专利名称：一种微生物抗烟草赤星病剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物抗烟草赤星病剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。
背景技术：
烟草赤星病是由交链孢菌引致的烟叶成熟后期重要的叶部病害，该病害具有潜育期短、单斑产孢量大、流行迅速的特点，在环境条件适宜的情况下，短时间内即可造成大流行，该病害在世界各烟草生产区均有发生，也是威胁我国各地烟叶生产的主要病害之一。病害严重时，烟叶发病率可高达90％，使烤烟质量下降1～2个等级，重病区减产减值达50％以上，烟草赤星病目前已成为生产优质烟的主要障碍，曾几次给世界烟叶生产带来巨大的经济损失。
长期以来化学防治一直是控制该病害的主要途径，但是高效、低毒、低残留的农药种类较少，长期或过量使用单一农药，导致病害产生抗药性，烟叶中农药残留的增加，天敌被大量杀伤，农田微生态平衡被破坏和环境污染，不符合无公害烟叶生产的要求。随着我国加入WTO和人们对环境生态保护的日趋重视，我国农药业正面临着严峻的形势。生物防治以其无污染，无残留，无生态毒性和安全性好等优点在植物病虫害的防治中起着主导作用，大力发展生物农药对我国具有非常重要的现实意义。
微生物农药是新农药创制的重要源头，在植物病原真菌病害的生物防治中起着非常重要的作用。微生物农药对人畜安全，易于分解，与环境相容，被誉为“无公害”农药。此外，微生物农药还具有研究周期短、投入低、易于工业化和商品化开发的优势。自上个世纪90年代以来，微生物农药每年以20％的速度递增，已成为农业生物技术产业中研究开发的热点之一。
发明内容
本发明的目的是通过对筛选到的一株具有防治烟草赤星病的链霉菌进行研究，开发微生物抗烟草赤星病剂。
本发明筛选到一株对烟草赤星病具有很好防治作用的马来西亚链霉菌Streptomycesmalaysiensis ECO 00002，ECO 00002菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国.北京；保藏日期2006年4月17日；保藏登记入册编号为CGMCC No.1680。
本发明Streptomyces malaysiensis ECO 00002菌株形态特征为菌落白色，圆形，表面毛绒状，边缘有较多菌丝生长；基内菌丝和气生菌丝为丝状，不规则分支，一般不断裂；气生菌丝上形成长孢链，直形或波形或螺旋，孢子圆形、椭圆形至杆状。
本发明是这样实现的制备微生物抗烟草赤星病剂1、试管种培养将菌株ECO 00002接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；琼脂20g；水1000ml；pH 7.2。于28℃下培养6天，获得试管种。(复合维生素组成为维生素B11.0mg/L，维生素B61.0mg/L，核黄素1.0mg/L，烟酸1.0mg/L，苯丙氨酸1.0mg/L，生物素1.0mg/L，丙氨酸0.3mg/L，下同)2、液体种子培养采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；水1000ml；pH 7.2。在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，120℃灭菌30分种，冷却后接入1cm2大的试管种，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养2天。
3、制备微生物抗烟草赤星病剂采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉20g；甘露醇20g；水1000ml；pH 7.8。在每个三角瓶中装入100ml液体发酵培养基，120℃灭菌30分种，冷却后接入10ml上述方法2中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液。在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，即成为可供使用的微生物抗烟草赤星病剂。
将上述方法制备得到的微生物抗烟草赤星病剂，采用离体药效试验(抑制孢子萌发法、平板抑菌试验法、离体叶片悬滴法)及活体药效试验(温室盆栽活体试验)相结合的方法，试验该制剂对烟草赤星病的防治作用。
