专利名称：对循环肿瘤细胞进行分类的方法
对循环肿瘤细胞进行分类的方法发明背景发明领域本发明总体涉及医学诊断，更具体涉及循环肿瘤细胞的分类。背景信息循环肿瘤细胞(CTC)通常是——虽然不是总是——进入不同类型癌症患者血流的浓度非常低的源自实体肿瘤的上皮细胞。已存在的肿瘤转移或释放CTC通常导致继发性肿瘤形成。继发性肿瘤一般检测不到，并且占全部癌症死亡的90%。循环肿瘤细胞提供原发性与转移性肿瘤之间的联系。这产生将循环肿瘤细胞的鉴定和表征用于转移性上皮恶性肿瘤的早期检测和治疗控制的前景。癌症患者的CTC检测提供早期诊断原发性或继发性癌症生长和确定进行癌症治疗的癌症患者的预后的有效工具，因为这些患者血液中存在的CTC 的数量和特征与整体预后和对治疗的反应相关联。因此，CTC在临床症状出现前充当肿瘤扩大或转移的早期指示物。虽然循环肿瘤细胞(CTC)的检测在癌症的控制和治疗中具有重要的预后意义和潜在治疗意义，但由于其在血液流中的隐匿性质，这些微量的细胞不容易被检测到。CTC首次被描述是在19世纪，然而只是最近的技术进步允许其可靠检测。CTC被认为以超低浓度存在于肿瘤患者的外周血液中。例如，对于癌(carcinomas)患者，据估计每一千万正常血液细胞中有一个是CTC。CTC计数/表征的标准方法是靶向表面蛋白EpCam的免疫磁性富集法、光纤阵列扫描技术和“ CTC芯片”分析。免疫磁性富集技术依赖于利用铁磁流体进行的肿瘤细胞群免疫磁性富集，该铁磁流体连接于结合上皮细胞粘着分子(EpCAM)的抗体，该上皮细胞粘着分子仅在上皮衍生细胞上表达。在进行光纤阵列扫描技术(FAST)以检测CTC中，将红细胞溶解，并且将有核细胞在可容纳多达3千万个细胞的载玻片上分布为单层。该方法中无富集步骤。将细胞固定， 透化处理，并用全(pan)抗细胞角蛋白抗体-Alexa Fluor 555、CD45_Alexa Fluor 647和 DAPI (核染色)进行染色。FAST扫描各载玻片，并确定各红色荧光物在载玻片上的位置。各荧光物通过自动数字显微镜成像，并且CTC作为CK+、⑶45-、DAPI+细胞被计数。CTC计数/表征的另一种方法是微流体或“CTC-芯片”技术。在这种方法中，全血流经78，000个EpCam涂覆的微柱。EpCam+细胞粘附至该柱，随后用细胞角蛋白、⑶45和 DAPI染色。利用上皮特异性标记如细胞角蛋白和EpCAM和/或组织特异性标记如PSA、PSMA、 ⑶X2和TTF-I鉴定CTC的分析已在本领域中被述及。暴露(revealing)和检测CTC的分析也已被述及在例如2009年9月3日提交的美国序号12/553，733中，在此引入作为参考。暴露样品中的CTC包括去除、降解或改变聚集或物理结合于循环肿瘤细胞表面的蛋白质、碳水化合物、细胞或其组合以显露细胞，从而暴露循环肿瘤细胞。暴露细胞可包括去除、降解或改变血浆蛋白、碳水化合物、血小板、其他血细胞或其组合。一般，血浆蛋白是凝血因子， 如纤维蛋白。为显露细胞，可以对细胞进行酶(例如，酶介导的生化反应)处理、机械(例如，机械力)处理、电(例如，电力)处理、电磁(例如，电磁波谱的电磁辐射)处理、化学处理或其任意组合。暴露的细胞可通过图像分析和/或细胞表面标记的检测被进一步分析。在癌症领域中，暴露、分离、检测、鉴定和富集循环肿瘤细胞(CTC)的方法一直在发展。但是，随着作出改进，需要利用越来越大量集合在一起的CTC信息的改进分析方法。 因此，用于临床、研究和发展定位(development settings)的改进的有临床意义的CTC分析方法以及癌症治疗的创新方法是有必要的。发明概述本发明提供利用多种细胞标记和暴露或非暴露分析对CTC进行分类的方法，其为癌症患者的临床分期和治疗决策制定提供有益见解。因此，一方面，本发明提供对来自对象的循环肿瘤细胞(CTC)进行分类的方法。该方法包括a)提供来自对象的第一和第二样品；b)暴露第一样品中的CTC ；C)利用对第一细胞标记特异的试剂分析第一样品中暴露的CTC ；d)利用对第一或第二细胞标记特异的试剂分析第二样品中的CTC，其中第二样品的CTC在分析前没有被暴露或显露；和e)比较C) 和d)的结果以提供来自对象的CTC分类，从而对CTC进行分类。该方法可进一步包括将e) 的结果与来自对象的CTC之前分类或与已知分类进行比较。本发明进一步提供预测对象的癌症的方法。该方法包括a)提供来自对象的第一和第二样品；b)暴露第一样品中的CTC ;c)利用对第一细胞标记特异的试剂分析第一样品中暴露的CTC ；d)利用对第一或第二细胞标记特异的试剂分析第二样品的CTC，其中第二样品的CTC在分析前没有被暴露或显露；和e)比较C)和d)的结果以提供来自对象的CTC的分类；和f)确定预后，从而预测对象的癌症。该方法可进一步包括将e)的结果与来自对象的CTC的之前分类或与已知分类进行比较。本发明进一步提供确定对象对具体治疗方案的反应性的方法。