专利名称：一种新的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的食线虫真菌来源的胞外丝氨酸蛋白酶基因和应用，属于分子生物学和应用微生物学领域。
背景技术：
植物寄生线虫是一大类重要的植物病害，每年造成损失巨大。在线虫生物防治中，食线虫真菌是一类非常重要的线虫生防资源，目前已有包括线虫必克等商品化的线虫生防制剂上市。
在线虫侵染过程中，无论是对于线虫虫体或者虫卵来说，其覆盖于表面的体壁或卵壳都是防止侵染的重要保护结构。线虫的体壁主要由包括角蛋白、胶原蛋白在内的蛋白质和纤维质所构成，卵壳则主要是由几丁质层构成。体壁和卵壳共同形成了防止侵染的主要屏障。研究表明，在食线虫菌物侵染线虫的过程中，主要是机械作用与蛋白酶等水解酶共同作用的结果，其中显微结构和组织化学的研究表明，至少在线虫体壁的刺入、线虫被侵入、线虫的消化等过程中均有蛋白酶和水解酶的参与。蛋白酶能有效地降解线虫体壁，协助完成侵染过程，是线虫侵染的重要毒力因子。因此，从食线虫菌物中获取蛋白酶基因，通过分子生物学手段对现有生防菌株的基因组DNA进行改造，增加蛋白酶基因的拷贝数和表达水平是提高食线虫真菌生防能力的重要手段之一。
发明内容
本发明的目的是通过对一株产生胞外丝氨酸酶并能够有效分解线虫体壁结构的捕食线虫真菌异形隔指孢的研究，报道一种新的丝氨酸蛋白酶和编码基因。
本实验室在前期的研究中，从土壤中分离了一株食线虫真菌隔指孢(Dactylellasp.，YMF1.00118)，并命名为异形隔指孢(Dactylella varietas)，在PL-4培养液中能分泌降解线虫体壁的胞外丝氨酸蛋白酶。根据对GenBank所报道的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶的同源性分析，我们设计了一对简并引物，以异形隔指孢的基因组DNA作为模板扩增得到蛋白酶编码基因的保守序列，并通过DNA Walking技术扩增得到5′端未知的基因序列，把两段序列进行拼接得到异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的全序列。利用生物学软件对蛋白酶编码基因进行分析后发现该蛋白酶编码基因没有内含子序列，而且所编码的氨基酸序列也和目前所报道的食线虫真菌来源的胞外丝氨酸蛋白酶的氨基酸组成有比较大的差异，应该是丝氨酸蛋白酶家族的一个新的蛋白酶成员。
由于胞外丝氨酸蛋白酶是参与食线虫真菌侵染线虫的重要毒力因子。因此，可以通过分子生物学手段对现有商品化的线虫生防菌株的基因组DNA进行改造，把异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因通过共转化或根癌农杆菌介导的转化技术转入线虫生防菌，增加蛋白酶编码基因的拷贝数和表达水平，提高食线虫真菌生防能力。
经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。
本发明是这样实现的一.异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的扩增1.异形隔指孢(Dactylella varietas)YMF1.00118菌株的培养1)试管种培养培养基配方为改良型PDA培养基1％葡萄糖；100g土豆煮成汁，1.8-2％琼脂；pH自然。将YMF1.00118菌丝体接种到培养基上，20-25℃下培养7～10天，获得试管种。
2)培养皿扩大培养采用前述1改良型PDA培养基，直径为9厘米培养皿，接种YMF1.00118后，用封口膜封口后于20-25℃下培养7～10天，获得用于液体扩大培养的菌种。
3)液体扩大培养(产酶培养)产酶培养基(PL-4)组成如下0.1％葡萄糖，0.1％硫酸铵，0.05％硫酸镁，100g土豆煮成汁，0.001％硫酸亚铁，用水补充体积至1L，pH6.5。每个250ml三角瓶分装60ml培养液，并加入少量的线虫作为诱导物，121℃灭菌20分钟，接入菌块，26℃摇床(200rpm)培养6天.