离体药效试验结果表明用上述方法制备得到的菌株ECO 00002抗烟草赤星病剂在抑制孢子萌发法试验中，对赤星病孢子的萌发抑制率为100％；该制剂在平板抑菌试验法中，对赤星病原菌的抑菌圈直径平均为15.1mm(3次重复)，两项试验表明该制剂对赤星病原菌具有较强的抑制活性；在离体叶片悬滴法试验中空白对照的叶片接种点已呈现明显病斑，有的叶片发黄，且菌丝穿透叶片，在叶背生长；而喷施有该制剂的叶片上，接种点未见发病或只有部分接种点稍变黄，且背面无菌丝生长，证明该制剂有较强的抗烟草赤星病活性，其对烟草赤星病的防治效果经计算为95.45％。
温室盆栽活体试验结果表明菌株ECO 00002抗烟草赤星病剂对盆栽烟苗上表现出了较好的防治效果，其对烟草赤星病的防治效果经计算为95.55％，与其在烟叶离体叶片上对赤星病的防治效果具有较好的相关性。
利用本发明生产的制剂对烟草赤星病具有较好的离体及活体防效，可用于烟草作物上赤星病的防治。本发明具有原料成本低，生产工艺简单易行，防治效果好的优点，具有较好的应用前景。
具体实施例方式实施例一抑制孢子萌发法试验1、制备试验用抗赤星病剂本发明的微生物抗赤星病剂，由生产菌株(Streptomyces malaysiensis)ECO 00002菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同。
2、制备赤星病原菌将公知的赤星病原菌(Alternaria alternata(Fr.)Keissler)接种到试管固体培养基斜面上25℃下培养，培养基配方为常用的PDA培养基，方法是取马铃薯200g去皮后切成小块，加水1000ml煮沸20分钟，过滤后得到1000ml滤液，然后加入葡萄糖20g，琼脂20g，pH自然，待菌丝长满培养基后用自来水洗去气生菌丝，于400nm日光灯照射下培养产孢，2-3天待产孢后，用蒸馏水洗下孢子，并稀释成浓度为在10×10低倍镜下，每个视野30-40个孢子的赤星病孢子悬液备用。
3、离体药效试验将抗赤星病剂供试样品与配制好的赤星病孢子悬浮液等体积混合，取一滴滴加在凹玻片上，每处理3个重复，同时设清水为空白对照。在25℃下保湿培养18小时后察看空白对照孢子的萌发情况，以芽管长度超过分生孢子小端直径一半时为萌发。当空白对照孢子的萌发率达到85％后，察看抗赤星病剂供试样品对赤星病孢子萌发的抑制情况。
按以下公式计算孢子萌发抑制率孢子萌发抑制率(％)＝(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/(对照孢子萌发率)×100实验结果表明，菌株ECO 00002抗赤星病剂供试样品对赤星病原菌孢子的萌发抑制率为100％。
实施例二平板抑菌试验本发明的微生物抗赤星病剂，由生产菌株(Streptomyces malaysiensis)ECO 00002菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同，赤星病原菌的制备同抑制孢子萌发法中的方法。
离体药效试验将培养好的赤星病原菌与10ml PDA培养基(制法同抑制孢子萌发法中的方法)充分混匀，倒入内径为9cm的已灭菌培养皿中制成带菌平板，平板抑菌实验采用常规的杯碟法，即在每个每个带菌平板上放置牛津杯，在牛津杯内加入制备好的抗赤星病剂0.2ml，以清水为空白对照，重复3个样品，置25℃恒温箱中培养72小时后，用十字交叉法测量抑菌圈直径。
表1.微生物抗赤星病剂对赤星病原菌的离体药效
实施例三离体叶片悬滴法本发明的微生物抗赤星病剂，由生产菌株(Streptomyces malaysiensis)ECO 00002菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同，赤星病原菌的制备同抑制孢子萌发法中的方法。
将菌株ECO 00002抗赤星病剂供试样品喷施在长势均匀一致的离体烟叶片上，置于铺有湿纱布的盘内晾干。将赤星病指示菌的孢子悬液，用悬滴法接种在烟叶片上，每片叶接种10-12滴，同时设清水为空白对照，接种后置于28℃培养箱中保湿培养6天后，观察抗赤星病剂供试样品对烟叶赤星病发病的抑制情况。统计各处理叶片接种点发病率、发病严重度和病情指数，并计算防治效果。
病情指数＝∑(各级病斑×相对级数值)/(调查总病斑数×7)×100防治效果(％)＝(CK病情指数-施药后病情指数)/CK病情指数×100