该方法包括a)提供来自对象的第一和第二样品；b)暴露第一样品中的CTC ；c)利用对第一细胞标记特异的试剂分析第一样品中暴露的CTC ；d)利用对第一或第二细胞标记特异的试剂分析第二样品的CTC，其中第二样品的CTC在分析前没有被暴露显露；和e)比较c)和d)的结果以提供来自对象的CTC的分类；和f)确定对象对治疗方案的反应性。该方法可进一步包括将e) 的结果与来自对象的CTC之前分类或与已知分类进行比较。本发明进一步提供确定候选试剂在癌症治疗中的有效性的方法。该方法包括a) 提供来自对象的第一和第二样品；b)暴露第一样品中的CTC ;c)利用对第一细胞标记特异的试剂分析第一样品中暴露的CTC ；d)利用对第一或第二细胞标记特异的试剂分析第二样品的CTC，其中第二样品的CTC在分析前没有被暴露或显露；和e)比较C)和d)的结果以提供来自对象的CTC分类；和f)确定候选试剂在癌症治疗中的有效性。该方法可进一步包括将e)的结果与来自对象的CTC之前分类或与已知分类进行比较。发明详述本发明提供利用多种细胞标记和暴露或非暴露分析对CTC进行分类的方法以及治疗和诊断癌症的方法。暴露方法使细胞膜被分子如纤维蛋白或糖类或被细胞如血小板和白细胞阻挡的CTC显露。发现循环中大量CTC仍不可检测，因为它们被聚集在CTC表面的细胞、蛋白质、生物分子和其他因子“遮蔽”或“遮盖”，作为有效的免疫逃逸机制，保护它们免受表面相互作用和/或细胞内抗体结合。例如，血小板、纤维蛋白和其他凝血蛋白充当“遮盖装置”以遮蔽或隐藏细胞表面上关键的细胞表面标记，使其逃脱利用现有方法进行的检测或观察，这解释了为什么利用现有方法检测到如此少的CTC。类似地，其他因素可实现CTC的遮蔽或隐藏，如举例来说，表面蛋白标记的糖基化或糖分子(来自除CTC本身外的物质)的吸附或细胞表面组分与其他生物分子的结合。暴露方法除去了这些阻挡分子和细胞，从而使CTC特异性标记对于标记特异性结合试剂更加可及，标记特异性结合试剂被预先标记或可用第二标记特异性检测或通过其他手段促进检测。然后利用这些可检测试剂鉴定CTC。通过用标记特异性结合试剂的不同组合利用暴露步骤或省略该暴露步骤进行分析，可能产生表征肿瘤及其分期和预测预后和对治疗的反应的新的有用信息。在对本组合物和方法进行描述前，要理解的是，本发明并不限于所描述的具体组合物、方法和实验条件，因为这些组合物、方法和条件可以变化。还要理解的是，本文所用的术语仅用于描述具体实施方式
的目的，并不意图进行限制，因为本发明的范围仅限于所附权利要求中。如本说明书和所附权利要求所用，除非上下文明确另外表示，单数形式“一个 (a)”、“一个(an)”和“所述(该，the)”包括复数指称。因此，例如，“所述(该)方法”的指称包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤，这在阅读本公开等之后对于本领域技术人员而言将变得明显。除非另外限定，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。尽管任何类似或等同于本文所述的那些方法和材料均可在本发明的实践或测试中使用，但现在描述的是优选的方法和材料。通常，“一个循环肿瘤细胞(a circulating tumor cell) ”的指称意欲指单个细胞，而“多个循环肿瘤细胞(circulating tumor cells) ”的指称意欲指一个以上细胞。然而，本领域技术人员将理解，“多个循环肿瘤细胞(circulating tumor cells) ”的指称意欲包括循环肿瘤细胞群，其包括一个或多个循环肿瘤细胞。如本文进一步所述，可利用可检测试剂的信号强度得到用于分类CTC的不同类型的信息。例如，由信号强度，可推导目标蛋白质(例如，细胞特异性标记、细胞内和细胞表面标记)的表达水平。此外，由信号强度，可推导具体样品中存在的遮蔽相对于显露的水平。 细胞表面标记和细胞内标记的信号强度提供这种信息。这是细胞内标记的情况，由于覆盖物(coat)(例如，遮蔽物(mask))可比细胞膜更坚固(例如，蛋白质网比脂质更坚固)的可能性，需要苛刻的条件对CTC进行去覆盖以暴露细胞内环境被降解或破坏的CTC。在特定比较中利用暴露分析和非暴露分析中检测的CTC的多种细胞标记的信号强度提供允许进行CTC分类的新的有用信息，从而获得允许预后和治疗决策的对患者癌症的见解。因此，一方面，本发明提供对来自对象的循环肿瘤细胞(CTC)进行分类的方法。该方法包括a)提供来自对象的第一和第二样品；b)暴露第一样品中的CTC ；c)利用对第一细胞标记特异的试剂分析第一样品中暴露的CTC ；d)利用对第一或第二细胞标记特异的试剂分析第二样品的CTC，其中第二样品的CTC在分析前没有被暴露或显露；和e)比较c)和d) 的结果以提供来自对象的CTC分类，从而对CTC进行分类。该方法可进一步包括将e)的结果与来自对象的CTC之前分类或与已知分类进行比较。