2.真菌基因组DNA的提取以常用的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法进行提取，常规的提取步骤如下1)收集在平板或者液体培养基中新鲜菌丝；2)用液氮研磨或者用石英砂研磨(100mg石英砂，100mg菌体，300ml CTAB溶液)，菌体磨好后再加300ml CTAB溶液，混合均匀；3)65℃水浴1小时，20分钟翻转一次；如果要除去RNA，可以在水浴40分钟的时候加入1μl的RNA酶(10mg/ml)；4)加入300μl苯酚和300μl三氯甲烷，混合均匀；5)6500rpm离心30分钟；6)把上清溶液转移到新的EP管中，注意不要吸到中间的沉淀物质，在上清液中加入300μl苯酚和300μl三氯甲烷，混合均匀；7)6500rpm离心20分钟；
8)把上清溶液转移到新的EP管中，加入0.5倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混合均匀；9)12000rpm离心5分钟，弃上清；10)沉淀用70％的乙醇清洗两遍；11)把残余的乙醇真空抽干，加入20-30μl的水溶解沉淀；12)取2-3μl样品电泳检测(1％agarose)，DNA样品-20℃保存备用。
3.、异形隔指孢胞外蛋白酶编码基因扩增1)蛋白酶保守序列扩增把基因组DNA稀释5-20倍(根据提取质量)，根据对GenBank所报道的索引号是X94121、AF516146、L29262、AJ427460、AF154118、AJ251925的不同真菌来源的丝氨酸蛋白酶的编码基因；设计一对简并引物用于异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶保守序列的克隆。所设计的引物为P15-AARTAYATYGTCGTCYWSAAG-3；P25-TTAAGYRKHKCCRTTGWAG-3。
利用以上所设计的引物配制PCR反应体系，PCR扩增程序采用降落(Touch-down)PCR程序。
A.PCR扩增体系10X PCR buffer 5μl25mM MgCl23μldNTP(10μM) 1μl灭菌水 36.5μl上游引物(100μM)a1μl下游引物(100μM) 1μlTaq DNA聚合酶(2-5units/μl) 0.5μlDNA 2μl总体积 50μla使用简并引物，所以引物的浓度较高B.降落(Touch-down)PCR程序94℃ 5min94℃ 40sec65℃b40sec72℃ 100sec 30-35个循环72℃ 10minb退火温度一个循环降低0.3℃。
2)利用DNAWalking技术扩增蛋白酶5’端未知的基因序列具体的扩增方法参见韩国Seegene公司(www.seegene.com)的DNA WalkingSpeedUPTMpremix kit试剂盒的操作手册。按照试剂盒的要求，我们根据蛋白酶的保守序列设计了三条巢氏PCR引物TSP15-GACTTCTGGGGACTTGAGGA-3；TSP25-CCAGAGTATCCCTTGAAACCAGAC-3；和TSP35-GAGTTGCGGTGGAAGCGAGA-3。通过三次PCR扩增得到未知的5′端序列。把两条序列拼接以后就得到完整的异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的全序列Sequence 118.ST25；4、PCR扩增片段测序可以把PCR扩增片段纯化出来并和商业化的测序载体连接，也可以直接把PCR扩增液体送给专业的公司进行测序。
5、测序结果分析测序结果出来后，利用NCBI上的核苷酸序列同源性分析工具BLAST N(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行分析，根据检索结果判断扩增序列的是否是捕食线虫真菌的胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因，并用DNAman进行同源序列分析和进行蛋白酶组成氨基酸序列的翻译。
对异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因序列进行同源性分析和序列翻译以后发现，异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因缺乏内含子序列，这是和以前所报道的食线虫真菌丝氨酸蛋白酶编码基因所不同的一个显著特征；同时异形隔指孢胞外蛋白酶的氨基酸序列也和其它食线虫真菌丝氨酸蛋白酶存在较低的同源性。
二.异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶基因的异源表达胞外丝氨酸蛋白酶是食线虫真菌侵染线虫的重要毒力因子。因此，通过分子生物学手段对现有生防菌株的基因组DNA进行改造，增加蛋白酶基因的拷贝数和表达水平是提高食线虫真菌生防能力的重要手段之一。
