专利名称：植物雄性不育系及其恢复系的培育方法
技术领域：
本发明涉及植物雄性不育系及其恢复系的培育方法。
背景技术：
从上世纪70年代以来，杂种优势利用为我国水稻生产做出了重大的贡献。面临我 国经济发展对农业生产所提出“高产、优质、高效、安全、生态”的新的重大需求，能否进一步 发掘杂种优势的应用潜力以应对，就成为摆在当代科学家面前的一个严峻挑战。杂种优势的形成基于两个不同亲本的组合。要在现有应用的基础上进一步发掘其 潜力，除了需要加强杂种优势形成机制的研究之外，还急需建立有效的方法来创造雄性不 育性状，以便有效扩大杂交组合的筛选和优秀组合在生产上的应用。目前，在育种工作和生产上广泛应用的雄性不育性状多来自于自然突变及其性状 转育株系。雄性不育性状的来源十分有限，是扩大杂交组合筛选特别是应用的严重制约因 子。虽然在20世纪90年代初美国科学家就已经证明通过生物技术的方法可以创制人工控 制的雄性不育性状，但是，按照目前国际通行的规则，所有具有应用潜力的创新都受到知识 产权保护。因此，寻找新的、具有自主知识产权的创制人工控制雄性不育性状的思路和方 法，已经成为希望把握发掘杂种优势应用潜力主动权的国家和地区所面临的无法回避、亟 待解决的关键问题之一。长期以来，人们一直利用常规育种的方法选育不育系，或者把不育性从一个品种 转育到另一个品种中，这些方法周期长、见效慢，不能满足生产发展的迫切需要。目前，也有 许多控制植物雄性不育性的基因被克隆，但是由于植物的不育性受核基因、线粒体基因、叶 绿体基因和环境因素的影响，作用机理比较复杂，人们对其认识还不足，所以难在短期内获 得明显的效果，基因工程雄性不育与用常规方法选育雄性不育相比具有一些特点选育周 期缩短，育性相对稳定，受环境影响小，对基因型依赖少，环境污染少。Mariani等人在1990 年开创了一个创造植物雄性不育的新途径。他们应用来自于烟草的花药绒毡层特异启动子 (TA29)和核糖核酸酶基因(Barnase)嵌合后转化烟草和油菜，由于核糖核酸酶的作用，转 基因烟草和油菜的花药绒毡层被破坏，形成花粉败育，而转基因烟草的其他器官发育正常。 目前除了 Barnase基因以外，还有许多其他功能基因被应用于基因工程雄性不育的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种培育雄性不育系植物的方法。本发明提供的培育雄性不育系植物的方法，是将含有如下表达盒的重组表达载体 导入目的植物中得到所述雄性不育系植物从上游至下游依次包括loxp位点、花药或雄 蕊器官原基特异启动子、乙烯受体ETRl蛋白的编码基因的反向互补基因、终止子和Ioxp位
点ο进一步，上述表达盒中，Ioxp位点的核苷酸序列如序列表中序列3的第7-40位所 示、花药或雄蕊器官原基特异启动子的核苷酸序列如序列表中序列1所示、乙烯受体ETRl
3蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。更进一步，上述重组表达载体的构建方法是将所述启动子和所述乙烯受体ETRl蛋白的编码基因的反向互补基因插入一中间 载体的多克隆位点间(具体是启动子插入EcoRI和SacI位点间；乙烯受体ETRl蛋白的编 码基因的反向互补基因插入BglII和SpeI位点间)，得到所述重组表达载体； 所述中间载体是将序列表中序列3所示的片段插入PCAMB2300质粒的多克隆位点 间(如pvsl sta和SmaI酶切位点间)，得到所述中间载体。上述目的植物为双子叶植物或单子叶植物，优选是拟南芥。本发明另一目的在于提供一种培育上述方法得到的不育系的恢复系的方法。本发明提供的培育上述恢复系的方法是，是将Cre基因导入上述目的植物中，得 到所述恢复系，所述Cre基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。具体地讲，上述Cre基因是通过一表达载体导入植物中的所述表达载体是将序 列表中序列4所示的Cre基因片段插入pCAMBIA2300的多克隆位点间(如XbaI和BamHI 酶切位点间)，得到所述表达载体。