专利名称：一株耐旱地衣共生菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株耐旱地衣共生菌及其应用。
背景技术：
地衣(lichen)是由真菌与藻类或蓝细菌整合共生形成的，在形态上全然不同于真菌和藻类或蓝细菌的生命形式，是自然界中互惠共生的典范。地衣的主要成分是参与共生的真菌，地衣的形态特征几乎完全由其共生菌所决定，因此地衣共生菌的分类地位即为地衣的分类地位，即地衣共生菌的学名就是其地衣体的物种学名。地衣具有极强的生命力， 号称“拓荒者”和“先锋生物”，广泛分布于包括裸露的岩石、荒漠的地表、固化的火山岩浆、 极地冰洞介质的内部或表面的各种生境中。地衣与人类的关系十分密切。主要可以概括为两大类一是直接利用如作为草药入药，魏江春等(中国药用地衣，北京科学出版社.198 描述了与医药卫生有关的71 种地衣；地衣次生代谢产物可作为抗生素、抗癌物质，譬如有抗菌活性的松萝酸、地衣酚类， 有抗癌活性的地衣多糖、石耳多糖等；二是间接利用如地衣监测、评定大气质量。另外，一些种属的地衣因适应了荒漠生境，它们能几个月甚至几年耐受超过50°C的高温和干燥，在荒漠生态系统中发挥着不可替代的生态功能。如上所述，地衣不仅有药用价值，在荒漠生境中还具有稳定生态系统的重要作用。 但是，地衣生长缓慢，需要几年、几十年甚至上百年的生长期才能达到人们所需要的生物量，进而限制了对地衣的利用及其优势作用的发挥。幸运的是可以通过分离培养的方法，获得大量的地衣共生菌，直接或通过人工合成地衣的方式加以利用。因此，对地衣共生菌进行分离培养具有重要意义。Ahmadjian V.和HeikilS H.，曾对采集自美国爱荷华州韦弗利地区的石果衣标本进行分离培养，并得到石果衣Endocarpon pusillum Hewdig的共生菌与共生藻(1970， The culture and synthesis of Endocarpon pusillum and Staurothele clopima. Lichenologist,4 :259-267.)，但其地衣共生菌生长缓慢，需要一年之久。在国内，苏敏、 魏江春(Su Min, Wei Jiangchun,2008. Research on liquid culture of mycobiont and photobiont isolated from cladonia pyxidata. Journal of fungal research,6 57-62.)报道，分离得到喇叭石蕊Cladonia pyxidata (L. ) Hofm的共生菌与共生藻，但该分离标本采集地年均降雨量在500mm。随后曹叔楠、魏江春0009，荒漠地衣糙聚盘衣共生菌耐旱生物学研究及液体优化培养.菌物学报观790-796.)报道对采集自年均降雨量不足 IOOmrn甘肃文殊沟的Glypholecia scabra进行分离培养，但是只得到了共生菌，无相应的共生藻。最主要的问题是以上几株地衣共生菌并没有相应的耐旱能力的数据支持。
发明内容
本发明的目的是提供一株耐旱地衣共生菌及其应用。本发明所提供的地衣共生菌为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020，已于2010年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJ* 址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.3893。所述石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893的分离标本采集自腾格里沙漠东南缘的沙坡头地区，该采集地干旱多风，年均降雨量不足200mm，是沙漠生物资源“储存库”。所述石果衣共生菌Endocarponpusillum F07020 CGMCC No. 3893具有以下特征1)菌落直径0. 8-0. 9cm,菌落呈形不规则圆形，表面粗糙，边缘整齐或否，暗褐色至浅灰色；nrDNA-ITS(ITSl-5. 8S-ITS2)基因序列长度为557bp，其核苷酸序列如序列表序列1所示；2)生长周期短，在22°C、黑暗条件下、PDA培养基中培养30天达到对数生长期，生长曲线见图2;耐旱性强，在干燥条件下(相对湿度彡10%)可以存活7个月之久(图3， h)。本发明还提供一种培养所述石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的方法，该方法包括将所述的 Endocarpon pusillum F07020 在 20_24°C、如 22°C， 黑暗条件下培养的步骤，以获得所述Endocarpon pusillum F07020菌体。本发明所提供的Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893还可以用于生产水杨酸。具体的生产方法是从所述Endocarpon pusillum F07020菌体中提取水杨酸。本发明所提供的Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893单独使用即可与沙粒形成结皮，30天结皮厚度可达2mm，预示了该菌Endocarpon pusillum F07020CGMCC No. 3893在人工防沙固沙、治理荒漠和/或改善生态环境将有广阔的应用前景。