本发明的方法利用暴露分析产生暴露的CTC。如本文所用，术语“暴露”(revealing 和revealing for) 一般涉及改变CTC的天然状态以使CTC更适于检测、分析、表征和/或进一步处理如富集。暴露CTC可包括去除和/或降解聚集和/或结合于CTC表面和/或表面组分的所有或一些生物分子。例如，暴露CTC可包括通过去除、降解或改变聚集的细胞(例如，血小板)、糖类、和/或聚集和/或物理结合于CTC表面的蛋白质(例如，纤维蛋白)显露或露出CTC，从而允许接近一种或多种CTC细胞组分，如表面组分，包括例如癌表面标记和其他表面结合的细胞组分，以及细胞内组分，如核酸和其他细胞内组分(例如，核蛋白和胞质蛋白及类似物)。因此，“显露(unmasking)”和/或“露出(unveiling) ”意欲包括改变CTC天然状态的特征——该特征可有助于遮盖CTC免于宿主的免疫识别或应答——和/ 或使CTC更适于检测、分析、表征和/或进一步处理。暴露CTC可包括改变CTC细胞组分， 如细胞表面标记或物理结合和/或聚集于CTC的蛋白质的表位。此外，本发明的方法利用对来自非暴露分析的CTC的检测。如本文所用，来自非暴露分析的CTC意欲指CTC没有像来自暴露分析的CTC那样被显露或暴露。例如，来自非暴露分析的CTC在细胞标记检测前没有显露，因此在不进行酶或其他处理以暴露CTC的情况下检测细胞标记；而是在其通常的天然状态下进行检测。术语“生物分子”一般意欲指存在于生物系统中的任何有机或生物化学分子。在任何适当样品种类中均可暴露CTC。如本文所用，术语“样品”指适于本发明提供的方法的任何样品。样品可以是包含适于检测的CTC的任何样品。样品的来源包括全血、 骨髓、胸膜液、腹膜液、中央脊髓液、尿液、唾液和支气管冲洗液。一方面，样品是血液样品， 包括例如全血或其任何部分或组分。适用于本发明的血液样品可提取自包括血细胞或其组分的任何已知来源，如静脉、动脉、外周、组织、脊髓及类似物。例如，可利用公知和常规的临床方法(例如，抽取和处理全血的程序)得到和处理样品。一方面，示例性样品可以是从癌症对象抽取的外周血。术语〃血液组分〃意欲包括任何全血组分，包括红细胞、白细胞、血小板、内皮细胞、间皮细胞或上皮细胞。血液组分还包括血浆组分，如蛋白质、脂质、核酸和糖类；以及可由于怀孕、器官移植、感染、损伤或疾病而存在于血液中的任何其他细胞。本文所用的术语“癌症”包括本领域公知的多种癌症类型，包括但不限于，发育异常、增生、实体肿瘤和造血性癌症。已知多种类型的癌症转移并释放循环肿瘤细胞或具有转移性，例如，由已转移的原发性癌症引起的继发性癌症。其他癌症可包括但不限于下列器官或系统脑、心脏、肺、胃肠、生殖泌尿道、肝、骨、神经系统、妇科、血液、皮肤、胸和肾上腺。其他癌细胞类型包括神经胶质瘤(神经鞘瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤)、成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、神经节细胞瘤、脑膜瘤、肾上腺皮质癌、成神经管细胞瘤、横纹肌肉瘤、肾癌、多种类型的血管癌、成骨细胞骨癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫肌瘤、唾液腺癌、脉络丛癌、乳腺癌、 胰腺癌、结肠癌和巨核细胞白血病；和皮肤癌，包括恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、 卡波西肉瘤、moles发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、肉瘤如纤维肉瘤或血管肉瘤和黑素瘤。
术语"循环肿瘤细胞"(CTC)意欲指对象样品中发现的任何癌细胞。通常CTC已脱离实体肿瘤。因此，CTC通常是实体肿瘤释放的上皮细胞，其以非常低的浓度被发现于晚期癌症患者的循环中。CTC也可以是来自肉瘤的间皮细胞或来自黑素瘤的黑素细胞。如本文所用、细胞组分意欲包括细胞溶解后可至少部分分离的任何细胞组分。细胞组分可以是细胞器，如核、核周区室、核膜、线粒体、叶绿体或细胞膜；聚合物或分子复合物，如脂质、多糖、蛋白质(膜蛋白质、跨膜蛋白或胞质蛋白)；核酸、病毒颗粒或核糖体；或其他分子，如激素、离子、辅因子或药物。暴露的CTC从其天然状态被显露和/或改变。如本文所述，CTC可通过去除、降解和/或改变聚集的细胞(例如，血小板)、糖类、和/或蛋白质(例如，纤维蛋白)而显露和暴露，从而允许接近对检测和/或分析至关重要的CTC的关键组分，如但不限于，表面组分如癌症标记和其他表面结合的细胞组分。因此，包含暴露的CTC或暴露的CTC群的样品意欲望指这样的样品其中所述样品已如本文所述被处理，以与所述样品未经处理时相比，例如相对于非暴露的样品，增加暴露 (例如，显露和/或改变)的CTC的相对数量(population)。