专利名称：：一种与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病相关基因的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物病原细菌的致病基因的应用，尤其涉及甘蓝黑腐病原细菌的致病相关基因的应用。
背景技术：
：植物病害一直是农作物减产及其生产品质降低的主要因子之一。随着病原菌对药物抗性的增强，农药用量在不断增加，这不仅增加了环境中的药物残留而加剧了环境污染，也大大提高了农业成本。因此，农产品亟待研发新型的无公害药物作为新的植物病害防治策略。弄清植物病原菌侵染寄主的遗传机制则是开发无公害药物和提出新防病策略的关键。许多革兰氏阴性植物病原细菌通过III型分泌系统(T3SS,将之称为III型效应物的毒性蛋白)分泌并转运进入植物体内，从而引起植物致病或过敏反应(Kjemtrup，2000)。在植物病原细菌中，T3SS是由/wp(hypersensitivereactionandpathogenicity)基因编码的。许多革兰氏阴性植物病原细菌在易感寄主植物上的致病作用以及在抗性寄主或非寄主植物上引起过敏反应(hypersensitivereaction,HR)是受/2r/基因控制的(Alfano,1997)。过敏反应是植物被侵染部位组织细胞快速凋亡的一种自身免疫反应(Klement，1982)。效应物蛋白从结构上可分为分泌转运信号区和互作功能区(Mudgett,2000)。黄单胞菌III型效应物的转运依赖于易位子HrpF(Buttner,2002)。尽管效应物的详细功能仍不十分清楚，近年来的研究揭示，效应物可改变寄主细胞骨架和膜结构、攻击寄主的免疫防御系统与寄主DNA的功能，干扰寄主的正常代谢以及改变寄主的嚢胞运输等，促进病原菌进入寄主细胞和在寄主细胞内生长、扩展和定殖(Nomura,2005)。甘蓝黑腐病黄单胞菌，也称为甘蓝黑腐病黄单胞菌野油菜致病变种(JTawf/omo"oscampesfn'spv.campestris，简-尔Xcc),是一种能在全J求范围内引起所有十字花科植物黑腐病的革兰氏阴性细菌(Qian，2005)。该菌能在寄主的任何生长期通过水孔、气孔或伤口侵入植物体内，而引起寄主病害。寄主包括甘蓝、花椰菜、大白菜、萝卜以及油菜等。典型的黑腐病症状是在叶缘上形成v字形病斑，随着病斑的扩大，叶脉变黑，因而净皮称为黑腐病。黑腐病被认为是对十字花科植物危害最为严重的病害，尤其在热带和亚热带地区，温度和湿度都适宜于该菌的生长繁殖，因此发病更加严重。由于遗传稳定性和遗传可操作性，甘蓝黑腐病黄单胞菌一直被用作研究微生物与植物相互作用分子机理的模式细菌。因此，鉴定与黄单胞菌致病相关的新基因，对防治植物病害具有显著的意义。III型效应物是病原细菌致病的决定性致病因子。鉴定III型效应物蛋白并研究其功能，对于解明病原菌的致病机理、寄主范围和进化具有重要意义。参考文献1.KjemtrupS，NimchukZ,DanglJL.Effectorproteinsofphytopathogenicbacteria:bifimctionalsignalsinvirulenceandhostrecognition[J].CurrOpinMicrobiol,2000,3:73-78.2.AlfanoJR，CollmerA.ThetypeIII(Hrp)secretionpathwayofplantpathogenicbacteria:traffickingharpins,Avrproteins,anddeath[J].JBacteriol,1997，179:5655-5662.3.KlementZ.Hypersensitivity.InMountM.S.andLacy,G.H.(eds),PhytopathogenicProkaryotes.Vol.2.AcademicPress,NewYork,1982,149-177.4.MudgettMB，ChesnokovaO,DahlbeckD,etal.MolecularsignalsrequiredfortypeIIIsecretionandtranslocationoftheAvrBs2proteintopepperplants[J].ProcNatlAcadSciUSA,2000,97:13324-13329.5.ButtnerD,NennstielD,KlusenerB,etal.FunctionalanalysisofHrpF，aputativetypeIIItransloconproteinfromJTa涵o附owascaw/eWWspv.簡c她na[J].JBacteriol,2002,184:2389-2398.6.QianW,JiaY,RenSX，etal.ComparativeandfunctionalgenomicanalysesofthepathogenicityofphytopathogencampesWspv.c"wpesWs[J].GenomeRes,2005,15:757-767.7.NomuraK,HeSY.Powerfulscreensforbacterialvirulenceproteins[J].ProcNatlAcadSciUSA,2005，102:3527-3528.8.StaskawiczB，DahlbeckD,KeenNT,etal.Molecularcharacterizationofclonedavirulencegenesfromrace0andrace1ofPseudomonassyringaepv.glycinea[J].JournalofBacteriology,1987,169:5789-94.