图 1 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 在不同培养
温度下的生长量。图 2 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的生长曲线。图 3 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 干旱胁迫实验结果。其中，a为对照，未进行干燥胁迫；h为干燥胁迫210天后，转接于PDA培养基仍可生长。图 4 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 形成的结皮。图 5 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 形成结皮的微观照。图6为水杨酸高效液相色谱图。其中，上图为标样谱图，水杨酸含量 1. 18Χ1(Γ8πιο1/μ 1 ；下图为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893谱图，每克鲜重菌体中水杨酸含量为2. 3631X 10_7mol。图 7 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A0702 OCGMCC No. 3892 在不同培
养温度下的生长量。图 8 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的生长曲线。
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图 9 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的耐旱性验证。其中a为对照，未进行干燥胁迫；b为干燥胁迫30天后，转接于PDA培养基仍可生长。图 10 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 形成的结皮。图 11 为石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 形成结皮的微观照。图12为实验室条件下石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 形成的结皮。图 13 为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 与共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892在室内共培养形成结皮的纵剖面电镜扫描图。图14为喷洒样方的制作。其中，左图为示意图，右图为实际的草障方格。图15为野外固沙实验形成人工地衣结皮。其中，左上图结皮已初具规模，右上图结皮厚度已达到0.4-0. 6cm，左下图对照未形成结皮，右下图已出现Endocarpon sp.。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本实施例中所使用的培养基成分如下琼脂(1. 5% WA)培养基琼脂粉15g，蒸馏水IL0大豆蛋白胨(DBD)液体培养基蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖lg，蒸馏水1L。土豆浸汁(PDA)培养基葡萄糖20g，琼脂粉15g，土豆浸汁1L，不加琼脂粉即为液体PDA培养基。实施例1、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020的分离、鉴定及特性1、地衣标本的采集与鉴定从腾格里沙漠东南缘的沙坡头地区(干旱多风，年均降雨量不足200mm)采集获得新鲜地衣标本，采用形态解剖学方法对该标本进行鉴定。选取成熟、发育良好的地衣体，放于盛有蒸馏水的培养皿中，使地衣体浸透变软，随后用干净滤纸吸去地衣体上的多余水分， 冷冻切片，在解剖镜下选取较薄的切片置于载玻片水滴中，加盖玻片，在显微镜下观察，结果如下地衣体鳞片叶状，鳞片叶聚集，紧密贴生于基物，宽约2_5mm，圆形至不规则形状，边缘完整至锯齿状，上表面深棕色至浅棕色，平坦至微下凹，下表面黑色具有菌丝和假根，假根黑色，5-7mm长，单一少分枝，每个鳞片叶单个或多个假根。子囊壳球形，直径 0. 1-0. 2mm每个鳞片叶1_6个，埋生于地衣体中，孔口周围深棕色。地衣体厚140-200 μ m，上皮层厚25-50 μ m，透明无色，为假薄壁组织；藻层厚 75-100 μ m,藻细胞直径5-10 μ m ；髓层厚10-25 μ m ；下皮层厚30-50 μ m,下部浅黑色，菌丝