例如，样品中暴露的CTC的相对数量可以增加至少约 10%、25%、50%、75%、100%或至少 2、5、10、20、30、40、50、60、70、 80、90、100 或甚至 200 倍。用以显露CTC的暴露分析包括去除、降解或改变聚集或物理结合于循环肿瘤细胞表面的蛋白质、糖类、细胞或其组合以显露细胞，从而暴露循环肿瘤细胞。暴露细胞包括去除、降解或改变血浆蛋白、糖类、血小板、其他血细胞或其组合。例如，可去除血浆因子—— 其为凝血因子，如纤维蛋白，以暴露和显露CTC。CTC可利用多种方法进行暴露和显露。例如，CTC可利用包括如下处理的方法进行暴露如但不限于酶处理、机械处理、电处理、电磁辐射处理或化学处理或其任意组合。在一个实施方式中，蛋白质和/或细胞从CTC表面的去除和/或降解通过酶处理 CTC进行。酶处理可通过纤维蛋白溶解而发生。在相关方法中，纤维蛋白溶解由纤溶酶原的酶活化引起。如本文所用，纤维蛋白溶解意欲指这样的酶处理其中纤维蛋白和/或凝结产物如纤维蛋白凝块及类似物被降解。一方面，纤维蛋白溶解引起的降解通过用酶——纤溶酶——处理CTC进行。纤溶酶是存在于血液中、降解纤维蛋白以及其他血浆蛋白、在纤维蛋白溶解中起关键性作用的丝氨酸蛋白酶。已知纤溶酶酶切割诸如纤维蛋白、纤维结合蛋白、 血小板反应素、层粘连蛋白和维勒布兰德因子的蛋白质。多种天然和合成的纤溶酶是本领域公知的，并可用于本发明的方法，只要该酶在纤维蛋白溶解中保持一定作用。纤溶酶衍生于由肝分泌进入循环的纤溶酶原。一旦在循环中，纤溶酶原可被多种因子活化以产生纤溶酶，如组织纤溶酶原活化剂(tPA)、尿激酶纤溶酶原活化剂(uPA)、凝血酶、纤维蛋白和因子XII (哈格曼因子)。因此，在本发明另一方面中，纤维蛋白溶解由纤溶酶原的酶活化引起。纤维蛋白溶解也可通过其他天然存在或合成存在的试剂实现。例如，在本发明又一方面中，纤维蛋白溶解可通过用天然或合成的动物毒液或毒素处理CTC而发生。例如，有毒动物，如但不限于，蝙蝠、蛇和昆虫，已知具有能直接或间接酶活化纤维蛋白溶解的毒液
或毒素。
除酶降解聚集于被遮蔽的CTC表面的细胞和蛋白质外，CTC还可被机械处理、电处理或化学处理。例如，机械力可以用于处理CTC以剪切聚集于表面的细胞和蛋白质。因此， 本发明预期用能显露CTC的任何类型的机械力或运动处理CTC。此外，多种电力处理可被用于显露CTC，如但不限于，电磁、静电、电化学、电磁辐射、超声力等等。电磁辐射可包括应用电磁波谱任何区段的辐射。进一步，多种化学试剂处理可被用于暴露CTC。例如，化学试剂，如但不限于，天然或合成的分子、有机化合物、无机化合物、药物，治疗剂及类似物，可被用于活化或抑制导致凝血因子降解的纤维蛋白溶解途径中的多个步骤。可用于显露CTC的另外的化学试剂包括抗血小板剂(anti-platelets)、抗凝结剂(anti-coagulants)和/或血液稀释剂(blood thinners)，其降解和/或抑制CTC表面上的血小板和纤维蛋白活化。通常可用的抗血小板剂、抗凝结剂和血液稀释剂包括但不限于环氧合酶抑制剂，如阿司匹林；二磷酸腺苷(ADP)受体抑制剂，如氯吡格雷(clopidogrel)和噻氯匹定；磷酸二酯酶抑制剂，如西洛他唑(cilostazol)；糖蛋白IIB/IIIA抑制剂，如阿昔单抗(abciximab)、依替巴肽(印tifibatide)、替罗非班(tirofiban)和去纤苷；腺苷再摄取抑制剂如双嘧达莫 (dipyridamole)；维生素K拮抗剂；肝素和肝素衍生物；氯吡格雷(Plavix )；苯并吡喃酮 (香豆素)；和直接凝血酶抑制剂。在示例性方面中，用肝素处理CTC，以暴露细胞。在一个实施方式中，足以通过破碎物理结合于CTC表面的聚集细胞而暴露CTC的机械力可在用于生物医学和诊断研究的微流体装置中产生。构成微流体系统的微型装置一般由多个柱、凹槽或微通道和在通常由硅、塑料、石英、玻璃或塑料构成的基底中蚀刻或模压的室组成。这些微型特征的尺寸、形状、构造及其相互连接决定了在流经装置的流体样品成分如悬浮于流体中的细胞或细胞群上产生的物理力。预期微流体装置的微型特征以及如流体流动速率的因素可被设置和利用以产生足以暴露流体样品中CTC的机械力。此外，本领域技术人员将知道，CTC可以用与微流体系统中的机械力不同或除微流体系统中的机械力外的一种或多种其他处理技术(例如，酶、化学、电及类似技术)处理。因此，CTC在被引入微流体装置之前或之后以及在微流体装置本身中可以经酶、化学或类似地处理。在多个方面，可有必要限定处理的持续时间，以防止过度降解，所述过度降解可能损害CTC的完整性，导致溶解。因此，在多个实施方式中，细胞应被处理足以从CTC去除分子的时间，以便细胞可被进一步检测和/或鉴定。虽然该时间可根据对细胞施加的处理类型而改变，但其在本领域技术人员通过常规分析确定该时间的知识范围内。此外，在CTC经酶或化学处理的情况下，可通过添加特定抑制剂减缓或停止反应来控制反应。