艺，包括木霉菌的扩繁培养及液体发酵，其特征在于液体发酵后采用下列工艺步骤实现A、将液体发酵物按液体发酵物∶固体培养基＝15～25∶100的质量比接种于下列质量比的固体发酵培养基中甘蔗渣30～40％麦麸 30～35％米糠 30～35％在相对湿度60-80％，温度25～28℃条件下，培养4-5天后，在12℃以下低温培养2～3天。B、将A步骤所得培养物在40～50℃温度下干燥12～24小时，按培养物∶促进剂＝100∶8～12的质量比，加入下列质量比的促进剂。硅藻土35～64.9％麦麸 35～64.8％硫磺 0.1～0.2％混合均匀，粉碎后过40目筛，即得木霉粉剂和粉粒剂。
2.根据权利要求1所述的木霉生物农药的制备工艺，其特征在于所述木霉菌通过下列现有方法进行扩繁培养、液体发酵a、将木霉菌置于下列斜面培养基中马铃薯200g葡萄糖20g琼脂 18～20g加水至1000ml；在25℃温度下，培养4-5d；之后再用相同培养基、相同培养条件进行孢瓶扩繁；b、将扩繁培养后的木霉菌培养物接种于下列质量比的液体发酵培养基中糖蜜 1％酵母粉0.25％NaNO30.7％MnCl24H2O 0.25％MgSO47H2O 0.15％KH2PO40.36％余量用水补足；在25～28℃温度下，以培养基∶空气＝1∶1.5-2的体积比通气并搅拌培养48-60h。
3.根据权利要求1所述的木霉生物农药的制备工艺，其特征在于所述木霉菌种可用其保藏号为CGMCCNo.1860的菌株，或者用保藏号为CGMCCNo.0955的哈茨木霉菌菌株。
全文摘要
一种木霉生物农药的制备工艺，包括木霉菌的扩繁培养及液体—固体发酵，其特征在于液体发酵后，接种于由甘蔗渣，麦麸，米糠组成的固体发酵培养基中，在相对湿度60－80％，温度25～28℃条件下，培养4－5天后，在12℃以下低温培养2～3天。固体发酵产物在40～50℃温度下干燥12～24小时，加入由硅藻土，麦麸，硫磺组成的促进剂。混合均匀，粉碎后过40目筛，即得木霉粉剂和粉粒剂。固体发酵培养基中的甘蔗渣，不仅价廉物美，而且还含有优质的纤维素，能增加培养基的疏松通透性，提高发酵产物中的孢子含量。通过控制固体发酵培养条件，促进厚垣孢子的产生，从而可抵抗不良环境条件，延长木霉的存活期，同时加入的促进剂能增加木霉在土壤中的活性和生物量，提高木霉在土壤中的增殖和定殖能力。
文档编号A01P1/00GK101028006SQ20061001108
公开日2007年9月5日 申请日期2006年7月31日 优先权日2006年7月31日
发明者武宽, 刘云龙, 徐同, 徐永华, 李文春, 张建国 申请人:云南生物制药有限公司, 云南农业大学, 浙江大学