细胞壁加厚。子囊壳通常圆形，内腔高220-400 μ m，宽200-380 μ m，果壳棕色，厚25-37 μ m，侧丝25-65 μ m长，子实层藻直径4-7 μ m,子囊棒状，50-65 X 15-22 μ m,子囊内含2个子囊孢子，砖壁型，长椭圆形，25-50 X 12-17 μ m。基物为沙土。通过以上观察结果，鉴定该荒漠地衣标本为石果衣Endocarpon pusillum Hedwig, Descript. Adumbr. Muse. Frondos. 56 (1789)。2、地衣共生菌的分离、培养利用孢子释放方法从步骤1获得的地衣标本中分离地衣共生菌，具体方法为将新鲜地衣标本的成熟子囊器，用水浸湿后吸去表面多余水分，用凡士林将子囊器倒置在培养皿盖内侧，培养皿下部为1. 5% WA培养基，每Ia1转动培养皿盖一次(因共生菌与共生藻孢子同时喷射，所以可以通过上述孢子释放方法同时得到共生菌与共生藻)，以获得单一孢子形成的菌落。当观察到孢子萌发后，将含有萌发子囊孢子的琼脂块转入PDA斜面培养基， 22°C黑暗培养地衣共生菌，生长后转入DBD液体培养基，150rpm黑暗培养。以上操作均在无菌条件下进行。通过上述方法获得一株地衣共生菌，将其命名为 F07020。3、地衣共生菌F07020的鉴定1)形态特征将地衣共生菌F07020接种于PDA斜面培养基上，22 °C黑暗培养30天，观察菌落形态。观察结果为菌落直径0.8-0. 9cm，呈不规则圆形，表面粗糙，边缘整齐或否，暗褐色至浅灰色。2)nrDNA-ITS(ITSr5. 8S_ITS2)序列的 PCR 扩增和序列测定A) DNA 提取分别取地衣体及其共生菌F0702010-20mg ；液氮研磨后加入300 μ 1 2 X CTAB,轻轻混勻，90°C水浴anin ；加入300μ 1酚氯仿异戊醇Q5 24 1)，振荡混勻，12000r/ min离心5min去除蛋白质；取上清加入等体积的DNA结合液(结合液成分4. Omol/L异硫氰酸胍，0. 5mol/L、pH5. 0乙酸钾，终体积浓度为30%的异丙醇)颠倒混勻，随即移入吸附柱静置2min，12000r/mim离心15s，弃残液；加入300 μ 1洗涤液(洗涤液成分:10mmol/L，终体积浓度为80%的乙醇)，12000r/min离心15s，去残液，重复一次；12000r/min离心干燥 Imin ；将吸附柱移入新无菌离心管，加入30 μ ITE洗脱液静置5min, 12000r/min离心15s, 重复洗涤一次，去除吸附柱，离心管内即为DNA模板。B) nrDNA-ITS(ITSr5. 8S_ITS2)基因的 PCR 扩增及序列测序用实施例1的地衣标本及其共生菌F07020 PCR扩增的正向引物为ITS15，-TC CGTAGGTGAACCTGCGG-3，(SSU ntl769_1787)，反向引物为 ITS45，-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3，(LSU nt60-79) ；PCR 扩增体系(50 μ 1) :10Xbuffer5y 1 ；25mmol/L MgCl2 3μ 1 ； 2. 5mmol/L dNTPs 4 μ 1 ； 10ymol/L 引物各 1 μ 1 ；ddH2034y 1 ；Taq DNA 酶 1 μ 1(0. 25U)；模板1μ l(50ug)。PCR扩增条件为 95°C 180s, 94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 90s，37 个循环；72°C 600s，4°C 保存。PCR扩增产物经北京标凯生物技术有限公司测序，测序结果经DNAman5. 2. 2进行双序列比对分析。测序结果表明，荒漠地衣及其共生菌F07020的IirDNA-ITSdTS1-S. 8S_ITS2)序列长度均为^7bp，其核苷酸序列完全相同(如序列表序列1所示)，表明该荒漠地衣共生菌
6由其相应标本分离得到。根据地衣共生菌的学名就是其地衣物种的学名，以及荒漠地衣共生菌F07020与荒漠地衣标本nrDNA-ITSdTSi-5. 8S_ITS2)同源序列的比对结果，将荒漠地衣共生菌F07020鉴定为石果衣共生菌Endocarpon pusillum Hedwig。石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020已于2010年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No. 3893。4、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的生长特性1)培养温度的筛选定量挑取石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCCNo. 3893，转接于DBD液体培养基中，黑暗条件，分别在10°C，16 °C，22 °C，观°C， 340C 150rpm振荡培养45天，每个温度3个重复，取平均值筛选地衣共生菌最适培养温度。 以培养温度为横坐标，菌丝干重为纵坐标绘制柱形图(图1)。