暴露的CTC群中包含的暴露的CTC总量部分地取决于初始样品体积。在多个方面， 在一系列初始样品体积中暴露CTC足以产生能够提供有临床意义结果的CTC暴露量。因此， 初始样品体积可以低于约 25 μ 1,50 μ 1,75 μ 1、100μ 1、125μ 1、150μ 1、175μ 1,200 μ 1、 225 μ 1、250μ 1、300μ U 400 μ U 500 μ 1、750μ l、lml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml 或高于约10ml。在示例性方面，初始样品体积在约100与200 μ 1之间。在另一个示例性方面，如本文所述处理的样品包括高于约1、2、5、7、10、15、20、30、40、50、100、200、300、400、 500、600、700、800、900 或甚至 1000 个暴露的 CTC。在本发明的各种实施方式中，暴露和未暴露的CTC被分析以产生有临床意义的数据。CTC的分析可通过多种方法进行，这取决于所需的数据类型。例如，在多个方面，CTC可以通过利用识别和/或结合细胞组分如细胞表面标记的分析检测和表征CTC来进行分析。 考虑多种检测/固定化分析用于本发明，由其可得到有用的数据。另外的分析方法可包括图像分析。如本文所用，图像分析包括使CTC直接或间接可视化的任何方法。例如，图像分析可以包括但不限于体外显微镜或细胞计量术检测和结合于固态基底的细胞可视化、流式细胞计量术、荧光成像及类似技术。在示例性方面中，CTC利用针对细胞表面标记并随后结合于固态基底的抗体进行检测，并且利用显微镜或细胞计量术检测进行可视化。在多个实施方式中，可利用多种细胞标记进行分析、检测和分类CTC。如本文所用，细胞标记包括可在细胞表面或结合或聚集于细胞表面的大分子中或上检测到的任何细胞组分。因此，细胞标记并不限于物理地处于细胞表面上的标记。例如，细胞标记可包括但不限于表面抗原、跨膜受体或共受体、结合于表面的大分子——如结合或聚集的蛋白质或糖类、内部细胞组分及类似物。一方面，细胞标记可以是细胞粘着分子，如EpCAM或细胞角蛋白。在示例性方面中，用于检测细胞标记的抗体是抗细胞角蛋白抗体、全角蛋白抗体和抗 EpCAM抗体。此外，多种已知对癌症特异的细胞标记可被靶向或另外用于检测和分析CTC。例如，已发现多种受体仅在特定类型的癌症中表达或过表达。在本发明多个方面中，细胞标记包括 EGFR、HER2、ERCCl、CXCR4、EpCAM、E-钙粘素、粘蛋白 _1、细胞角蛋白、PSA、PSMA, RRMl、 雄激素受体、雌激素受体、黄体酮受体、IGFU cMET、EML4或白细胞相关受体(LAR)。进一步，可利用对特定细胞类型特异的细胞标记。例如，有用的内皮细胞表面标记包括CD105、 ⑶106、⑶144和⑶146，而有用的肿瘤内皮细胞表面标记包括TEM1，TEM5和TEM8。在多种实施方式中，本发明的方法可包括在分析前进一步处理患者样品的CTC。例如，在一个实施方式中，通过常用于富集CTC样品的技术例如涉及免疫特异性相互作用的那些技术如免疫磁性捕获来捕获CTC。已知多种免疫捕获方法，包括用珠或柱的免疫捕获。 磁场或固相支持物可有助于免疫捕获。多种细胞标记可用于免疫捕获，包括EGFR、HER2、 ERCCl、CXCR4、EpCAM、E-钙粘素、粘蛋白、细胞角蛋白、PSA、PSMA、RRMl、雄激素受体、雌激素受体、黄体酮受体、IGFU cMET、EML4或白细胞相关受体(LAR)。免疫磁性捕获，也被称为免疫磁性细胞分离，一般包括将针对特定细胞类型上发现的蛋白质的抗体附于顺磁性小珠。当抗体包被的珠体与样品如血液混合时，它们附于特定的细胞和包围特定的细胞。然后将样品置于强磁场中，使珠子聚集(pellet)到一侧。在去除血液后，捕获的细胞与珠子保留在一起。该常规方法的多种变型在本领域是公知的，并适用于在已利用本发明方法暴露CTC后富集CTC。在另一个实施方式中，在富集步骤前利用过滤进一步处理CTC。暴露CTC的过程破坏了细胞的聚集体，从而使过滤更加有效。在另一个实施方式中，通过利用密度梯度沉降进行的细胞分离进一步处理CTC。通常，该过程取决于总物理区别(gross physical distinction)，如分离有核细胞的细胞密度，所述有核细胞诸如来自红细胞的CTC及其他非CTC细胞。该常规方法的多种变型在本领域是公知的，并适用于在已利用本发明方法暴露CTC后富集CTC。在另一个实施方式中，通过被称为“淘洗(panning)”的技术来富集CTC。通常，该过程利用对所讨论的细胞类型特异的抗体，其中抗体被粘附于固相表面。细胞混合物在抗体包被的表面上面成层，被靶向的细胞由于涉及抗体-抗原结合的免疫特异性相互作用而紧密地粘附于固相表面。未粘附的细胞被冲洗脱离表面，从而实施细胞分离和富集。表达抗体识别的细胞表面蛋白的细胞保留在固相表面上，而其他细胞类型没有被保留。