实验结果表明空白对照的叶片接种点已呈现明显病斑，有的叶片发黄，且菌丝穿透叶片，在叶背生长；而喷施有菌株ECO 00002抗赤星病剂供试样品的叶片上，接种点未见发病或只有部分接种点稍变黄，且背面无菌丝生长。证明菌株ECO 00002抗赤星病剂供试样品有较强的抗烟草赤星病活性，其对烟草赤星病的防治效果为95.45％。
实施例四温室盆栽活体试验本发明的微生物抗赤星病剂，由生产菌株(Streptomyces malaysiensis)ECO 00002菌株，按液体发酵生产方法制备。具体制备过程及条件与发明内容描述部分相同，赤星病原菌的制备同抑制孢子萌发法中的方法。
将菌株ECO 00002抗赤星病剂供试样品喷施在8-9叶期且长势一致的盆栽烟叶植株上，待烟叶上的药液晾干后，用悬滴法将赤星病指示菌的孢子悬液接种在烟草叶片上，每株烟苗接种3-5片叶，每片叶接种10滴，同时设清水为空白对照，接种后置于28℃培养箱中保湿培养6天后，观察抗赤星病剂供试样品对烟苗叶片上赤星病发病的抑制情况，统计各处理叶片接种点发病率、发病严重度和病情指数，并计算防治效果。
病情指数＝[〔∑(病级叶数×代表级数)〕/(叶数总数×最高代表级值)]×100防治效果(％)＝[(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数]×100％实验结果表明菌株ECO 00002抗赤星病剂供试样品在盆栽烟苗上也表现出较好的防治效果，其对烟草赤星病的防治效果为95.55％，与其在烟叶离体叶片上对烟页赤星病防治效果具有较好的相关性。
权利要求
1.一种微生物抗烟草赤星病剂，其特征在于该制剂的生产菌株为马来西亚链霉菌Streptomyces malaysiensis ECO 00002，ECO 00002菌株已于2006年4月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1680。
2.权利要求1所述微生物抗烟草赤星病剂的制备方法，其特征在于(1)试管种培养为将菌株ECO 00002接种到试管固体培养基斜面上，培养基配方为酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；琼脂20g；水1000ml；pH7.2，于28℃下培养6天，获得试管种；(2)液体种子培养为采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体种子培养基，液体种子培养基配方为酵母膏4g；葡萄糖4g；麦芽膏5g；复合维生素1ml；水1000ml；pH7.2，在每个三角瓶中装入100ml液体培养基，120℃灭菌30分种，冷却后接入1cm2大的试管种，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养2天；(3)制备微生物抗烟草赤星病剂采用500ml三角瓶摇瓶培养，方法是先配制液体发酵培养基，液体发酵培养基配方为大豆粉20g；甘露醇20g；水1000ml；pH7.8，在每个三角瓶中装入100ml液体发酵培养基，120℃灭菌30分种，冷却后接入10ml上述方法(2)中得到的种子液，28℃下于转速为220rpm的摇床上培养6天得发酵液，在发酵液中加入等体积乙醇，经摇床振荡8小时后，用转速为3000rpm的离心机离心10分钟，取上清液并在旋转蒸发仪上50℃蒸去乙醇，用水稀释到原发酵液体积，即成为可供使用的微生物抗烟草赤星病剂。
3.权利要求1所述的微生物抗烟草赤星病剂，其特征在于该制剂对烟草赤星病具有较好的离体及活体防治药效，可用于烟草作物上赤星病的防治。
全文摘要
本发明涉及一种微生物抗烟草赤星病剂及其制备方法和应用，属微生物农药技术领域。该制剂的制备工序包括微生物菌株试管种培养、菌株液体种子培养、菌株液体发酵培养。本发明的生产菌株为马来西亚链霉菌(Streptomyces malaysiensis)ECO 00002，该菌株已于2006年4月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1680。利用本发明生产的制剂对烟草赤星病具有较好的离体及活体防效，可用于烟草作物上赤星病的防治。本发明具有原料成本低，生产工艺简单易行，防治效果好的优点，具有较好的应用前景。
文档编号A01P1/00GK1846505SQ20061001089
公开日2006年10月18日 申请日期2006年5月12日 优先权日2006年5月12日
发明者文孟良, 杨佩文, 李铭刚, 刘树芳, 李一青, 李家瑞, 崔晓龙, 曾莉 申请人:云南大学