本发明利用CRE/loxP位点特异性重组系统，在IoxP位点的两端连接器官特异性 启动子AP3介导的反义ETR1，成功构建转基因拟南芥雄性不育系；将构建的带有35S启动 子介导的CRE基因的拟南芥恢复系与上述转基因雄性不育系杂交，删除拟南芥Fl代中的不 育基因，恢复拟南芥Fl代的育性(表4)。本发明对构建的转基因拟南芥不育系花器官的形态观察，亚历山大染色镜检花 粉，花粉萌发实验发现转基因拟南芥不育系花丝明显缩短，花药萎缩，可育花粉大量减少， 花粉无法正常萌发(萌发率仅为2. 67% )，结实率相对于对照植株明显降低，育性表现为半 不育或全不育。而Fl代表现为育性恢复。这样，利用CRE/loxP系统，我们可以人工构建雄性不育系和恢复系，形成利用雄 性不育，创建新的种质资源的方法。本发明是将基础研究的发现(器官特异性ETRl表达下调可导致雄性不育)转换 为应用领域具有源头创新性的新思路和新方法，为发掘杂种优势应用潜力和今后的精确育 种积累了新的经验。
图1为AP3启动子的电泳图；M为Marker 15000 ；1 以野生型拟南芥总基因组DNA 为模版扩增的AP3启动子片段。图2为aETRl基因(简称ETR1)的获得，M =Marker 2000plus ；1 以野生型拟南芥 总RNA反转录后的cDNA为模板扩增的ETRl片段。图 3 为中间载体 IoxP-MCS-IoxP (pCAMBIA2300)的验证，M =Marker 15000 ；1 IoxP-MCS-IoxP(pCAMBIA2300)质粒为模版扩增的 loxP-MCS-loxP 片段(156bp)。图 4 为重组表达载体 loxP-PAP3 :antiETRl_loxP(pCAMBIA2300)图谱。图 5 为 loxP-PAP3: :antiETRl-loxP(pCAMBIA2300)载体验证 M :Marker 2000plus ；1 以1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP质粒为模版扩增的AP3启动子片段 (727bp)2 :1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP 质粒为模版扩增的 AtETRl 片段(2217bp)3 loxP-PAP3: :antiETRl-loxP质粒为对象，双酶切得到AP3启动子酶切产物；4 loxP-PAP3: :antiETRl-loxP质粒电泳图；5 以 1οχΡ_ΡΑΡ3: antiETRl_loxP质粒为对象，双 酶切得到PAP3 :antiETRl片段；6 以1οχΡ_ΡΑΡ3: antiETRl-loxP质粒为对象，双酶切得到 ETRl基因片段。图6为阳性转1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP基因拟南芥苗潮霉素抗性筛选图片。图7为阳性转1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP基因拟南芥基因组鉴定，M Marker2000plus ； 1-9 具不育表型的阳性转基因拟南芥的基因组为模板PCR扩增；10-13 无不育表型的转基因阳性拟南芥的基因组PCR扩增；14 以野生型拟南芥基因组为模板PCR 扩增(对照)。图8为阳性转1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP拟南芥的表型观察，A，E 拟南芥花序 上花；(左野生型。右转基因拟南芥)B，F 花序下第一朵花；(左野生型。右转基因拟 南芥)C，G 花序下第三朵花；(左野生型。右转基因拟南芥)D，H 野生型的角果和转基 因植株角果；I 野生型拟南芥和阳性转loxP-PAP3: :antiETRl-loXP拟南芥全株水平比较。图9为阳性转1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP植株与野生型植株花粉活力与花粉萌 发比较，A 野生型拟南芥花粉亚历山大染色，野生型花粉有活性，呈现紫红色，外形为圆形， 颗粒饱满，整个花药饱满；B 阳性转PAP3 :antiETRl基因拟南芥的花粉亚历山大染色，转基 因拟南芥花粉没有活性，呈现绿色，而且花粉外形不规则，同时发现花药呈萎缩状。