把异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因(Dv1)插入根癌农杆菌的Ti质粒(pPK2)，为了保证蛋白酶编码基因的表达，在基因的两端分别插入构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶的Gpd启动子和TrpC终止子，构建重组表达载体pPK2-Dv1，同时pPK2本身携带潮霉素编码基因可以作为转化子的筛选标记。重组表达载体pPK2-Dv1转化根癌农杆菌LBA4404，把携带重组载体的根癌农杆菌和线虫生防真菌厚垣普可尼亚菌共培养，利用根癌农杆菌天然转化的能力把外源的异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因(Dv1)转化到厚垣普可尼亚菌中并进行异源表达，提高厚垣普可尼亚菌对线虫的生防能力。
具体实施例方式以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。
实施例一异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶基因扩增以异形异形隔指孢(Dactylella varietas，YMF1.00118)的基因组DNA作为模板，首先用简并引物扩增得到蛋白酶的保守基因序列，再利用DNA Walking技术扩增未知的5′端基因序列，最后拼接以后就得到完整的蛋白酶编码基因序列(Sequence118.ST25)。
实施例二异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶基因的异源表达把异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因(Dv1)插入根癌农杆菌的Ti质粒(pPK2)，为了保证蛋白酶编码基因的表达，在基因的两端分别插入构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶的Gpd启动子和TrpC终止子，构建重组表达载体pPK2-Dv1，同时pPK2本身携带潮霉素编码基因可以作为转化子的筛选标记。重组表达载体pPK2-Dv1转化根癌农杆菌LBA4404，把携带重组载体的根癌农杆菌和线虫生防真菌厚垣普可尼亚菌共培养，利用根癌农杆菌天然转化的能力把外源的异形隔指孢的胞外丝氨酸蛋白酶编码基因(Dv1)转化到厚垣普可尼亚菌中并进行异源表达，提高厚垣普可尼亚菌对线虫的生防能力。
SEQUENCE LISTING<110>云南大学<120>一种新的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶基因及其应用<130>01<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2444<212>DNA<213>Dactylel1a varietas<220>
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1.一种新的食线虫真菌来源的胞外丝氨酸蛋白酶基因，该基因由真菌的分离与培养、真菌基因组DNA的提取、保守序列的扩增、5′端未知序列的扩增、扩增片段测序及测序结果分析步骤得到，其特征在于(1)选择在GenBank上发表的索引号是X94121、AF516146、L29262、AJ427460、AF154118、AJ251925的不同真菌来源的丝氨酸蛋白酶的编码基因；(2)利用DNAman生物学软件进行同源性分析，根据保守序列设计简并引物上游引物P15′-AARTAYATYGTCGTCYWSAAG-3′下游引物P25′--TTAAGYRKHKCCRTTGWAG-3′简并碱基代码R＝A/G，W＝A/T，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T，H＝A/C/T；(3)利用简并引物扩增得到蛋白酶编码基因的保守序列，再利用DNA WalkingSpeedUpTMPremix试剂盒扩增得到5′端的未知序列，把两段序列进行拼接得到没有内含子序列的异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的全序列Sequence118.ST25；
2.权利要求1所述的异形隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶基因的应用，其特征在于该蛋白酶对全齿复活线虫和秀丽隐杆线虫具有有较高的杀虫活性，可以通过分子生物学手段把该蛋白酶编码基因转化其它的线虫生防真菌，实现蛋白酶编码基因的异源表达，提高线虫生防真菌胞外蛋白酶的表达量和对植物寄生线虫的生防能力。
全文摘要
本发明涉及一种新的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶基因及其应用，属于分子生物学和应用微生物学领域。本发明选择在GenBank上发表的其它来源的丝氨酸蛋白酶的编码基因，利用DNAman生物学软件进行同源性分析，根据保守序列设计了一对简并引物。以异形隔指孢的基因组DNA作为模板，利用简并引物扩增得到蛋白酶编码基因的保守序列。再利用DNA Walking SpeedUp
文档编号A01P5/00GK1858211SQ200610010848
公开日2006年11月8日 申请日期2006年4月26日 优先权日2006年4月26日
发明者杨金奎, 梁连铭, 张楹, 张克勤 申请人:云南大学