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病相关基因的应用。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病相关的m型效应物基因在植物甘蓝黑腐病害防治中的应用，所述基因是下列核香酸序列之一(1)序列表中序列1的DNA序列；(2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80。/。以上同源性的DNA序列。通过将所述基因用作甘蓝黑腐病黄单胞菌的药物靶标，实现其在植物甘蓝黑腐病害防治中的应用。本发明通过提供一种与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病相关的III型效应物基因XC3160,其为防治甘蓝黑腐病黄单胞菌病害提供了药物靶标，从而为防治植物病害研发无公害药物及环境保护打下坚实的基础。图1为XC3160基因的克隆五coRI/Z&fll酶切电泳图谱；图2为XC3160基因插入突变体203G01的PCR验证凝胶图3为XC3160效应物转运4企测；5图4为XC3160基因插入突变体203G01的致病性试验。具体实施例方式本发明提供一种与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病相关的III型效应物基因在植物甘蓝黑腐病害防治中的应用，该基因是下列核苷酸序列之一(1)序列表中序列1的DNA序列；(2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80。/。以上同源性的DNA序列。该基因XC3160的序列已在美国国立生物4支术信息中心NCBI公布，基因组序列号为NC007086，该基因编码蛋白序列号YP—244224。携带该基因序列表中序列1的DNA是甘蓝黑腐病黄单胞菌8004菌抹的DNA,由6150个碱基组成。含完整的义opXcc/^基因，自5'端的第1至第6147位核苷酸为该基因的ORF，自5'端的第1至第3位核苷酸为该基因的起始密码子ATG,自5'端的第6148至第6150位核苷酸为该基因的终止密码子TAA。序列表中序列2的蛋白质A^因XC3160编码的效应物蛋白产物，由2049个氨基酸组成。该蛋白质预测分子量为218816.38道尔顿，等电点为6.06。含有基因XC3160的DNA序列的表达载体。基因XC3160的插入突变体203G0L在防治甘蓝黑腐病黄单胞菌植物病害上的用途。含有本发明开放阅读框及其部分序列的表达载体均属于本发明的保护范围。下面结合实施例和附图对本发明将基因XC3160用作防治甘蓝黑腐病黄单胞菌的药物靶标的技术方案进行详细阐述。在本发明的实施例中所用到的材#+包括大肠杆菌(&c/zen'c;^co//)抹系JM109、载体pUC19购自Promega公司，pLAFRl、pLAFR6为本研究室保存的柯斯质粒(Staskawiczetal，1987);限制性内切酶、修^饰酶等试剂购自Promega、Stratagene、QIAGEN^厶司。实施例l:甘蓝黑腐病黄单胞菌突变体库的构建以大肠杆菌和Jfcc之间的穿梭质粒pLAFRl为载体将Tn5gwW5(Sharma,1990)引入义cc野生型菌株8004[1958年分离自英国萨塞克斯花椰菜(5rays/caoferaceavar.botrytis)]，然后通过引入不相容质4立pPHlJI(Beringer,1978)驱赶pLAFRl，通过抗生素(卡那霉素)抗性标记筛选Xcc中带有Tn5g附A5插入突变体，结合Xcc全基因组序列和TAIL-PCR(ThermalAsymetricInterlaced-PCR)-技术(Liu，1995)，确定Tn5gw"5在基因纟且上的插入位置，并对插入位置进行PCR验证。通过考察突变体的致病性、胞外酶活性、胞外多糖合成等表型的变化，筛选致病相关基因，本实施例涉及其中一个与甘蓝黑腐病致病相关的基因XC3160，其插入突变体编号为203G01。实施例2:对XC3160克隆及序列测定由于XC3160的ORF长度达6150bp,根据XC3160的基因序列，设计3对引物GGGGAATTCGCGACTGGGTGCTGGACATGG/CCCGGGAAGCTTGAGCTCGAC;TTGGTCGAGCTCAAGCTTCCCGG/AAGGTCCGTGCAGGATCCGCATC;ATGCGGATCCTGCACGGACCTTGTC/GGGTCTAGAAATGCACGATGCCTGGGTGGTCG;以甘蓝黑腐病黄单胞菌8004菌抹总DNA为模板，PCR扩增该基因左中右三,殳序列(95。C3min;95。