专利名称：玫瑰再生为完整植株的方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域，具体的说是一种玫瑰再生为完整植株的方法。
背景技术：
玫瑰(Rosa rugosa)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)落叶直立丛生灌木，原产中国北部，其色艳花香，含油量高，是我国重要的经济植物，也是世界上重要的观赏与生产两型花卉之一。玫瑰采用传统的杂交育种的方法选育新品种，周期长，工作量大，并且会受到育种材料自身变异的限制，改良幅度有限，远远不能满足市场的需求。随着生物技术的快速发展，植物细胞工程和基因工程技术日趋成熟，可以在保持品种的其他性状相对稳定的基础上，利用外源基因对其所控制的性状进行定向改良，提高了育种的效率。玫瑰再生体系的建立是遗传转化体系建立的基础，也是利用基因工程育种的重要基础。植物体细胞胚发生途径(somatic embryogenesis)，是指植物在离体培养条件下，双倍或单倍的体细胞未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育成新个体的形态发生过程。国内外关于玫瑰再生方面的报道较少，主要是利用玫瑰种子为外植体，通过诱导体细胞胚获得再生植株的。Kimitake等(199 和Kim等Q009)分别以玫瑰未成熟种子和成熟种子为外植建立了体细胞胚再生体系。利用种子作为外植体进行植株再生，一方面无法很好的保持母株的优良性状，另一方面，种子的采集也受到时间和气候条件的限制。而叶片采集简单，也可以很好的保持母株的优良性状，因此，叶片为外植体再生对于玫瑰再生体系的建立，种质改良以及新品种选育具有重大的意义。但是至今尚未见到以玫瑰叶片为外植体材料建立再生体系的报道。华中农业大学的专利申请“以叶片为外植体的月季再生植株的方法” Q01010256892.幻，提出以月季未成熟叶片为外植体，通过体细胞胚发生途径，建立月季再生体系的方法，提出了以体细胞培养再生植株的概念。虽然月季和玫瑰同属蔷薇科蔷薇属，但是对于植物组织培养技术领域而言，即使同属的植物之间，利用叶片为外植体进行体细胞培养再生植株时，受培养过程、培养基、控制条件不同，以及受体材料品种自身的特性影响，对其能否成功培养出再生植株，以及萌发率都有极大影响。因此，有必要针对以玫瑰叶片为外植体材料建立再生体系进行进一步的研究和实验。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种玫瑰叶片为外植体的玫瑰再生为完整植株的方法。该方法培育周期短，成活率高，增殖倍数高，能够完全保持母株性状，获得的体细胞胚便于长期保存，是遗传转化的重要受体材料。技术方案包括以下步骤1)玫瑰无菌苗获得将玫瑰的茎段灭菌后再切成l-2cm的带芽茎段，接种于继代培养基上进行初代培养得到玫瑰的无菌苗，然后在增殖培养基上进行增殖和继代；2)体细胞胚诱导切取继代培养的玫瑰无菌苗的未展开小叶，将其接种于体细胞胚诱导培养基，在黑暗条件下培养，直接诱导出体细胞胚；3)体细胞胚增殖培养诱导出的体细胞胚接种于体细胞胚增殖培养基，在弱光条件下，进行体细胞胚的增殖和进一步分化，得到成熟体细胞胚；4)体细胞胚萌发成苗将得到的成熟体细胞胚接种于体细胞胚萌发成苗培养基， 在正常光照条件下，使其再生出植株；其中，初代培养基和无菌苗增殖培养基为MS基本培养基，6-BAO. 5mg/L, NAA, 0. Olmg/ L,琼脂7. 5g/L和葡萄糖30g/L，加蒸馏水至1L，pH 6. 0 ；所述体细胞胚诱导培养基成份如下MS基本培养基，2，4-D3-^ig/L，葡萄糖30g/ L，植物凝胶3g/L，加蒸馏水至1L，pH 6. 0 ；所述体细胞胚增殖培养基成份如下MS基本培养基，2，4-D0-0. 5mg/L, 6_BA 0-0. 