专利名称：一种将抗逆基因导入转基因741杨的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的将抗逆基因AtNDPK2导入转双抗虫基因741杨的方法。
背景技术：
随着植物转基因技术的日益成熟，越来越多的转基因植物研制成功并逐渐进入市场，我国在林木转基因方面也取得了一定的进展。转双抗虫基因741毛白杨(以下简称转基因741杨)是河北农业大学林学院生物技术实验室和中科院合作，运用农杆菌介导法将 Bt杀虫蛋白BtCrylAc基因和慈菇蛋白酶抑制基因AHPI双价抗虫基因同时转入优良741毛白杨，获得的不同系号转双抗虫基因无性系。室内饲虫试验已确定出高抗株系(室内试虫死亡率>75%)和中抗株系(室内试虫死亡率40% 75% )[1]。转基因741杨的成功研制为害虫防治提供了一条新的途径。在已转入基因的物种中再转入具有其他的功能的新基因，目前还没有研究报道。 转基因741杨由中科院微生物所与河北农业大学合作完成。双抗虫基因的导入，使转基因 741杨获得了高抗杨扇舟蛾和美国白蛾等主要鳞翅目害虫的能力，大大减少农药施用量。 同时通过室内及试验地的饲虫试验，苗期的生长观测和形态观测以及分子生物学检测等方法，最终获得了基本不飞絮的败育雌株转双抗虫基因的优良白杨派杂种，避免了种间的花粉传播，降低了 741杨基因污染的风险。NDPK2基因主要编码植物核苷二磷酸激酶2，近年来的研究表明，NDPK2可参与促分裂原蛋白激酶MAI3K级联反应[2]，进而上调P0D、CAT、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和过氧化物还原酶等多种抗氧化酶基因的表达，调节细胞的氧化还原状态M。从拟南芥中克隆出NDPK2基因，命名为AtNDH(2。AtNDPK2的对大麦、马铃薯的遗传转化研究也表明，AtNDPK2 基因的过量表达增强了作物对干旱、盐渍或极端温度的忍耐性。AtNDPK2基因对作物的遗传转化具有重要的实践意义。但迄今为止，未见有关此基因在杨树中遗传转化的报道。随着环境的不断恶化，植物不仅要受到病虫的危害，而且诸多非生物因素，如干旱、盐碱、低温也严重影响着植物的生长发育和作物产量。杨树是林业最早开展基因工程研究的树种[4_5]，尤其是转抗逆基因的木本植物在治理盐碱化、沙漠化土地，改善生态环境及增加林业收入等方面，具有草本植物不可替代的优势。随着我国土地荒漠化、盐渍化和冻害的不断加剧，病虫害的不断增加，利用现代生物技术，快速培育兼有抗虫和抗逆植物新品系，是实现扩大种植面积，缓解土地矛盾，减少农药危害的有效途径之一。
发明内容
本文以已转入双抗虫基因的741毛白杨无菌苗的叶片为材料，建立其再生及转基因体系，并通过农杆菌介导法将抗逆基因AtNDPK2导入其中，以期获得即抗虫且抗非生物胁迫能力强的转基因杨树新品系。本发明的技术依据是以转基因741杨的叶片为外植体，在已转入双抗虫基因的基础上，采用农杆菌介导的转化方法，将抗逆AtNDPK2基因导入转基因741杨中，获得了即抗虫、又抗逆的转基因杨树，通过对转化条件的优化，建立稳定的遗传转化体系。为杨树抗虫、抗逆品种的培育奠定基础，同时还可以为杨树基因工程操作技术提供参考数据。本发明涉及到的转双抗虫基因741毛白杨的无菌苗，由河北农业大学林学院提供；本发明涉及到的根癌农杆菌EHA105，其携带的质粒pCAMBIA1300上含有AtNDH(2 基因片段；此菌种由韩国生命工学研究院(KRIBB)提供。MS(Murashige and Skoog，1962)培养基，是植物组培的常用培养基，广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。本发明所用的植物培养基均以MS为基本培养基，附加了不同的添加剂。本发明是通过如下步骤实现的I制备侵染菌液挑取农杆菌EHA105的菌落接种到含有潮霉素50mg/L的10 15ml YEP液体培养基中，于下，200rpm震荡培养对小时，取10 100 μ 1的菌液转接至30 50ml的YEP 液体培养基中，于下，200rpm震荡培养，待菌体OD6tltl达到0. 