2)生长曲线的绘制挑取定量石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCCNo. 3893，转接于DBD液体培养基中，22°C，黑暗条件，150rpm振荡培养，每15天测定一次菌丝干重，每次3个重复，取平均值，以培养时间为横坐标，菌丝干重为纵坐标绘制生长曲线(图2)。图1中对不同培养温度下石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893的生长量进行多重比较(α = 0. 05)，以标记字母法(a、b、c)表示比较的结果， 结果显示，该共生菌在10°C到均可生长，在22°C培养时显著高于其他培养温度下的生长量；从图2可以看出，该菌在22°C培养30天后到达对数生长期，与AhmadjianV. and Heikila H. (1970) 艮道的地衣共生菌(The culture and synthesis of Endocarpon pusillum and Staurothele clopima. Lichenologist,4 :259-267.)需培养 1 年相比，差异显者。5、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的耐旱性1)活化将对数生长期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893转接入PDA液体培养基中，150rpm黑暗培养30天。2)干燥胁迫在无菌条件下，将步骤1)得到的菌液转入不含培养基的培养皿(直径35mm)中，将培养皿放入含变色硅胶的干燥器中(相对空气湿度< 10%，环境温度为 20 27°C，自然光照条件)，以造成干燥胁迫。每月将胁迫处理的石果衣共生菌转接到含固体PDA培养基中，环境温度20 270C，黑暗培养，并观察石果衣共生菌的生长情况。对照初始未胁迫的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893。上述石果衣共生菌Endocarponpusillum F07020 CGMCC No. 3893在干燥胁迫210 天后仍未死亡，转接于PDA培养基培养后，证明其仍有活性(图3，h)。实施例2、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的固沙实验活化将对数生长期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893转接入液体PDA培养基中，150rpm黑暗培养30天。将活化后的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020菌丝球在无菌条件下研碎，用无菌水稀释至浓度为1. 57g/ml (以菌丝球湿重计)后撒播于铺有无菌沙粒培养皿中 (培养皿直径10cm，沙粒厚5mm，以无菌水刚刚润湿沙粒为准)，每皿喷施5mL，使该共生菌的撒播量为0. lg/cm2(以菌丝球湿重计)，12h光照/1 黑暗，20°C培养30天后观察。石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 在 30 天后有新鲜菌丝长出，同时可以见到新形成的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020菌丝与沙粒形成的结皮，厚2mm(图4，图5)以上实施例(实施例1-实施例2)表明，本发明提供的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893具有可培养、生长周期短、耐旱性强的优势。并且在人工培养条件下可与沙粒形成结皮，预示利用该石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893进行人工生物结皮固沙、防沙的巨大潜力，在人工防沙固沙、治理荒漠和改善生态环境方面具有广阔的应用前景。实施例3、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 生产水杨
酸取0. 3g培养至对数生长期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893, 5mL 5%三氯乙酸研磨勻浆后，用1 1体积乙醚浸提，旋转蒸干后加入ImL缓冲液溶解(甲醇乙酸=1 1，ρΗ3. 2)，采用高效液相色谱测定化学物质含量。结果发现石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893中含有水杨酸(图6)，这是第一次在地衣共生菌中发现该物质。图6为水杨酸高效液相色谱图。其中，上图为标样谱图，水杨酸含量 1. 18Χ10_8πιΟ1/μ 1，水杨酸峰面积是3651. 13，保留时间是22. 990分钟；下图为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020谱图，水杨酸峰面积是7. 3177，保留时间是23. 005分钟， 每克鲜重菌体中水杨酸含量为2. 3631X 10_7mol。