05mg/L, CHI. Og/L，葡萄糖 30g/L，植物凝胶 3g/L，加蒸馏水至 1L，pH 6. 0 ；所述体细胞胚萌发成苗培养基成份如下1/2MS基本培养基或MS基本培养基， 6-BA 0-0. 4mg/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶3g/L，加蒸馏水至1L，pH 6. 0 ；所述步骤幻的体细胞胚增殖培养阶段，光照强度为50-1001X，所述体细胞胚增殖培养基中的 2，4-D 为 0. 5mg/L，6-BA 为 0. 01mg/L。所述步骤4)中体细胚胞胚萌发成苗培养基中的6-BA为0. %ig/L，在体细胞胚萌发阶段，光照强度为1000-15001X。所述步骤2、得到的体细胞胚还可接种到体细胞继代培养基上，使其继代并保持分化能力。当步骤4)中得到的植株无根系发生时，则进入步骤5)生根培养将无根系发生的植株接种于生根培养基，在正常光照条件下，进行生根培养，从而形成完整植株，所述生根培养基成份如下1/2MS基本培养基，NAA 0. 1-0. 5mg/L,葡萄糖30g/L，琼脂7. 5g/L，加蒸馏水至 1L，pH 6. 0。多次实验证明，由于消毒损伤，叶片本身状态等原因，直接采用玫瑰叶片作为外植体容易发生褐化和死亡的现象，无法诱导出体细胞胚，因此，应进行初代培养得到玫瑰的无菌苗，再以继代培养得到的玫瑰无菌苗的未展开小叶作为外植体进行体细胞胚诱导。以往报道中，对于体细胞胚增殖的研究，集中在对激素的研究上，对于光照的研究较少，一般情况下，体细胞胚都是在正常光照条件(1000-15001X)增殖的。而发明人研究发现，玫瑰的体细胞胚对光照敏感，光照会刺激体细胞胚中激素配比变化，刺激叶绿素，花青素大量分泌，导致体细胞胚不能正常生长。与以往研究不同的是，玫瑰的体细胞胚对外源激素并不敏感，在不同外源激素配比的培养基中都能增殖，原因可能在于，外源激素无法改变内源激素，玫瑰体细胞胚内源激素的配比足以支撑他们的正常生长和增殖。因此在体细胞胚增殖培养阶段，体细胞胚必须在弱光照条件下才能正常的生长，增殖。所述弱光条件优选为 50-1001x。大量研究表明，木本植物的体细胞胚萌发再生植株的过程复杂且困难，本发明中由于玫瑰的体细胞胚对光照很敏感，光照可促进玫瑰体细胞胚的叶绿素的产生和积累。因此在体细胞胚萌发成苗阶段，成熟的体细胞胚在正常的光照条件下，无需或者仅配合少量添加在体细胞胚萌发成苗培养基中的外源细胞分裂素6-BA即可萌发，且萌发的小苗都具有明显的两级性，萌发率也很高。这里少量的细胞分裂素6-BA更有利于‘唐白’体细胞胚的萌发，但是高浓度的6-BA在一定程度上抑制了体细胞胚的萌发。因此使用量控制在 0-0. %ig/L，优选为 0. 4mg/L0进一步的，对于步骤4)中得到的植株若已有根系产生，则可直接移栽，若无根系产生，则进行生根培养得到系发育良好的植株。有益效果1.本发明所用的外植体采集方便，可以周年进行玫瑰的组织和细胞的培养。2.本发明所得到的体细胞胚可以通过次生胚不断增殖，不断为转化提供资源。3.本发明得到的次生胚，萌发成苗容易，且萌发具有明显的两级结构，可以同时成苗和生根。4.本发明得到的体细胞可以长期继代保存并仍具有进不一步分化成植株的能力。
图1本发明中玫瑰‘唐白’体细胞胚的诱导。
图2本发明中玫瑰‘唐白’体细胞胚的增殖。
图3本发明中玫瑰‘唐白’体细胞胚的萌发。
图4本发明中玫瑰‘唐白’体细胞胚萌发生成具有两级性的苗
图5本发明中田间条件下生长的玫瑰‘唐白’的再生植株。
具体实施例方式实施例试验材料选择、培养基设计与接种培养1.试验材料的来源及处理本发明中的试验材料玫瑰‘唐白’，采自湖北省武汉市华中农业大学花卉试验基地。该品种引种于山东省平阴县。田间采集的玫瑰‘唐白’健壮幼嫩枝条，现在洗衣粉漂洗lOmin，再在自来水下冲洗60min，然后在超净工作台上用75%酒精消毒30s后，用