8 1. 0时，离心收集沉淀， 用与离心前等体积的MS液体培养基重新悬浮沉淀后，即得侵染菌液；II 转化a.预培养取转基因741杨无菌苗的叶片，在靠近叶柄1/3处沿垂直主脉的方向剪下，并在叶片一侧垂直主脉剪1个伤口，伤口深达主脉，接种在分化培养基上进行预培养 2天；所述的分化培养基为MS+6-BA1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+蔗糖 30g/L+琼脂粉 6. 5g/ L；b.共培养将步骤IIa所得叶片完全浸没在步骤I制备的侵染菌液中10 20min， 用无菌滤纸吸干叶片后，转入共培养培养基上，25 27°C进行暗培养3 5天；所述的共培养培养基为MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉 6. 5g/L ；c.筛选培养用无菌水冲洗共培养后的叶片，然后用无菌滤纸吸干，将叶块转移到分化筛选培养基上培养，培养温度为25 27°C，光照强度为25001UX，光照时间为14小时/天，培养2-3周分化出抗性不定芽；所述的分化筛选培养基为MS+6-BA1. Omg/L+IBA 0. Img/L+Hyg3mg/L+Cef400mg/ L+蔗糖30g/L+琼脂粉6. 5g/L ；d.继代筛选培养将步骤c所得抗性不定芽转到继代筛选培养基中进行培养20 30天获得抗性芽，每10天换一次培养基；培养温度为25 27°C，光照强度为 25001UX，光照时间为14小时/天；所述的继代筛选培养基为MS+6-BA0. 5mg/L+IBA 0. 05mg/L+Hyg5mg/L+Cef 400mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 6. 5g/L ；e.生根培养步骤d所得抗性芽长到2 3cm时，切下并插入生根筛选培养基上进行生根培养，培养2-3周，获得抗性植株；所述的生根筛选培养基为1/2MS+IBA0. 05mg/L+Hyg5mg/L+Cef400mg/L+蔗糖30g/L+ 琼脂粉 6. 5g/L ；III 鉴定CTAB法的全称是十六烷基三甲基溴化铵法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide)能够提取植物基因组DNA，属于一般分子生物学常规操作。采用CTAB法提取步骤 II所获的转基因植株的DNA，作为被检模板，采用PCR(Polymerase Chain Reaction)法对候选植株进行鉴定，所用引物如下上游引物5‘ -ATTTATCGGCAAGGTGGAGGTT-3 ‘，下游引物5‘ -CCCGGTGAGGTGATTTGAA-3 ‘；PCR 反应条件-MV lmin，54°C lmin，72°C 2min，;35 个循环；72°C延伸 lOmin，扩增
产物用0. 琼脂糖凝胶电泳检测。PCR又称为“多聚酶链式反应”，是本领域技术人员公知的实验方法，根据PCR引物以及PCR反应条件，本领域技术人员可依据常识确定PCR反应体系，扩增出目的基因。本发明通过上述操作，利用农杆菌介导法将抗逆基因AtNDPK2导入到转基因741 杨中，获得了抗逆植株。在此过程中，通过对共培养条件的优化，我们发现1.当在共培养培养基中加入200 μ mol/L乙酰丁香酮，调节共培养培养基的pH为 5. 2时，共培养的效果较好；2.当上述共培养的条件中叶片的侵染时间为15min时，共培养的效果较好；3.当上述共培养的条件中暗培养的时间为3天时，共培养的效果较好。有益效果本发明利用农杆菌介导法将抗逆基因AtNDPK2导入到转基因741杨中， 获得了再生植株。同时建立了高效快速的转基因741杨组培再生体系，且转基因741杨叶片的不定芽转化率可达40%。