实施例4、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 与藻形成地衣共同固沙一、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的分离鉴定1、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的分离鉴定1)分离培养利用孢子释放方法从实施例1获得的地衣标本中分离地衣共生藻，具体方法为 将新鲜地衣标本的成熟子囊器，用水浸湿后吸去表面多余水分，用凡士林将子囊器倒置在培养皿盖内侧，培养皿下部为1. 5% WA培养基，为获得单一孢子萌发形成的藻落，每1 转动培养皿盖一次(因共生菌与共生藻孢子同时喷射，所以可以通过上述孢子释放方法同时得到共生菌与共生藻)，当观察到有藻生长后，转入PDA斜面培养基，220C，12h光照/1 黑暗，光照强度20001UX条件下培养地衣共生藻，大量生长后转入DBD液体培养基，150rpm振荡培养。以上操作均在无菌条件下进行，通过上述方法获得一株地衣共生藻，将其命名为 A07020。2)地衣共生藻A07020的鉴定A)形态特征将地衣共生藻藻株A07020接种于PDA斜面培养基，在22°C，12h光照12h黑暗，光
8强20001UX条件下培养10天，观察藻细胞形态。观察结果为细胞椭圆形至钝圆柱形；椭圆形细胞大小为3. 8 X 4. 8 μ m，圆柱形细胞长5. 8-8. 6 μ m，宽3. 8-4. 8 μ m ；叶绿体片状、侧生； 细胞外侧有水质胶壳包裹。B) nrDNA-ITS(ITSr5. 8S_ITS2)序列的 PCR 扩增和序列测定DNA提取分别取10_20mg荒漠地衣标本及其地衣共生藻A07020 ；液氮研磨；加入 300 μ 1 2父07^，轻轻混勻，901水浴&^11 ；加入300 μ 1酚氯仿异戊醇05 24 1)， 振荡混勻，12000r/min离心5min去除蛋白质；取上清加入等体积的DNA结合液(4. Omol/L 异硫氰酸胍，0. 5mol/L,pH5. 0乙酸钾，终体积浓度为30%异丙醇)颠倒混勻，随即移入吸附柱静置2min, 12000r/mim离心15s，弃残液；加入300 μ 1洗涤液(10mmol/L, ρΗ5· 0乙酸钾， 终体积浓度为80%乙醇)，12000r/min离心15s，去残液，重复一次；12000r/min离心干燥 Imin ；将吸附柱移入新无菌离心管，加入30 μ 1 TE洗脱液静置5min，12000r/min离心15s， 重复洗涤一次，去除吸附柱，离心管内即为DNA模板。nrDNA-ITS(ITSr5. 8S_ITS2)基因的PCR扩增及序列测序用实施例1的地衣标本及其地衣共生藻A07020PCR扩增的正向引物为nr-SSU-1780-5’ -CTGCGGAAGGATCATTGAT TC-3，(18S nt 1780-1800)，反向引物为 nr-LSU-0012-5，-AGTTCAGCGGGTGGTCTTG-3，(28S nt0012-0030)。PCR 扩增体系(50 μ 1) :10Xbuffer5y 1 ；25mmol/L MgCl23 μ 1 ；2. 5mmol/L dNTPs 4 μ 1 ;10 μ mol/L 引物各 1 μ 1 ；ddH2034 μ 1 ；Taq DNA 酶 1 μ 1 ；模板 1 μ 1。PCR 扩增条件为 95°C 180s, 94°C 30s, 52°C 30s，72°C 90s，37 个循环；72°C 600s，4°C保存。PCR扩增产物经北京标凯生物技术有限公司测序，测序结果经DNAman5. 2. 2进行双序列比对分析。测序结果表明，地衣标本及其共生藻A07020 WnrDNA-ITS(ITS1-S-SS-ITS2)序列长度均为744bp，其核苷酸序列完全相同(如序列表序列2所示)，表明该地衣标本的共生藻由其相应标本分离得到。将地衣共生藻A07020 WnrDNA-ITS(ITS1-S-SS-ITS2)序列在Genbank中进 亍同源比对分析，其序列与Stichococcus diplosphaera Chodat = Diplosphaera chodatii BialosukniamnrDNA-ITS(ITS1-S-SS-ITS2)序列相似性相似度为100%。根据形态特征以及IirDNA-ITSaTS1-S^S-ITS2)序列在Genbank中同源序列的比对结果，将地衣共生藻A07020鉴定为Diplosphaera chodatii Bialosuknia。石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020已于2010年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No. 3892。2、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的生长特性1)培养温度的筛选挑取定量石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCCNo. 3892，转接于DBD液体培养基中，1 光照12h黑暗，光照强度为20001ux分别在 IO0C，16°C，220C ,28°C, 34°C 150rpm振荡培养30天，每个温度3个重复，取平均值筛选地衣共生藻最适培养温度。