细胞标记的检测和分析可以多种方式进行。在示例性实施方式中，检测和分析采用荧光显微镜和图像分析利用载玻片进行。通常，在单独的反应中实施标记特异性结合试剂的不同组合。这些反应将发生在单个载玻片上。然而，也可在相同的载玻片上通过利用在不同试剂间具有区别的标记例如激发并发射不同波长的不同荧光染料来进行标记特异性结合试剂的不同组合。在标记后，载玻片可被成像，并且利用计算机和信息处理算法，CTC被鉴定和计数。 然后这些图像可被经培训的技术人员或病理医师查看，从而对利用暴露分析处理的样品和未利用暴露分析处理的样品上检测到的特异性细胞标记进行分析。分析对各种CTC数应用数学运算以分类、表征和预测预后和反应。在一个实施方式中，比率提供可用的信息。尽管本领域技术人员将理解任何数量的细胞标记可以如本文所述进行利用，下表示例了细胞标记细胞角蛋白和EpCAM的使用。例如，利用表1中的数据，与暴露(_)分析相比在暴露(+)分析中检测到的细胞角蛋白(+)细胞的百分比是B/A。类似地，来自暴露(+) 分析的细胞角蛋白(+)细胞的增加百分比是(B-A)/A。这些相同的运算可用于EpCAM数据， 其中D/C是暴露(+)/暴露(_)中的EpCAM(+)细胞百分比，以及(D-C)/C是增加百分比。在各个暴露条件下EpCAM(+)细胞与细胞角蛋白(+)细胞的比率也可用于表征和预测肿瘤反应。在这种情况下，该比率将是C/A和D/B。这些具体数学运算仅是示例性的，因为在分析数据时可能有许多不同的数学运算。表1 用以产生新信息的分析组合的说明性应用。A、B、C和D是在各条件下计数的CTC量。
暴露(-) 暴露(+) 细胞角蛋白(+)AB
EpCAM(T)CD利用本发明的方法，CTC分类可用于评估癌症预后和监测治疗功效，以早期发现可导致疾病复发的治疗失效。此外，根据本发明所述的CTC分析能够检测已完成疗程的症状前患者的早期复发。这是可能的，因为CTC的存在与肿瘤进展和扩散、对治疗的反应差、疾病复发和/或一段时间内存活下降相关和/或关联。因此，暴露的CTC的计数和表征提供了针对基线特征将患者分级的方法，该方法基于对治疗的反应预测最初风险和随后风险。本文所用的术语“对象”指主题方法所实施的任何个体或患者。一般，对象是人类， 尽管如本领域技术人员所理解的，该对象可以是动物。因此，其他动物，包括哺乳动物，如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔、农场动物——包括牛、马、山羊、绵羊、猪等以及灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、猩猩和大猩猩)均被包括在对象的定义内。因此，在另一个实施方式中，本发明提供预测对象癌症的方法。该方法包括如本文所述对CTC进行分类，以预测对象的癌症。因此，本发明的方法可例如用于评估癌症。原发性肿瘤中的EpCAM表达已知与预后相关。具体地，高水平的EpCAM表达表示较差的预后。但是，原发性活组织检查通常不可用来评估EpCAM表达和/或自原发性活组织检查以来可能已经错失时间，在原发性活组织检查期间患者可能已经接受治疗并且肿瘤可能已经随时间进程和/或响应于治疗而改变。CTC分析提供在疾病进程中评估EpCAM表达的微创方式。通过进行上述分析矩阵，观察EpCAM:细胞角蛋白的比率(C/A和D/B)来评估相对EpCAM表达。据认为，较高的比率是消极的预后指示，并且预测对治疗的反应较差。蛋白质、糖类和细胞的遮蔽是CTC在循环系统中的存活机制。这些遮蔽技术有助于CTC逃避免疫系统，使其有时间找到适当的环境来寄居、渗出和形成转移性损伤。作为诊断辅助，确定遮蔽水平提供了关于预后的信息，并预测对治疗的反应。期望确定的任意比率均可提供有用的见解并有助于确定预后。例如，利用上述表，细胞角蛋白的相对遮蔽量(B/ A)和EpCAM的相对遮蔽量(D/C)提供了这种信息，其中较高的比率是消极的预后指示，并且预测对治疗的反应较差。 示例性标记特异性结合试剂包括细胞标记，如EGFR、HER2、ERCCl、CXCR4、EpCAM, E-钙粘素、粘蛋白-1、细胞角蛋白、PSA、PSMA、RRM1、雄激素受体、雌激素受体、黄体酮受体、 IGF1、cMET、EML4或白细胞相关受体(LAR)。可以对上述方法进行概括。通过对相同患者进行多种不同的CTC分析，产生提供独特数据的结果。当将该数据相互进行比较时，可产生新的信息，该信息详述了肿瘤特征并预测患者的预后和治疗效果。重要的是，不需要产生的信息对用于建立相对比率的标记具有特异性，例如，其本身可以是有意义的比率。因此，在多个方面，对象CTC的数量和分类的分析可以在特定时期内以不同的间隔进行，从而评估对象的进展和病理。例如，分析可以以有规律的间隔进行，如1天、2天、3 天、1周、2周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年，以便追踪作为时间函数的循环上皮细胞的水平和表征。