图10为阳性转1οχΡ-ΡΑΡ3: antiAtETRl-loxP植株与野生型植株花粉萌发比较， A是野生型；B是转基因型。图11为转基因雄性不育拟南芥心皮及雄蕊育性检测，A 阳性转 loxP-PAP3: :antiETRl-loXP基因拟南芥雌蕊授野生型花粉；B 图A局部放大图，图中显示， 转基因拟南芥授粉后得到正常角果；C 野生型植株心皮授转基因雄性不育株系花粉(箭头 所指的为授粉后所发育的角果)；D 图C局部放大图；野生型拟南芥授不育拟南芥花粉后 未得到正常角果；E 阳性转loxP-PAP3: :antiETRl-loXP不育植株授自身花粉；F 图E局部 放大图；图F显示不育植株授自身花粉未得到正常角果。图12为Cre基因的获得，M =Marker 15000 ；1 以ρ匪23质粒为模版扩增的Cre片段。图 13 为 35S =CRE 载体鉴定 M =Marker 2000plus ；1 以 pMM23 质粒为模版，XbaI/ BamHI双酶切35S =CRE得到CRE酶切产物；2 以ρ匪23质粒为模版扩增的Cre片段。图14为转基因雄性不育系X野生型杂交后代插入片段检测，M=Marker 2000plUsl-30 以转基因雄性不育系X野生型杂交Fl代基因组为模板进行基因组PCR.检 测目标为loxP-PAP3 :antiETRl-l0XP片段(3500bp)，图中可以看出，Fl代中，该片段依然存 在。图15为阳性转1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP基因雄性不育拟南芥和阳性转35S Cre基因恢复系杂交后代基因组检测，A 阳性转1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP出现雄性不 育表型拟南芥的与阳性转35S:Cre基因恢复系杂交后代得基因组为模板PCR扩增(检 测Cre基因)，图中显示，在Fl代基因组中Cre片段依然存在(箭头所指)；B 阳性转 loxP-PAP3: :antiETRl-loxP出现雄性不育表型拟南芥的与阳性转35S =Cre基因恢复系杂 交后代得基因组为模板PCR扩增(检测AP3ETR1序列检测IoxP之间插入片段)图中显示，在Fl代基因组中loxP-PAP3: :antiETRl-loxP片段已经被删除(箭头所指)。图16为阳性转1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP雄性不育植株分别授35S CRE花粉和野生型拟南芥花粉后得到的Fl代生长情况，图A中的图A-I植株为 loxP-PAP3: :antiETRl-loxPX35S =CRE Fl代图中可以看到转基因不育植株与恢复系杂交 后代育性与预期结果相同，即转基因不育系X恢复杂交后代可以正常生长，得到下一代； 图A-2植株为loxP-PAP3: :antiETRl-loxPXWT Fl代图中可以看到转基因不育植株与野生 型杂交后代育性与预期结果相同，即转基因不育系X恢复杂交后代为不育系植株；图B为 图A部分放大图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。本发明中，IoxP-MCS-IoxP(pCAMBIA2300)与pCAMBIA2300-loxP-MCS_loxP 的 含义相同；loxP-PAP3 :antiETRl-loxP(pCAMBIA2300)与 pCAMBIA2300-loxP_PAP3 antiETRl-loxP的含义相同。实施例1、不育系的获得及其验证一、不育系的获得(一)重组载体的构建1、AP3启动子克隆利用NCBI上的拟南芥AP3启动子序列，设计一对引物如下AP3F 5' -AACCATGGAACTTGTGATTCCTTCTTAAAC-3，；AP3R 5' -AA GGATCC ATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC-3，。U M ^ (Arabidopsis ecotype Col-O ； _ 自 Arabidopsis Biological ResourceCenter,USA)的基因组DNA为模板，采用上述引物对，通过PCR方法获得有AP3启 动子功能的部分序列，PCR产物(717bp)的电泳图见图1。