图1 潮霉素对转基因741杨叶片分化的影响；图2 转基因741杨基因组PCR检测；其中:M，DL2000 DNA Marker ；CK+,阳性对照； cr,阴性对照；Yl TO，待检转化植株的DNA。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。生物材料含有质粒pCAMBIA1300的农杆菌EHA105 由韩国生命工学研究院提供；双抗虫基因741毛白杨的无菌苗，由河北农业大学林学院提供；化学试剂6-BA :6-Benzylaminopurine,6-苄氨基嘌呤，购自生工生物(上海)有限公司；NAA :l-naphthlcetic acid，a_萘乙酸，购自生工生物(上海)有限公司；Hyg =Hygromycin,潮霉素，购自生工生物(上海)有限公司；Cef Cefotaxime sodium,头孢霉素，购自生工生物(上海)有限公司；AS =Acetosyringone,乙酰丁香酮，购自生工生物(上海)有限公司；
IBA :3-Indole butyric acid, 3-吲哚丁酸；购至生工生物(上海)有限公司；溶菌酶dysozyme，购自生工生物(上海)有限公司；10 X PCR缓冲液，购自生工生物(上海)有限公司；Taq酶，购自生工生物(上海)有限公司；DL2000 DNA Marker，购自宝生物工程(大连)有限公司；PVP Polyvinylpyrrolidone，聚乙烯卩比咯烷酮，购自 BBI 公司，CAS NO 9003-39-8。培养基MS培养基购自Duchefa公司，商品号M0222. 0050，使用浓度为4. 4g/L，1/2MS培养基的浓度为2. 2g/L。分化培养基为MS+6-BA1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 6. 5g/L，pH 5. 8 ；共培养培养基为MS+6-BA1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+AS 200 μ mol/L+蔗糖 30g/L+ 琼脂粉6. 5g/L ；分化筛选培养基为MS+6-BA1. Omg/L+IBA 0. Img/L+Hyg3mg/L+Cef400mg/L+蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 6. 5g/L，pH 5. 8 ；继代筛选培养基为MS+6-BA0. 5mg/L+IBA 0. 05mg/L+Hyg5mg/L+Cef400mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 6. 5g/L，pH 5. 8 ；生根筛选培养基为1/2MS+IBA0. 05mg/L+Hyg5mg/L+Cef400mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 6. 5g/L，pH 5. 8 ；YEP液体培养基为蛋白胨10g/L+酵母提取物10g/L+氯化钠5g/L ；实施例一(一 )菌液的准备挑取农杆菌EHA105的菌落接种到含有潮霉素50mg/L的10ml YEP液体培养基中， 于下，200rpm震荡培养M小时，取20 μ 1的菌液转接至50ml的YEP液体培养基中，于
下，200rpm震荡培养至菌体OD6tltl达到1. 0时，4°C条件下，通过12000rpm离心5min得到菌体，50mlMS液体培养基重新悬浮菌体，获得侵染菌液；( 二)转化参考Horsch的叶盘法M预培养在无菌条件下取生长键壮、大小、形状和色泽均一的转基因741杨无菌苗叶片，在靠近叶柄处1/3的部分，沿垂直主脉的方向剪下，并在叶片一侧垂直主脉剪1个伤口，伤口深达主脉，接种在分化培养基上进行预培养2天。共培养将经过预培养的叶片浸泡在已准备好的侵染菌液中15min进行侵染，取出叶片用无菌滤纸吸干后，转入共培养培养基上进行暗培养3天，培养温度为^rc。