期望测量的比率将有可能例如响应于治疗或由于发病而随时间改变。随时间的改变相对于在单个时间点对相同患者进行的分析将明显具有不同和/或额外的释义值。因此，在一个实施方式中，本发明包括比较在多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个) 时间点进行的分析。在已患癌症患者的情况下，其提供疾病进展的有用指示，并有助于执业医生基于循环上皮细胞的增加、减少或不变——如CTC在患者血流中的存在——做出适当的治疗选择。暴露的CTC随时间的任何增加——2倍、5倍、10倍或更高——降低了患者的预后，并且是患者应改变治疗的早期指示。类似地，任何增加——2倍、5倍、10倍或更高——表明患者应进行进一步测试如成像以进一步评估预后和对治疗的响应。暴露的CTC随时间的任何减少——2倍、5倍、10倍或更高——显示疾病稳定和患者对治疗的反应，并且是不改变治疗的指示。对于处于癌症风险的那些，所测的循环上皮细胞量的突然增加可提供患者已患有肿瘤的早期警告，从而提供早期诊断。在一个实施方式中，暴露的CTC的检测增加了癌症的分期。本文所述的CTC的分类提供了足以确定对象对具体治疗方案反应性或确定候选试剂在癌症治疗中有效性的数据。因此，本发明提供了通过如本文所述对CTC进行分类来确定对象对具体治疗方案反应性或确定候选试剂在癌症治疗中有效性的方法。例如，一旦向患者给予药物治疗，就可能利用本发明的方法确定药物治疗的效力。例如，在药物治疗前从自患者获取的样品以及在药物治疗同时或在药物治疗后从自患者获取的一个或多个细胞样品可以利用本发明的方法进行处理。通过比较各处理样品的分析结果，可以确定该药物治疗的效力或患者对该试剂的反应性。以这种方式，可以进行无效化合物的早期鉴别或可以进行有希望化合物的早期确认。对候选化合物的临床活性提供见解的四种重要指示物包括HER2、EGFR、CXCR4和 EphB4RTK。HER2通过确定mRNA稳定性和HER2转录物的亚细胞位置提供细胞恶性的指示。EGFR对获得突变和/或已获得的突变的抗性提供了除可与候选化合物组合应用的可选化合物外候选化合物活性的重要指示。对钼诱导的DNA修复干扰水平的评估提供了关于 CXCR4标记状态和转移情况的见解。此外，对Eph β 4受体酪氨酸激酶状态的评估提供了关于细胞转移可能性的见解。因此，利用本发明的方法，可通过如下监测服用这种候选药物的患者获取频繁的血液样品和确定作为时间函数的各样品中循环上皮细胞例如CTC的数量。对Her2、EGFR、CXCR4和Eph β 4RTK指示物的进一步分析提供了关于癌症病理和候选药物效力的信息。类似地，ERRCl、细胞角蛋白、PSA、PSMA、RRM1、雄激素受体、雌激素受体、黄体酮受体、IGFl、cMET、EML4等提供了对候选化合物临床活性的见解。这些具有临床活性的指示物的分析可通过免疫组织化学、荧光原位杂交(FISH)、测序、基因分型、基因表达或其他分子分析技术进行。在本文提供的任何方法中，也可进行另外的分析以表征CTC，从而提供另外的临床评估。例如，除图像分析和大量测量外，还可利用PCR技术，如用对特定癌症标记特异的引物进行的多重PCR技术，以获得信息如CTC来源的肿瘤类型、转移状态和恶性程度。此外， 可进行细胞尺寸、DNA或RNA分析、蛋白质组分析或代谢组分析，作为评估关于患者癌症特征的另外信息的手段。在多个方面，分析包括针对下列标记中一种或多种的抗体或利用对下列标记中一种或多种特异的引物进行的多重PCR :EGFR、HER2、ERCCl、CXCR4、EpCAM、E-钙粘素、粘蛋白-1、细胞角蛋白、PSA、PSMA、RRM1、雄激素受体、雌激素受体、黄体酮受体、IGF1、 cMET、EML4或白细胞相关受体(LAR)。虽然本发明已参照上述实例进行了描述，但要理解的是，修改和变化被包括在本发明的宗旨和范围内。因此，本发明仅通过所附权利要求进行限定。
权利要求
1.对来自对象的循环肿瘤细胞(CTC)进行分类的方法，包括a)提供来自对象的第一和第二样品；b)通过去除或改变物理结合于CTC表面的蛋白质、糖类、细胞或其组合来暴露所述第一样品的CTC，从而显露和暴露所述CTC ；c)利用对第一细胞标记特异的试剂分析b)中暴露的CTC;d)利用对第一或第二细胞标记特异的试剂分析所述第二样品的CTC；和e)比较c)和d)的结果以提供来自所述对象的CTC的分类，从而对所述CTC进行分类。
2.权利要求1所述的方法，进一步包括将e)的结果与所述对象之前的分类或已知分类进行比较。
3.权利要求1所述的方法，其中第二样品的CTC在分析之前未暴露。
4.权利要求1所述的方法，其中(e)所述的比较包括计算所述第一样品中具有所述第一细胞标记的CTC数量与所述第二样品中具有所述第一细胞标记的CTC数量的比率。