经测序鉴定正确。除去引入的酶 切位点，PCR产物的核苷酸序列见序列表的序列1，命名为AP3。2、乙烯受体atETRl基因的获得利用NCBI上检索到拟南芥的ETRl基因(Atlg66340)，设计特异引物如下atETRIF 5' -CCTTAATTAAATGGAAGTCTGCAATTGTATT-3'；atETRlR :5’ -ACCATGGTTACATGCCCTCGTACAG-3，。将拟南芥Col-O总RNA反转录成cDNA，用上述引物对针对该cDNA进行PCR扩增， PCR产物(2217bp)的电泳图见图2。经测序鉴定正确。除去引入的酶切位点，PCR产物的 核苷酸序列见序列表的序列2，命名为atETRl。3、中间载体 loxP-MCS_loxP(pCAMBIA2300)的构建首先设计两端带有IoxP位点的多克隆位点碱基序列loxP-MCS-loxP (序列表中序 列3所示，Ioxp位点的核苷酸序列是序列表中序列3的第7-40位和第111-143位；MCS多 克隆位点是第41-142位)将该序列克隆到pGEM-TEasy载体，测序无误。将IoxP-MCS-IoxP序列从克隆载体上切下，连入pCAMBIA2300质粒(http //www.cambia. org, au)的 pvsl sta 和 SmaI 酶切位点间(这样 loxP-MCS-loxP 可替代 pCAMB2300 中35s =GFP序列)，构建成的中间载体，命名为IoxP-MCS-IoxP(pCAMBIA2300)。中间载体IoxP-MCS-IoxP (pCAMBIA2300)经 PCR 验证，结构正确(图 3)。4、构建重组表达载体 loxP-PAP3 :antiETRl_loxP (pCAMBIA2300)将步骤1得到的AP3启动子和步骤2得到的atETRl分别插入步骤3的中间载体的 EcoRI和SacI位点间以及BglII和SpeI位点间(也即将将步骤1得到的AP3启动子和步骤 2得到的atETRl插入了两个Ioxp位点间)，获得重组表达载体(图4)，命名为1οχΡ_ΡΑΡ3 antiETRl-loxP (pCAMBIA2300)。将该载体经PCR验证和酶切验证，结构正确(图5)。(二)不育系的获得将构建好的转基因质粒(loxP-PAP3 :antiETRl_loxP (pCAMBIA2300))利用农杆菌 介导的Floral Tip法转入拟南芥(Col)。将发育中的花组织直接浸入含5 %蔗糖和200 μ 1/ 1表面活性剂Silwet L-77的过夜培养农杆菌液中。经过带有潮霉素Hyg+(50mg/L)的平 板筛选(图6)获得33株具有潮霉素抗性的再生植株，将再生转化植株转移到温室中生长。 经过一段时间生长得到的9株转基因拟南芥出现了不育表型。为了鉴定具有潮霉素抗性的转基因拟南芥是否确实转入 1οχΡ-ΡΑΡ3 antiETRl-loxP片段，我们对转基因阳性拟南芥苗进行了基因组PCR检 测。因为鉴定阳性苗基因组中loxP-PAP3: :antiETRl-loxP片段的PCR引物是根 据loxP-PAP3: :antiETRl-loxP片段的DNA序列特点设计(正向引物设计在AP3 上，具体是AACCATGGAACTTGTGATTCCTTCTTAAAC ；反向引物在atETRl上，具体是 ACCATGGTTACATGCCCTCGTACAG)的，因此以拟南芥的基因组为模板的PCR扩增反应中，只有 整合有loxP-PAP3: :antiETRl-loXP片段的基因组DNA才会有对应的特异大小的条带出现。 检测结果表明，9株出现雄性不育表型的转基因抗性植株均有预期的特异条带扩增，而随机 选择4株未出现雄性不育表型的转基因抗性植株也有预期的特异条带扩增；而野生型植株 对照无相应片段的扩增(图7)。实验初步说明9个雄性不育表型抗性植株为阳性转基因