以培养温度为横坐标，藻细胞叶绿素在665nm处的吸光值为纵坐标绘制柱形图(图7)。幻生长曲线的绘制挑取定量石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCCNo. 3892，转接于DBD液体培养基中，22 °C，150rpm 12h光照12h黑暗，光照强度为 20001ux培养，通过叶绿素在665nm处的吸光值测定共生藻的生长量，每3天测定一次，每次3个重复，以培养时间为横坐标，665nm处吸光值为纵坐标绘制生长曲线(图8)。图7中，对在不同温度下培养的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020CGMCC No. 3892的吸光值进行多重比较(α = 0. 05)，以标记字母法(a、b、c)表示比较的结果，结果显示，该地衣共生藻在10°C到34°C之间都可以生长，在培养温度为22°C时具有最大生长量。从图8可以看出，在22°C，150rpm 1 光照1 黑暗，光照强度为20001ux 条件下培养10天后石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020CGMCC No. 3892达到对数生长期。3、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的耐旱性1)活化将对数生长期的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892转接入液体PDA培养基中，150rpm黑暗培养10天。2)干燥胁迫无菌条件下，将1)得到的藻液转入不含培养基的培养皿(直径 35mm)中，将培养皿放入含变色硅胶的干燥器中(相对空气湿度< 10 %，环境温度为20 27°C，自然光照条件)，以造成干燥胁迫。每月将胁迫处理的荒漠地衣共生藻A07020转接到固体PDA培养基中，环境温度 20 27°C，黑暗培养，并观察共生藻的生长情况(图9)。对照初始未胁迫石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892(图 9，a)。上述石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 在干燥胁迫 30天后仍未死亡，转接于PDA培养基培养后，证明其仍有活性(图9，b)。4、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的固沙实验活化将石果衣共生藻Diplosphaerachodatii A07020 CGMCC No. 3892接入土豆浸汁(PDA)液体培养基中，22°C、150rpm，12h光照(20001ux)/12h黑暗培养10大。将活化后的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 藻悬液在无菌条件下撒播于铺有无菌沙粒培养皿中(沙粒厚约5mm，以无菌水刚刚润湿沙粒为准)，使该共生藻的撒播量为0. 42X IO6个细胞/平方厘米，12h光照(20001uX)/12h黑暗条件下，20°C培养，60天后观察到该共生藻与沙粒形成的藻结皮，绿色藻层厚约2mm(图10， 图 11)。二、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 与共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 共培养制备地衣与固沙1、室内共培养制备地衣与固沙实验将石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 与共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 分别接种于PDA斜面培养基上，活化 15 天后，当观察到培养基上有上述地衣共生菌和共生藻生长后，将地衣共生菌和共生藻分别转接入PDA液体培养基中150rpm大量培养，培养周期分别为30天和20天，培养条件分别为 共生菌22°C暗培养；共生藻22°C、l i光照(光照强度20001ιιΧ)/1 !暗培养。将培养至对数生长期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 与共生藻 Diplosphaera chodatii A07020CGMCC No. 3892 混勻，使共生菌与共生藻的浓度分别为0.785g/mL(以菌丝球湿重计)和3. 25X IO6个细胞/mL。将得到的混合液均勻喷洒于无菌沙土表面，沙土颗粒大小均一，盛于直径IOcm的无菌平皿中，厚约