C20sec,60。C20sec,72。C3min，30个循环;72°C5min)，并将其克隆至克隆载体pUC19中，用双脱氧核苷酸法在ABI377DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列。将测序验证正确的XC3160基因三段序列克隆至穿梭载体pLAFRJ中，获得了含该基因的重组质粒pLXC3160。该质粒用￡coRI和I双酶切，除了一个22kb的载体条带外，还有一个5417bp的外源片段，请参见图1。其中1:X////"dni标准DNA(片段大小从大到小依次为:23.1kb,9,4kb,6.6kb，4.4kb，2.4kb,2.0kb);2:pLAFRJ;3:重组质4立pLXC3160。通过对基因XC3160的克隆及对克隆基因的序列测定，获得XC3160并i正实其正确性。实施例3:XC3160插入突变体203G01的验证对插入突变体203G01进行TAIL-PCR测序定位，发现其插在XC3160基因内。用转座子Tn5上側的一条引物(TTGTAACGCGCTTTCCCACCAACGC)和下游基因XC3159的一条引物(5'-GTCTCCACGCACGACGCGGC-3，)配对进行PCR验证(95。C3min;95。C20see,60°C20sec,72°C3min,30个循环；72°C5min),产物预期大小3354bp,请参见图2。其中，1:100bp标准DNA(片段大小从大到小依次为3kb，2kb，1.5kb，1.2kb，lkb，0.9kb,0.8kb，0,7kb等)；2:XC3160基因插入突变体203G01;3:A/州'wdl11标准DNA。插入突变体203G01用于后面证实XC3160与甘蓝黑腐病黄单胞菌的致病相关。实施例4:XC3160效应物转运^r测实马全所用寄主植物为辣4权苗(种名为O^s/cwwcv.ECW-10R)(Hibberd，1987;Castaneda，2005)，接种方法为压渗法(Xu,2007)。辣椒栽种于室外约23个月至成抹期后，选取六至八叶龄的全展叶片供试。接种供试的X"菌抹至加有相应抗生素的NYGB过夜培养至OD6()o=1.0以上；收集lmL的菌液，用1mL无菌水清洗并重悬；调006()。至0.3,用无针头的针筒吸取IO^L菌液压渗到-束椒叶片背面的叶肉中，形成一个可见的浸润斑；接种后保湿80%并置于荧光灯下按16/8h(^^/4支)照射，24h后观察结果并照相。正对照选用甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型8004菌4朱，负对照用"wSW缺失突变体和AvrBsl功能区。XC3160启动子信号区融合AvrBsl功能区后能在辣椒ECW-10R上引起快速的过敏反应，而/^pF突变后又不能引起过敏反应，证明XC3160是一个III型依赖的效应物，请参见图3。其中，A:野生型；B:aw^s7缺失突变体；C:avrAy/缺失突变体含有AvrBsl功能区；D:/w77F缺失突变体含有XC3160启动子信号区融合AvrBsl功能区；E:缺失突变体含有XC3160启动子信号区融合AvrBsl功能区；F:XC3160突变体203G01。实施例5:XC3160基因插入突变体203G01的致病性检测实—睑所用寄主植物为萝卜苗(种名为i(3p/7aw^^//v^var.Manshenhong),所用的接种方法为剪叶法(Qian，2005)。XC3160基因插入突变体和野生型菌抹在28。C下用NYGBi咅养基进行液体培养(Tang,2005),15-18个小时。用NYGB稀释到OD6oo=0.001,用灭过菌的剪刀在菌液浸泡5秒钟后，在健康叶片距叶尖1-2cm垂直叶脉的方向剪到中轴处，停留5秒钟，被接种的植物在25-30。C培养一周后观察结果，正对照选用甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型8004菌抹(A)。致病试验表明，XC3160基因的插入突变体的致病性显著降低(B),请参见图4。其中，A:甘蓝黑腐病黄单胞菌野生型菌株8004;B:XC3160基因插入突变体203G01;C:互补菌林C203G01。序列1:DNA序列ATGACCTTACCGGATTCGATCACACGTTCGCCTGCAGAACCAGCGACGGCTTCACCGCAGATCCTGGGCGCCTTGCCTGCACGGGCGGGGGCGCTCCACGTGCAGMCGTTTCATCGCATGGCGCGGCTGCCGCAGACGGCGATGTCACGCCCGTCGTTCACAGCGMTCCAGTCTGGGTGATCGTGACGACTCGCGCATGCCACGCAACCTGATCGCAGCTCTTACCGTGCATCCGGCGGCCGACCAGGTCGCCAGTCAGCTGGCCGATCAGGCTGCCGACGGGCMTGTTTCGCCCTGTCCGGGCACTGGGCAGCCGTACCGCTGCCAATGCTTGGCCGGCAGGCCGATGGCGGTGTGGCCGGCAACGAGCAGATGTCCATCGCGGTGTTCGATGCGGACGGCAGGCCATGCATGCTCGATCAGCCCGGCCGGGTCGTGGAACTGACGTCGACACCTGCGATGCCTGTGGATGTGTTGGATGACAAGGGACGTGTGTATGAAGCCGACCGATTGACGTTGCCTCGCCCGATGGGCAGCTTGTCGACCGATCACAGCGTGCATCTTCTGCTGCAGCGGCCGGCAGGGCAAGCGCAGTTCTTGCTCATGCGCAGCGAGGGGCTGCAGATGGTGCTTGATGGGCACGCGCAACTGGGACATCCGMCCAGCCATGGGAGCGGCTGACGCTTTCCCTGCATAGCGGTCCGCGCGGTTTTGTCGCACCGTCCCGATTGGTCGAGCTCMGCTTGCGGCGCCCAGCACACCCTCGGGTGGGCCGCGTTGCCTGCCGATCGCCCGCTTCGATGAACGCAGCGCTGTGGTGATGGCCGCCTCGGGGAGCGGGGACGTGCCCGCGCTGGMGGCGTTTTGTACGCCTTGAGCCAACCCGGCGATGGACATGACCGGTGGGAGGCTTTTCCGGTTACGCTGCGAACCACGCGTACCGGACAGCTGCAGCTGCCAGCGATGACCGGTCCCGACCGGGCCTCGCCTGATGACGTGGCCGTTTCCGGCACCCAGCAGGCAAGCCGTCTCAGGACACCGGACGGGACCACCTCTACCGATCCACTGAGCCTGGGCCGCGCGCAGGCCGCTGCGCTCGTAAAGCGTGCCGTGGCCGGGTGGACTGGCGTTGGAGCCCGTTTCCGTTCCGAGGCAGAGCAGGTCTTGCCGGTACTGGCAGAGGCGCGTATTGCCAGTCAGTCGCGACAAACGCCMCGCTGGAG60AGTAGGCCTGCACCCGAGACTGCGGCCGAC120CGCAGGGCATCCAGTAAGACCGCCAATGCT180GGTGGACGGCGGGCTCGCATGCACCTTGAG240AGCTTGATGGAGGCGTGTCTGGCGCGTCGG300GGCGGTGGACGTCTGTTGCGCTACATGCCG360GAGGCGTTCTTCACCACCATCCCCGGCTTG420GTCGAGCGCCGCACCGGTACTACGCCGACG480CCGCCGATCGGCCAGCTGACCGGCATCTGG540CGTGCCMCCAACTGCATCGTGTCGAGGCG600CCGGCATGTGATGCGATTGCTCATCTCTGC660TACGTCCGTGCAGGCGAGCTGTGCTGGCGT720GGCCCGACGCCCGAAGGCGCCTTGCTGCGG780CATGCTGGTGTACTGCGCCGCTGCGATGAC840CGTCCGGTAGCTGGCGGCCCGGCCTTCGAG■CCACTGGCGCATGCCGCTGTCTTGGTGCTT960ATGCGCGGGAGCGGGCCGATTGTCGCGCGA1020GAGCAGGGCTGGGCGGTGACCTCCATGGGG1080CTCGAACACAGCGACGGCAGGCGCATCTCG1140CAGCCGGCGTTCATGCTGGATCGTCCGTTG1200CCTGCGGATGAGGCGATGCAGTCGCGGGTG1260CTGGACGGCGTACTGCATTACTCGCCTTCT1320CCCGGCGGCGCGCCGTTGACCGGCGTTGTC1380GATCGTCGTCCGGTGTTCGCACTGCTGGCC1440CCCGGGCGCACCACCTGGCTGGCTGCTCAT1500CTCGCCGTGGTGCCGGACGTGGTGGAGGTG1560GACATCGCGCAGGCGGCGGTGCATGCAGAC1620CGATTGATCAAGGTCGATGCGGATCGAAAC1680GTCGCGATCGCGGTGGGATTGGATGATGCC1740TCTGCACACGTGCACCGTCTTTCGCACGAC1800TTGCCGCAGACCTCGCCACTCCCGAGTGCG1860TTACGGCTCGGCGCGCAGTGGCACACGGTG1920CGCTTGCCTGCACGCGTGGCTGCGCATGCG1980CAGTCCGGCTCCAATGCACGGGTCAATCGG2040CACGATGCGGCGGTCAGCACCACGTTGCTG2100CGCTCGAATGCACGGGTGCTCGCACAGAGC2160GTGCTCACGGACGTTGCCGGTGGCACTGCG2220TACGCGCCCACCACGCAGCAACGGCGGCTC2280CTGTCTTTGGCGCTTGAGATGTTCGACACC2340GGTGCCGCAGGTCCGCACCAGCCTGCCGCGCTGTCGCAGAGCCAGCACGAACGACTTACGCTGCGCGATCTGCGCMGATCGGGTTCCGTGCGGATGGCGGGTGCACCCAGCGCGCGAGTTGGCGGCGGGCGCGTTCGGCCGTGATGCGCCCGCACTTGGATCGTTGCATCGCTGCGCTGTTGACCGCTATGGAGCATGCACMCTGGCCGCTGCCGGGGTCAGATTGCCGATCCGMATCATGCCCTGCGCAGTGCATGCCTGCTCGCAGTCGATGATGCGGCGGCGCTGGAGGCGGCCGCCCTGGCGAAGCTGGGTCTGTCGTCATGGACCACCTTCCGCGAGGAAGTCGCCACCCCGAGCATCGGCCTGTCGCCAGGCGCGGCCCCGTTGCAGGACCTGTTCMTCGCAGCACGTTCCGCGGCTCGCTCGGTTCTACGCMTGGATGGGCGAAGCCATCCACGCGCTGGGTGTCGMGGACTGGTTGCCTTCTTCGTTCGGCATGCCCGCATTGATCTCCGGCCTGGCCCAGGMCCCGGACCTTGTCGGCGACGTGGGGCGGGGCGCATGGCGTGGGCGCAGCCGTCATCCTCTCGTTGTTTGATCGTCATGATGACGATACCACCGCGATCGGGCTGGATCTGTTCGAAACCAATTTACAGCCGCTCGCGGTGCGGCATTCTTACGCGCCAGACGCAGCCGGCACCGACMCCCGAGCATGACGGCGCAGGCCGGTGTGCAATGGTGGCMGAGATCATCGGACTCGAGTTCCAGAGCGGCATCAATCTCTCGGGCGCATTGACGGTCMCGCGGTTACCGGTGCCGGCMTCTGGACGTGCAACTGCCGACCGATGCGCCATTGACCGCCAGCTACAAGCGCACGCTTGACACGTGGGACGCGATGCGCAMCGGCTCGAAGAGGGAATGCGATATCCGGCGACACCTGGCGAGCGTATTCAGGGGGCGCAGGCGCGTGCGATCCTGGCACAACAACGTGCGTGCGCCGMCMMGGGCGGCTCGCCCTCCGAGCGCGCGGCCGAGGACGCTGCCGCCATCCAGCAGCGTGCGAACATGTTCGGGCGCGAATCGCTCGACGCGCTTGGCGAGAAAATGCGCGACGTTGCGGAGGTATTGCAGAGGTTCAAGGATGTTCCCMCCGGCCCCAGGCAATTGTCGCGATCMCGACGCAGCCGCACTGGGATTGCGGGAGCCCGCAGCCGCGCAGCGGTCGCCGGATCTCTACCGTGAAAACCCGGTGACCAGTCGCGTCGGCCTGTCGTCGCACCAGCTGTTCGAGGCAGAGATCGAGGGCGCCGAAGTGCTCGAGGCAGGAGTAACGCTGCGTAAAACMCCTTGGCTGGCTTG2460GAGGGCGTTCTGGCTGCCGATTTCTCCATG2520TCGACCGCMGTTATCGCGCCGCCGAGCTT2580ACGACGGTACAGAACAGCGATGACATGTTG2640GCCGGCGGTGCGTCGCTGCATCCGCAGGCG2700GMTTGCGCGAGGTCAGTCATCGGCTCAAG2760GGTCGCGCCACCGATGCGTCGAGTGATCCG2820AGTCTGATGGAGTACAACGCGTTGCTGGAT2880GACGCMGGCAGCGGCMTCCGGGCTGCGA2940CGTGAATTGGAGGCCTTCGACGACGTGGTG3000GGGAGCGCGCGTCAGCTGCAATTGCTCAAG3060GACGMATGGCTGCGCGCATGATCGATGTG3120TTCACAAGCAGAGTGCGCTCTGCCGAGCTG3180GATCTCAATCCGGTCAGCGTCGGCATGGGC3240CGCATCGGCGACTCGMGGACGGCGATGCG3300AAAGCGACCGCGTCAGGGACGGCAGGCATA3360GGCGCACATGTCTACGATGCGGATCCTGCA3420GCAAATCTCAGCGCAGGCGGTACCTACCM3480CCATCGACGATTCCTGAGTTCGCCAGGCTG3540MGCTATTGCGTGCAGGCGTGAACGAGGGG3600GCCMTGGATCGCTCMCGTCAACCTGACC3660GGTCCAAGACAGCCCGTCGCACCCAACGCC3720CGTAGCGCAGTCTCGGCCTCCTTGCCGTTC3780AGCCAGATGGAGCTGCATCTGGACCATGCG3840GGCCGCGTCGGCCTCACTGCCGAGGTCAGC3900TCGGTGCTTGGCCGAAATTTCGCACGGCTG3960CAGTTGGCCGGTGTTCGAGTGGCCTCCAGC4020GACGATACGCGCACCGGTCCTTTGCTGGGG4080CAAGCCGCCCAGCCGATTAGCCCGCAGGCA4140ATCATCCCGGAGAGCATGGCCGMCTTGAT4200CGACGGGACGTACTGCTGAAAGCMTCGAA4260GMGCTGGCGCCTTGCTGGAGGGTCCGGCG4320GCCACCCTTGCCGAGGCGTCCTCGCTATGG4380ATGGTCGACCTGCTGCACCAGTTGCGGCAA4440CGCATCATTCCTGGCGCACGTGTGGAGATC4500GTGGTCAGCCATGCCATTGGTCATTACGCG4560CTGCGTCGCAAGATTCCCGGGCTGGGCGAG4620GTGAATCAGGTTCGCTTCGTGTTCGAMTG4680GCGCTGGAGGTCAAACAGCACGCGCAGGCT4740GGTGCAATGGCCTGGCGTGATGCGCTCGTT4800CTGGCGGCTATCGCTGTGCACAATACCGAC4860CCGCTGCTGAATGTGGCAGCTACGGCAGTG4920CAGTTCCGTTATGGGCTGTACGATCGTATC4980CGTGCACTGCGACAGTCACTGGACCCTTTG5040CAGGTGGTGGGTGTGCAGGCGCTCGGGCAACCGGTCTCGCCGCGCGGCGAACGGCCCAGGCGCCATCTCCAGATGGGCGTCGTGCCGGTTCTGACACGGTTCGAGGAGCAGACCCAGCGCTTAGCAGATGCAGTGAGTGGCGCACAGGCCGCCAGGCTTGCACCCGCAGACGACGGCGTGCATCGTAGGCTCGCTTCGCTGCAGGCCTGTCTGGACMGGCATACGACGACTTCCGCACCGACATTGCGGCGGTTCAACATGCGTTCGAAACGCTGGTGTCTGCAGTCGACGTTCTCTTGGACCGAGAGCTCCGGGATATGGACGACAGGCTGGGCCAGGCCTCTGAGCTGGAGCGCAGGGAGGTCCGGAACGMGCGCTGCAGGTATTGAAAGCGATTGATGCGGAGGGCMGGCAGAGGACGCCTTGCAGCAGATGGCTGCGACCCGTGATAGTCTTTGCGCCCGGCTGGCAGACGATACACTTGCCGCGCGATCGGTCGTGATGCAGGCAATAGTGGCCATGCTGAAGGAATTGTCGGGCAGCCAGATCACGTCGGGCCAGGAGTAACGTCAGAGGGCGAACATTCCCTCATCCGTT5100CTGMGGMGCGCGCGACCTGGAATTCGAA5160GGCCCACACCTGCGCGCCTTGACGCGCGAC5220ACCGTGGCACAGTATCTGGCACACGACGCT5280AATGTAGGCGAACGCATCAATCMTTGTTG5340ACCGAGGCAGCTATCACCGGATCAGGCCTG5400CGCGATGCTGTGCATCAGGCAACCGATGCG5460CACATGGACGCCAGTCGCGCCGAGMCAGG5520TTTCTACAGCGCGCTGCCGAGTGCGATCAC5580CGTCGGACCGCAGAAATATATGAGGTGCAG5640CTGGACGACTTGCTGCCGCGTCTCGATGGA5700GCTTTTGAAGATGCCGMCAACGCCTTGTA5760GACAGGCATGCTGGGGGGACGGACGCTGCA5820GCCATCAAGACACTTGMGATGCGATGAAG5880GATCGCATCGCAGAGCTCGTGTCGTTGAM5940GTCGGGGCGTTGCGCGACATCGACGAGCAT6000GCGCGTGATCTGGGCGCCGGTGCGCATGCC6060GATGACGATGCCCCGGGCCAGGACGTCGCC61206150序列2:MetThr1ThrProSerArgProAlaAlaLeuArgMetSerLeuGluSerAspArgThrlieValGlu蛋白质序列LeuProAspSerThrProArgHisHisMetSerAspProArgLeuAlaAlaValLeuGluLeuAspGlyArg5Glu20Pro35Gly50Gin65Glu80Ala95Gly110Ser125Leu140Thr155ProGluArgAsnGlyCysGlyArgLeuGlylieThrArgSerSerGinSerArgGin1015AlaGluProAlaThrAlaSerProGin2530ThrAlaAlaAsplieLeuGlyAlaLeu4045ArgAlaSerSerLysThrAlaAsnAla5560ValSerSerHisGlyGlyArgArgAla7075AlaAlaAlaAlaAspGlyAspValThr8590LeuAlaArgArgProValValHisSer100105GlyGlyArgLeuLeuArgTyrMetPro115120MetProArgAsnGluAlaPhePheThr130135lieAlaAlaLeuThrValHisProAla145150ThrThrProThrAlaAspGinValAla16016512SerGinGinAlaHisArgProAlaAlaAspAlaGlyGlyAlaHisAlaValValSerThrAlaValMetArgArgProLeuSerGlyArgGinProGluGlyVaJLeuHisTyrProGlyProArgAlaProLeuAlaValCysGlyAsnLeuGlyGluProLeuGlyMetThrArgAlaLeuAspSerGlyGlySerAlaAspGluAspGlyGluLeuValLeuAlaValSerGlyAspliePheGinGlyProAlaPheArgAsp170Gly185Ala200Ala215Val230Gin245Arg260Leu275Thr290Met305Leu320Gly335Ser350His365Ser380Met395Met410His425Ser440Pro455Val470Leu485ProGinSerlieTyrMetPheArgArgProAspProGluSerLeuLeuProAlaProLeuAspValProCysGlyAlaValSerAspArgProValAsplieGinValGinAspAlaGinAsnThrArgGluliePheHisHisArglieAlaCysValAspLysValGlyHisArgArgAspLeuGinGlyArgLeuGlyAlaTrpLeuAlaAlaAspAspAlaValGlyAlaTrpLeuProProGluGlyProValProLysGin175Leu190Ala205Cys220Gly235Val250Gly265Asp280Gly295Leu310Arg325Arg340Ala355Leu370Ala385Leu400Ala415His430Trp445Val460Val475Leu490LeuArgAlaMetGluGlyArgAspGlyProValArgValLeuGlyLeuMetLeuGluSerPheProThrAlaValLeuLeuProProGinProLeuTyrLeuThrGluGinLeuGinAspArgLeuAlaGlyGlyAsnProGlyCysThrCysProAlaAlaGluThrSerHisAlaMetSerGlyLeuHisLeuiVrglieGinLeuArgTrpProMetGlyPheHisAlaLeuMetSerGinArgArgValThrSerLeuThrTrp180Leu195Pro210Gin225Arg240Glu255Leu270Arg285Glu300Ala315Asp330Pro345Gly360Asp375Phe390Ser405Val420Leu435Leu450Gly465Ala■Thr495<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>LyslieAlaAspArgAlaThrThrCyslieLeuThrSerHisGlyArgAlaCysValAspGinSerArgGluGluValSerlieArgMetPheThrSerThrGlyGluLysAspLysAlaProGlyArgThrGlyGlyAlaValAlaAlaArgAlaLeuAspGlyLeuAlaGlylieSerGinAlaGlyThrProLeuPheGlyGluGinAlaMetLeuThrLeuAlaLeuGluThrLeuAspArgTrplieAspAlaGlySerGluArg830Cys845Leu860Asn875Leu890Glu905Lys920Asp935Ala950Ala965Arg980Ala995ProGly1010SerPro1025ValLeu1040ValArg1055MetAsp1070HisAla1085AlaGly1100SerGly1115ThrGly1130AlaThr1145ThrTrpSerAlaHisAlaAlaSerAlaAlaPheGlyGinArgAspGlyAlaAlaSerLeuLeuLeuAspSerGlyGinSerLeuLeuLeuThrAlaTrpValArgArgAspGlyGinGlySerMetGluAlaAspAlaAlaAspAlaAsnGlyValAlaHisGlyLeuAlaAlaMetAlaLeuValAspGluAlaLysValArgAlaLeuGluProValAlaGlyValGlyAlaSerSerProLeuGluLeuHisAsnAspGlyAla835Ser850Arg865Leu880Ser895Ala910Arg925Pro940Tyr955Ala970Leu985ValThr1000GinLeu1015ProAsp1030PheAsn1045LeuArg1060ValSer1075GluArg1090PhePhe1105lieArg1120TyrAsp1135AlaAla1150AspThrAlaHisHisLeuProAlaAlaAlaLeuThrGinGluArgGlyVallieVallieAlaAsnPheAlaValLeuProArglieLeuLeuArgSerPheLeuMetSerSerGlyGlyArgAspAspLeuSerSerMetAspGinGluArgArgLeuGinSerArgLeuAlaThrLeuMetAspHisLeuProSerMet840Tyr855Arg870Arg885Ala900Val915Asn930Ser945Asp960Arg975Trp990Glu1005Lys1020Ala1035Phe1050Gly1065Gly1080Ser1095Ala1110Arg1125Ala1140Ala115515GlyGlyThrProSerThrAspAspAspAlalieGlyAsnValAsnGlyProArgGlyThrAspSerMetThrHisLeuAspGlyArgValSerGlyAlaValAsnAlaArgValAlaAspAspThrArgThrLeuTrpAspAlaMetAlaGluArgArgAspGinAlaArgLeuAlaGinAlaSerSerMetValAspTyrGinHis1160lieProGlu1175ThrThrLys1190LeuAspLeu1205LeuThrLeu1220GinProVal1235AsnProArg1250AlaGinAla1265HisAlaTrp1280GlyLeuThr1295LeuThrSer1310ValThrGly1325SerSerAsp1340ArgThrGly1355AspThrGin1370MetArgLys1385LeuAspGly1400ValLeuLeu1415AlalieGlu1430GinArgAla1445LeuTrpLys1460LeuLeuHis1475GlyValGlyPheAlaArgLeuLeuArgPheGluThrGinProLeuAlaProAsnSerAlaValGlyValGinGinGlulieAlaGluValValLeuGlyAlaGlyAsnValGinLeuProLeuLeuAlaAlaGinArgLeuGluMetArgTyrLysAlalieAlaGlyAlaCysAlaGluGlyGlySerGinLeuArgAlaAlaVal1165LeuLeuPhe1180AlaGlyVal1195AsnAlaAsn1210AlaValArg1225AlaAlaPro1240SerAlaSer1255TrpSerGin1270lieGlyLeu1285SerSerGly1300ArgAsnPhe1315LeuGinLeu1330ProThrAsp1345GlyThrAla1360ProlieSer1375Glulielie1390ProAlaThr1405GluArglie1420LeuLeuGlu1435GinAlaThr1450ProSerGlu1465GinGluAsp1480lieLeuSer1170AspArgHis1185AsnGluGly1200GlySerLeu1215HisSerTyr1230AspAlaAla1245LeuProPhe1260MetGluLeu1275GluPheGin1290lieAsnLeu1305AlaArgLeu1320AlaGlyVal1335AlaProLeu1350SerTyrLys1365ProGinAla1380ProGluSer1395ProGlyGlu1410GinGlyAla1425GlyProAla1440LeuAlaGlu1455ArgAlaAla1470AlaAlaAla1485lieGinAsnMetlieGlyLeuArgLysAspArgProGinHisGlyAlaProAspGluAsnAlaAlaGinPheLeuGluGinVallieProLeuLysGlyValLeuThrLeuAlaAsnValAlaAspHisArgGinPheHisArgValGinAlaMetLeuProThrArgAlaValSerGluValArgHisGlyAspArgArgGlyTyrLysProAlaGinAlaTyrValAlaTyrGlyGlySerAlaProPheAspGluGlyLeuAlaArg1490ArgGlu1505AlaLeu1520liePro1535AsnVal1550lieVal1565AlaAla1580TrpArg1595ArgLeu1610ThrSer1625ValSer1640GlyLeu1655ValArg1670ValGin1685ValPro1700ArgAsp1715ValGly1730GluGlu1745AlaLeu1760Arglie1775ValThr1790AlaSer1805lieSerGlyGlyAsnAlaAlaAspAlaArgSerTyrAlaAlaValLeuProGinAlaAsnGluLeulieLeuGluLeuGinlieAlaAlaAlaValHisAspLeuLeuSerGluHisThrAspGinAlaGinProAspLysGlyValAsnLeuLeulieGlyGinArgArgGlyProPheLeuGinAlaLeuAlaAlaGlyAla1495AlaVal1510MetArg1525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