其中， 共培养培养基PH为5. 2。筛选培养用无菌水冲洗共培养后的叶片，然后用无菌滤纸吸干。将叶片转移到分化筛选培养基进行筛选培养，培养温度为^TC,光照强度为25001UX，光照时间为14小时/ 天，筛选培养2周之后，分化出抗性不定芽。继代筛选培养将上述抗性不定芽，转到继代筛选培养基中，培养温度为^rc,光照强度为25001UX，光照时间为14小时/天的条件下，每10天换一次培养基，培养30天后，逐渐有抗性芽产生。生根培养待抗性芽长到2 3cm时，转移至生根筛选培养基上诱导生根，培养2 周之后，获得抗性植株。(三)鉴定转基因植株的PCR检测农杆菌质粒DNA的提取参考《分子克隆实验指南》[7]操作，取1. 5mL过夜培养的农杆菌菌液，菌体OD6tltl达到0.8。4°C，12000rpm离心30s。移去培养基，将菌球留下，用滤纸将管壁的液体吸干；加入 100 μ L冰预冷的溶液I加入％ig/mL溶菌酶，后在振荡器上充分摇晃，直到菌球消失为止，放在冰浴里30min ；加入200 μ L新配制的溶液II轻轻地上下颠倒20次后，冰上放置5min ；力口入150 μ L溶液III轻轻地振荡5次后，冰上放置30min，每IOmin振荡一次；4°C，12000rpm 离心5min ；取400 μ L的上清液，冰浴条件下，加入400 μ L的1酚1氯仿混合液振荡，直到看不见分层为止，40C，12000rpm离心^iin ；取上清液400 μ L加入氯仿，振荡5min后，4°C， 12000rpm离心5min ；取上清液加入1/10体积的于_20°C保存的3M NaAC溶液中，然后加上 2. 5倍体积的冰冷的无水乙醇，_20°C中放置池；4°C，12000rpm离心2min，去除上清液，加入 500 μ L的70%乙醇，漂洗沉淀，4°C，12000rpm离心15min ；弃上清液，室温干燥；加入50 μ L 的pH8. 0的ΤΕ，含20 μ L/mL无DNA酶的RNase酶溶解DNA，短暂振荡，_20°C下保存DNA。上述溶液I、II、III以及pH8. 0的TE的配制见《分子克隆实验指南》[7]操作。植物总DNA的提取采用CTAB法[8]提取5株转基因植株的DNA，提取方法如下称取0. 2g转基因741杨的叶片放入干净的研钵中，加入5% PVP，再加入液氮，快速研磨成粉末；加入600 μ 1 CTAB提取缓冲液[8]，每个样品装一个1. 5μ 1的离心管中，65°C 温浴30min ；向每个离心管中加入400 μ L等体积的酚氯仿抽提液，震荡充分混勻。4°C， 12000rpm离心15min ；取上清液400 μ L，加入一新离心管中，再向此离心管中加入520 μ L 的冰冷的异丙醇和80μ L的3Μ NaAC溶液，上下颠倒几次使其充分混勻；_20°C下静置 30min ；4°C，12000rpm离心IOmin ；倒掉上清液，保留沉淀，用70%乙醇清洗3次；室温1. 5h 风干；加入150 μ L的pH8. 0的TE溶解，置于_20°C冰箱中储存备用。植物总DNA的PCR扩增及检测对转化植株用PCR法检测外源基因的整合情况，针对抗逆基因AtNDPK2的片段，设计一对引物，其目的片段大小为M4bp。上游引物5‘ -ATTTATCGGCAAGGTGGAGGTT-3 ‘，
下游引物5 ‘ -CCCGGTGAGGTGATTTGAA-3 ‘。PCR反应体系候选植株DNA 1 μ 1引物1:1μ 1引物2:1μ 1dNTP 2 μ 110 X PCR 缓冲液2. 5 μ 1Taq 酶0. 25 μ 1无菌水12. 25 μ 1