100. 5cm,每皿喷施5mL混合液，做3皿重复，平皿密封后置于光照培养箱中，22°C、1 光照 (20001ux)/12h黑暗条件下培养，定期观察。培养12个月后，三个重复均观察到石果衣地衣共生菌与共生藻形成结皮，并且固着在沙土颗粒之上，覆盖了平皿的80% (图12)。同时，对结皮进行纵切，通过扫描电镜观察发现石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 与共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892发生接触，并且菌丝将藻细胞包裹在内(图13)，说明二者已经共生形成地衣的初始阶段，并且起到固着沙粒的作用。2、野外固沙实验在平整固定沙丘上清理3个约0. 5m2的沙面，然后用麦草将每个沙面分成两部分， 形成草障方格，即0. 4X0. 5m区作为喷洒清水对照方，0. 6X0. 5m区作为喷洒悬浮液实验方 (图 14)。将处于对数生长期的地衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 和共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892及野外收集的地衣碎片(经鉴定，该地衣为石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892共生形成的石果衣)与水混合，混合后得到浓度分别为0. 5g/ml (以菌丝球湿重计)、0· 21 X IO7个细胞/ml、5X 10_3g/ml的悬浮液， 然后按每平方米IL悬浮液均勻撒播于实验方沙土表面，每3天用清水浇灌一次，观察。对照样方喷洒清水，用量与悬浮液体积相同，其他管理均相同。以上处理辅以保水剂(Super Absorbent Polymers，简称SAP，购自北京金元易生态工程技术中心)，将保水剂以250g/m2的用量撒播于草方格之上保持水分。上述地衣碎片的制备方法如下将地衣(经鉴定该地衣为石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 禾口共生藻 Diplosphaera chodatii A07020CGMCC No. 3892共生形成的石果衣)及其下4mm-12mm的土壤同时取下，碾碎经直径 0. 5cm的筛网过滤，获得均一大小的地衣碎片。结果在12个月后的地衣结皮在自然条件下均已初具规模(图15，左上)，结皮厚度均已达0. 4-0. 6cm(图15，右上)，与对照方的差异明显(图15，左下)，且有地衣着生 (图15，右下)。以上结果表明，该地衣及其共生藻与共生菌可以直接促进地衣结皮的形成，缩短了微型生物结皮成熟的时间，操作简便，可以有效持久固沙，提高荒漠生态系统的营养元素及生物多样性，同时其形成的生态景观不仅可以为荒漠地区旅游业带来经济价值，而且可以为干旱半干旱地区城镇绿化提供材料。
权利要求
1.Endocarpon pusillum F07020，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏登记号为CGMCC No. 3893。
2.权利要求1所述Endocarponpusillum F07020的培养方法，包括将权利要求1所述的Endocarpon pusillum F07020在如下温度和光照条件下培养获得权利要求1所述的 Endocarpon pusillum F07020 的菌体的步骤:20°C -24°C、黑暗。
3.权利要求1所述的Endocarponpusillum F07020在人工防沙固沙中的应用。
4.权利要求1所述的Endocarponpusillum F07020在治理荒漠中的应用。
5.权利要求1所述的Endocarponpusillum F07020在改善生态环境中的应用。
6.权利要求1所述的Endocarponpusillum F07020在生产水杨酸中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述生产水杨酸是从权利要求1所述 Endocarpon pusillum F07020的菌体中提取水杨酸。
8.权利要求1所述的Endocarponpusillum F07020在制备地衣体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株耐旱地衣共生菌及其应用。该地衣共生菌为Endocarponpusillum F07020，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏登记号为CGMCC No.3893。Endocarpon pusillum F07020可用于提取水杨酸，且该菌耐旱性强，单独使用即可与沙粒形成结皮，30天结皮厚度可达2mm，预示了该菌Endocarponpusillum F07020 CGMCC No.3893在人工防沙固沙、治理荒漠和/或改善生态环境将有广阔的应用前景。
文档编号A01H15/00GK102308753SQ20111026196
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月6日 优先权日2010年9月29日
发明者周启明, 张涛, 曹叔楠, 魏江春 申请人:中国科学院微生物研究所