升汞消毒8min，最后用无菌水洗4-5次，将玫瑰枝条切成l-2cm大小带芽茎段，接种于初代培养基中进行初代培养，培养一个月后得到无菌苗，然后将无菌苗接种于无菌苗增殖培养基上增殖和继代，两个月建立无性系。2.培养基设计表1列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。表1玫瑰的离体培养基设计
权利要求
1.一种玫瑰再生为完整植株的方法，它包括以下步骤1)玫瑰无菌苗获得将玫瑰的茎段灭菌后再切成l-2cm的带芽茎段，接种于初代培养基上进行初代培养得到玫瑰的无菌苗，然后在无菌苗增殖培养基上进行增殖和继代；2)体细胞胚诱导切取继代培养的玫瑰无菌苗的未展开小叶，将其接种于体细胞胚诱导培养基，在黑暗条件下培养，直接诱导出体细胞胚；3)体细胞胚增殖培养诱导出的体细胞胚接种于体细胞胚增殖培养基，在弱光条件下，进行体细胞胚的增殖和进一步分化，得到成熟体细胞胚；4)体细胞胚萌发成苗将得到的成熟体细胞胚接种于体细胞胚萌发成苗培养基，在正常光照条件下，使其再生出植株；其中，初代培养基和无菌苗增殖培养基为=MS基本培养基，6-BAO. 5mg/L，NAA，0. 01mg/L，琼脂7. 5g/L和葡萄糖30g/L,加蒸馏水至1L，pH 6. 0 ；所述体细胞胚诱导培养基成份如下MS基本培养基，2，4-D3-^ig/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶3g/L，加蒸馏水至1L，pH 6. 0 ；所述体细胞胚增殖培养基成份如下MS基本培养基，2,4-D0-0. 5mg/L, 6_BA 0-0. 05mg/L, CHI. Og/L，葡萄糖 30g/L，植物凝胶 3g/L，加蒸馏水至 1L，pH 6. 0 ；所述体细胞胚萌发成苗培养基成份如下1/2MS基本培养基或MS基本培养基，6-BA 0-0. %ig/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶3g/L，加蒸馏水至1L，pH 6. 0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤幻的体细胞胚增殖培养阶段， 光照强度为50-1001x，所述体细胞胚增殖培养基中的2，4-D为0. 5mg/L，6-BA为0. 01mg/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中体细胚胞胚萌发成苗培养基中的6-BA为0. %ig/L，在体细胞胚萌发阶段，光照强度为1000-15001X。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤幻得到的体细胞胚还可接种到体细胞增殖培养基上，使其增殖并保持分化能力。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当步骤4)中得到的植株无根系发生时，则进入步骤5)生根培养将无根系发生的植株接种于生根培养基，在正常光照条件下，进行生根培养，从而形成完整植株，所述生根培养基成份如下1/2MS基本培养基， ΝΑΑ0. 1-0. 5mg/L，葡萄糖 30g/L，琼脂 7. 5g/L，加蒸馏水至 1L，pH 6. 0。
全文摘要
本发明公开了一种玫瑰再生为完整植株的方法，经玫瑰无菌苗获得、体细胞胚诱导、体细胞胚增殖培养、体细胞胚萌发成苗得到完整植株，本发明方法具有培育周期短，成活率高，增殖倍数高，能够完全保持母株性状，获得的体细胞胚便于长期保存，是遗传转化的重要受体材料。
文档编号A01H4/00GK102210267SQ20111009981
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月21日 优先权日2011年4月21日
发明者包满珠, 包颖, 宁国贵, 邢文 申请人:华中农业大学