反应总体积20 μ 1所述的候选植株DNA的浓度为IOng// μ 1，引物浓度为10mM，dNTP浓度为10mM。反应条件94°C lmin,54°C lmin，72°C 2min，；35个循环；最后在72°C下继续延伸 IOmin0扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测。电泳检测结果见附图2。其中M :DL2000DNA Marker ；CK+ 以pCAMBIA1300为阳性对照；CK-以未转化植株叶片DNA为阴性对照；Yl TO 待检样品。电泳检测结果表明，在检测的5株抗性植株中有1个TO的抗性植株经过PCR扩增后得到一条约为540bp的片段，该片段大小与AtNDPK2基因大小基本一致，而未经过转基因的组培苗植株基因组Y1、Y2J4和TO中没有扩增出对应片段，因此可以说明抗性植株TO的外源AtNDPK2基因已经整合到该转基因741杨基因组中。实施例2潮霉素临界浓度的确定在遗传转化试验中，以潮霉素抗性基因为选择标记基因时，一般潮霉素的选择浓度为3 150mg/L，不同的物种、品种所用浓度差异较大，这表明不同的物种或品种对潮霉素有一定的天然抗性。潮霉素B作为选择剂时对野生型植株的影响是抑制肽链的延长，破坏细胞的翻译功能，使敏感组织褐化死亡。一般用于单子叶植物的筛选，而双子叶植物对它非常敏感。因此，本发明中设计了 8个潮霉素的浓度梯度，以确定转化试验中适合的潮霉素筛选浓度。在无菌条件下取生长健壮的无菌苗叶片，在靠近叶柄处1/3的部分，沿垂直主脉的方向剪下，并在叶片一侧垂直主脉剪1个伤口，伤口深达主脉，接种在加有不同潮霉素浓度的分化培养基上进行培养。潮霉素浓度梯度为0、l、2、3、5、7、10、15mg/L，每个梯度接种 40个叶片，共分4个培养皿，每个培养皿接种10个叶片。培养温度为，光照强度为25001x，光照时间为14小时/天，试验重复3次。观察叶片对一系列浓度梯度潮霉素的反应，培养21天后进行统计。本试验通过对320个叶片培养的观察，统计结果显示转基因741杨外植体对潮霉素非常敏感，低浓度的潮霉素即抑制外植体不定芽的分化，在不含有潮霉素的对照培养基， 外植体产生大量绿色丛生芽。附加不同质量浓度潮霉素后，在20天内外植体虽然无明显变化，但随着潮霉素浓度增加分化率越来越低，直至降到了零，在第20天以后，外植体则逐渐出现变黄现象，随着潮霉素浓度的增大，引起外植体进一步坏死。叶片在潮霉素为lmg/L或是ang/L的分化培养基上，产生少量不定芽，但不定芽的颜色淡黄，随着培养时间的延长， 不定芽多数死亡，当浓度为3mg/L时，叶片全部变黄，部分坏死不能分化出芽。因此Hyg3mg/ L即可作为叶片不定芽发生的临界浓度。如图1所示横坐标为潮霉素浓度，单位是mg/L ； 纵坐标为叶片的分化率、褐化率。实施例3共培养时间的确定在无菌条件下取生长键壮的无菌苗叶片，在靠近叶柄处1/3的部分，沿垂直主脉的方向剪下，并在叶片一侧垂直主脉剪1个伤口，伤口深达主脉，接种在分化培养基上进行预培养2天。培养温度沈！，光照强度25001X，光照时间14小时/天。将经过预培养的叶片在0D_值为1. O的农杆菌浸染菌液中浸泡15min，取出叶片，用无菌滤纸吸干后，转入共培养培养基上进行暗培养，培养温度为26°C。将共培养的时间设定为四个梯度1天、3天、 5天、10天，每个梯度共接种40块，分4个培养皿，每个培养皿接种10块。
共培养培养基为MS+6-BA1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+AS 200ymol/L上述实验重复3次，统计平均值。观察共培养时间对产生潮霉素抗性芽的影响，如表2。表2共培养时间对产生抗性芽的影响
权利要求
1.一种将抗逆基因导入转基因741杨的方法，其特征在于，具体步骤为I制备侵染菌液挑取农杆菌EHA105的菌落接种到含有潮霉素50mg/L的10 15ml YEP液体培养基中， 于下，200rpm震荡培养对小时，取10 100 μ 1的菌液转接至30 50ml的YEP液体培养基中，于下，200rpm震荡培养，待菌体OD6tltl达到0. 8 1. 0时，离心收集沉淀，用与离心前等体积的MS液体培养基重新悬浮沉淀后，即得侵染菌液；II转化a.