5.权利要求1所述的方法，其中(e)所述的比较包括计算所述第一样品中具有所述第一细胞标记的CTC数量与所述第二样品中具有所述第二细胞标记的CTC数量的比率。
6.权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二细胞标记选自EGFR、HER2、ERCCl、 CXCR4、EpCAM、E-钙粘素、粘蛋白_1、细胞角蛋白、PSA、PSMA, RRMl、雄激素受体、雌激素受体、黄体酮受体、IGFU cMET、EML4或白细胞相关受体(LAR)。
7.权利要求1所述的方法，其中(c)和(d)所述的试剂是用于检测所述细胞标记的抗体。
8.权利要求7所述的方法，其中所述抗体被荧光标记。
9.权利要求8所述的方法，其中所述抗体针对EpCAM、细胞角蛋白或其组合。
10.权利要求1所述的方法，其中(b)所述的暴露包括去除全部或部分血浆蛋白、血小板或其组合。
11.权利要求10所述的方法，其中所述血浆蛋白是凝血因子。
12.权利要求11所述的方法1，其中所述凝血因子是纤维蛋白。
13.权利要求1所述的方法，其中(b)所述的暴露包括酶处理、机械处理、电处理、电磁处理、化学处理、或其任意组合。
14.权利要求13所述的方法，其中(b)所述的暴露包括酶处理。
15.权利要求14所述的方法，其中所述酶处理通过纤维蛋白溶解进行。
16.权利要求15所述的方法，其中所述纤维蛋白溶解用纤溶酶进行。
17.权利要求14所述的方法，其中所述酶处理通过与动物毒液或毒素温育进行。
18.权利要求14所述的方法，其中所述酶处理通过纤溶酶原活化进行。
19.权利要求1所述的方法，其中(b)所述的暴露包括用抗凝结剂或血液稀释剂处理所述细胞。
20.权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二样品为约200微升。
21.权利要求1所述的方法，进一步包括在分析前富集所述第一或第二样品。
22.权利要求21所述的方法，其中所述样品通过免疫磁性富集或通过过滤富集。
23.权利要求1所述的方法，其中(c)或(d)所述的分析包括图像分析。
24.权利要求23所述的方法，其中所述图像分析通过显微镜或流式细胞计量术进行。
25.权利要求1所述的方法，进一步包括提供所述对象的预后。
26.权利要求1所述的方法，其中所述对象已知患有癌症。
27.权利要求26所述的方法，其中所述对象正在进行癌症治疗。
28.权利要求27所述的方法，其中所述治疗是化学治疗。
29.预测对象癌症的方法，包括a)提供来自对象的第一和第二样品；b)通过去除或改变物理结合于CTC表面的蛋白质、糖类、细胞或其组合来暴露所述第一样品的CTC，从而显露和暴露所述CTC ；c)利用对第一细胞标记特异的试剂分析b)中暴露的CTC;d)利用对第一或第二细胞标记特异的试剂分析所述第二样品的CTC；e)比较c)和d)的结果以提供来自所述对象的CTC的分类；和f)确定预后，从而预测对象的癌症。
30.权利要求29所述的方法，进一步包括将e)的结果与所述对象之前的分类或已知分类进行比较。
31.权利要求29所述的方法，其中所述第二样品的细胞在分析前未暴露。
32.确定对象对治疗方案反应性的方法，包括a)提供来自对象的第一和第二样品；b)通过去除或改变物理结合于CTC表面的蛋白质、糖类、细胞或其组合来暴露所述第一样品的CTC，从而显露或暴露所述CTC ；c)利用对第一细胞标记特异的试剂分析b)中暴露的CTC;d)利用对第一或第二细胞标记特异的试剂分析所述第二样品的CTC；e)比较c)和d)的结果以提供来自所述对象的CTC的分类；和f)确定所述对象对治疗方案的反应性。
33.权利要求32所述的方法，进一步包括将e)的结果与所述对象之前的分类或已知分类进行比较。
34.权利要求32所述的方法，其中所述第二样品的细胞在分析前未暴露。
35.确定候选试剂在癌症治疗中有效性的方法，包括a)提供来自对象的第一和第二样品；b)通过去除或改变物理结合于CTC表面的蛋白质、糖类、细胞或其组合来暴露所述第一样品的CTC，从而显露和暴露所述CTC ；c)利用对第一细胞标记特异的试剂分析b)中暴露的CTC;d)利用对第一或第二细胞标记特异的试剂分析所述第二样品的CTC；e)比较c)和d)的结果以提供来自所述对象的CTC的分类；和f)确定所述候选试剂在癌症治疗中的有效性。
36.权利要求36所述的方法，进一步包括将e)的结果与所述对象之前的分类或已知分类进行比较。
37.权利要求36所述的方法，其中所述第二样品的细胞在分析前未暴露。
全文摘要
本发明提供利用多种细胞标记和暴露或非暴露分析对循环肿瘤细胞(CTC)进行分类的方法，该方法为癌症患者的临床分期和治疗决策制定提供有益见解。
文档编号A01N63/00GK102482703SQ201080039127
公开日2012年5月30日 申请日期2010年9月2日 优先权日2009年9月3日
发明者P·昆 申请人:斯克里普斯研究所