田ο二、不育系的表型观察1、花器官形态观察利用常规石蜡切片技术，对上述9株阳性转1οχΡ-ΡΑΡ3: antiETRl-loxP基因雄性 不育植株与野生型植株花器官形态比较，结果如图8 (由于9株表型一致，所以图8只显示 了 1株的结果)所示，阳性转loxP-PAP3: :antiETRl-loxP基因植株花朵外形结构正常，花 萼、花瓣完整，雌蕊早期发育与正常野生型植株之间并无明显差异，但是随着植株进一步的 生长，转基因植株花丝明显比野生型花丝短，并且开始出现花药萎缩现象；在全株水平上， 可以看出转基因植株出现严重的不育表型，结实率相对于对照植株明显降低，育性表现为 半不育或全不育。2、亚历山大染色镜检花粉形态利用亚历山大染色镜检对转基因植株的花粉形态进行更精细的观察。结果发现， 出现雄性不育表型的9株转基因植株花药萎缩，外形不规则，花药内可育花粉含量很少，并 且在花粉染色实验中大部分花粉被染成绿色，说明这部分花粉没有生活力(图9)；而野生 型植株则表现花药结构饱满，花粉颗粒饱满、表面结构光滑，在花粉染色实验中花粉被染成
7紫红色，说明这部分花粉有活力。3、花粉萌发实验实验步骤取离体拟南芥花粉悬于萌发液中(10%蔗糖，IOOml加1_2滴0. 硼 酸，lmmol/L CaCl2, lmmol/L Ca (NO)3, Immo 1/L MgSO4)，用 KOH 调至 pH 值 6. 5。于 25C 光照 培养箱中，以30转轻摇4小时。镜下观察并统计萌发率。在离体条件下，通过对培养基上培养24小时的花粉进行观察，发现野生型植株花 粉的花粉管可以伸长，其萌发率可以达到41% ；而出现雄性不育表型的转基因植株花粉萌 发率仅为2. 67% (表1)，仅有少数花粉发芽且花粉管短(图10)。表1.花粉萌发情况统计表
权利要求
一种培育雄性不育系植物的方法，是将含有如下表达盒的重组表达载体导入目的植物中得到所述雄性不育系植物从上游至下游依次包括loxp位点、花药或雄蕊器官原基特异启动子、乙烯受体ETR1蛋白的编码基因的反向互补基因、终止子和loxp位点。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述表达盒中，Ioxp位点的核苷酸序列如序 列表中序列3的第7-40位所示、花药或雄蕊器官原基特异启动子的核苷酸序列如序列表中 序列1所示、乙烯受体ETRl蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述重组表达载体的构建方法是将所述启动子和所述乙烯受体ETRl蛋白的编码基因的反向互补基因插入一中间载体 的多克隆位点间，得到所述重组表达载体；所述中间载体是将序列表中序列3所示的片段插入PCAMB2300质粒的多克隆位点间， 得到所述中间载体。
4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物为双子叶植物或单 子叶植物，优选是拟南芥。
5.一种培育权利要求1-4中任一所述方法得到的不育系的恢复系的方法，是将Cre基 因导入权利要求1-4中任一所述方法中的目的植物中，得到所述恢复系，所述Cre基因的核 苷酸序列如序列表中序列4所示。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述Cre基因是通过一表达载体导入植物 中的所述表达载体是将序列表中序列4所示的Cre基因片段插入pCAMBIA2300的多克隆 位点间，得到所述表达载体。
全文摘要
本发明公开了一种植物雄性不育系及其恢复系的培育方法。该方法，是将含有一表达盒的重组表达载体导入目的植物中得到所述雄性不育系植物；所述表达盒从上游至下游依次包括loxp位点、花药或雄蕊器官原基特异启动子、乙烯受体ETR1蛋白的编码基因的反向互补基因、终止子和loxp位点。本发明还构建了上述不育系的恢复系，是将Cre基因导入上述目的植物中，得到恢复系。实验证明将恢复系和不育系杂交后，恢复F1代的育性，由此创造一个新的，具有自主知识产权(不育系创制方法)、同时方便可行的雄性不育与杂种优势利用的技术体系。该发明将基础研究的发现转换为应用领域，为发掘杂种优势应用潜力和今后的精确育种提供了新的视角和经验。
文档编号A01H5/00GK101948861SQ20101026357
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月26日 优先权日2010年8月26日
发明者李曦, 王东辉, 白书农, 许智宏 申请人:北京大学