预培养取转基因741杨无菌苗的叶片，在靠近叶柄1/3处沿垂直主脉的方向剪下， 并在叶片一侧垂直主脉剪1个伤口，伤口深达主脉，接种在分化培养基上进行预培养2天；所述的分化培养基为:MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6. 5g/L ；b.共培养将步骤IIa所得叶片完全浸没在步骤I制备的侵染菌液中10 20min，用无菌滤纸吸干叶片后，转入共培养培养基上，25 27°C进行暗培养3 5天；所述的共培养培养基为MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. lmg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6. 5g/L ；c.筛选培养用无菌水冲洗共培养后的叶片，然后用无菌滤纸吸干，将叶块转移到分化筛选培养基上培养，培养温度为25 27°C，光照强度为25001UX，光照时间为14小时/ 天，培养2-3周分化出抗性不定芽；所述的分化筛选培养基为MS+6-BA 1. Omg/L+IBA 0. Img/L+Hyg3mg/L+Cef400mg/L+ 蔗糖30g/L+琼脂粉6. 5g/L ；d.继代筛选培养将步骤c所得抗性不定芽转到继代筛选培养基中进行培养20 30 天获得抗性芽，每10天换一次培养基；培养温度为25 27°C，光照强度为25001UX，光照时间为14小时/天；所述的继代筛选培养基为MS+6-BA 0. 5mg/L+IBA 0. 05mg/L+Hyg5mg/L+Cef 400mg/L+ 蔗糖30g/L+琼脂粉6. 5g/L ；e.生根培养步骤d所得抗性芽长到2 3cm时，切下并插入生根筛选培养基上进行生根培养，培养2-3周，获得抗性植株；所述的生根筛选培养基为1/2MS+IBA 0. 05mg/L+Hyg5mg/L+Cef400mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂粉6. 5g/L ；III鉴定采用CTAB法提取步骤II所获的转化植株的DNA，以PCR法对候选植株DNA进行检测， 所用引物如下上游引物5 ‘ -ATTTATCGGCAAGGTGGAGGTT-3 ‘，下游引物5 ‘ -CCCGGTGAGGTGATTTGAA-3 ‘；PCR 反应条件-MV lmin, 54°C lmin，72°C 2min，35 个循环；72°C延伸 lOmin，扩增产物用0. 琼脂糖凝胶电泳检测。
2.根据权利要求1所述的将抗逆基因导入转基因741杨的方法，其特征在于步骤IIb 中叶片的侵染时间为15min。
3.根据权利要求1所述的将抗逆基因导入转基因741杨的方法，其特征在于步骤IIb 中共培养时间为3天。
4.根据权利要求1所述的将抗逆基因导入转基因741杨的方法，其特征在于步骤IIb 中共培养培养基PH为5. 2。
5.根据权利要求1所述的将抗逆基因导入转基因741杨的方法，其特征在于步骤IIb 所述的共培养培养基中加入乙酰丁香酮200 μ mol/L。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的将抗逆基因AtNDPK2导入转基因741杨的方法。本发明以转双抗虫基因741杨的叶片为外植体，将抗逆基因AtNDPK2通过农杆菌导入到转基因741杨中，并对最佳不定芽诱导培养基、继代培养基、最佳生根培养基，以及影响转化的几个因素，例如共培养时间、共培养培养基的pH、最佳潮霉素筛选浓度等进行了研究。本发明利用农杆菌介导法将抗逆基因AtNDPK2导入到转基因741杨中，获得了再生植株。同时建立了高效快速的转基因741杨组培再生体系，转基因741杨叶片的不定芽转化频率可达40％。
文档编号A01H5/00GK102329818SQ20111020726
公开日2012年1月25日 申请日期2011年7月22日 优先权日2011年7月22日
发明者姜国斌, 朱学静, 王颖, 郭鹏, 金华 申请人:大连民族学院