专利名称：一种花生抗连作复合菌剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物领域的复合菌剂，尤其涉及一种花生抗连作复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
众所周知花生是重要的油料作物之一，山东省是中国最重要的花生产区和出口创汇基地之一，主要种植区在胶东半岛、山东南部和山东中西部等区域。常年播种面积一般在85hm2以上，总产量在350多吨以上，分别占全国的20%和28%，2006年单产高达4256 kg/hm2，年出口量在50万吨以上，约占全国出口量的70%，播种面积、总产、单产和出口创汇均居全国首位。近年来，山东省花生种植面积大，产区集中，但每年都有较大的连作面积，约有14万hm2，个别县、市花生连作面积占总播种面积的40%，并有逐年增加的趋势。由于山东省花生生产面积大，产区相对集中，连作面积常年占全省花生面积的1/4-1/3，是影响山东花生生产的主要因素之一。据张思苏等人多年试验和调查结果，连作花生一般生长不良，减产10%以上，高者达30%以上，且随着连作年限的增加，减产愈重。花生连作多年，土壤微生物的数量与组成发生了改变，细菌数量减少，真菌数量增加。根系分泌物在连作障碍中起到了直接或间接的作用。越来越多的试验证明，作物的连作障碍与根系分泌物中的化感物质密切相关。Rice等在大量研究的基础上提出，引起作物化感作用的物质主要是植物体内次生代谢产物，化感物质是在次生代谢中通过醋酸途径或莽草酸途径而产生的。Yu J. Q和Mat su I从黄瓜的根分泌物中分离出11种酚类物质，有10种酚类物质具有生物毒性，在黄瓜连作种植过程中，根系释放的酚类物质积累到一定程度，就会抑制下茬作物的生长。十六烷酸、油酸等是已经被鉴定其杀菌剂及抑制高等植物生长作用的物质，邻苯二甲酸在大豆的根系分泌物中也有发现等，且被列为化感物质
随着化肥的广泛使用，给种植业带来了一场产量革命，但连续使用化肥使土壤中微生物生态平衡遭到破坏，土壤板结硬化，土传病害加剧，更令人担忧的是人类生存环境遭受污染。世界范围内开始研究解决土壤的改良问题，最早生物菌肥的有美国的固氮菌、日本的BOM菌等，且在我国有使用，但价格较贵，功能单一，推广受到限制；我国多数厂家生产的菌肥大多为单一菌种，功能单一，效果不显著，且花生抗连作专用菌剂在我国还很少有生产使用。
发明内容
本发明的目的旨在克服上述现有技术的不足，提供了一种花生抗连作复合菌剂及其制备方法和应用，本发明提供了一种花生专用、能降解引起花生连作障碍的化感物质的微生物复合菌剂，具体地讲是以花生化感物质降解菌为主体，并配有多种菌种制成的能够降解花生化感物质的复合菌剂。本发明提供得的几种菌株能够将碳链较长的对花生根系生长有害的根系分泌物分解成碳链较短的对花生根系生长无害的物质，特别是对已经公认的化感物质十六烷酸、油酸、邻苯二甲酸等进行降解，并使这些无害物质在土壤中成为微生物的碳源，降低土壤酸性，改善土壤理化性状，增加土壤保水性，且能促进有益细菌生长，调节连作花生土壤中微生物的结构，增强土壤抗病虫害能力。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现
本发明提供了里拉微球菌06，其保藏编号是=CGMCC 5064 ;理氏勒米诺氏菌L2，其保藏编号是CGMCC 5063 ;紫金牛叶杆菌C3，其保藏编号是CGMCC 5065。还提供了一种花生抗连作复合菌剂，它含有里拉微球菌06、理氏勒米诺氏菌L2、紫金牛叶杆菌C3菌株中一种或几种的复合菌悬液。对技术方案的进一步改进所述菌悬液的有效活菌数为I X IOlt^L AXIOki cfu/ml，所述里拉微球菌06 :理氏勒米诺氏菌L2 :紫金牛叶杆菌C3的菌数比例为5:1:1。 本发明还提供了花生抗连作复合菌剂的制备方法，分别将所述里拉微球菌06接种到含油酸的培养基中、理氏勒米诺氏菌L2接种到含邻苯二甲酸培养基中、紫金牛叶杆菌C3接种到含十六烷酸的培养基中，振荡培养，再按照1%接种量接种到液体培养基中，振荡培养。本发明还提供了花生抗连作复合菌剂在花生抗连作中的应用。对技术方案的进一步改进所述复合菌剂可以降解花生中的化感物质。对技术方案的进一步改进所述化感物质为油酸、邻苯二甲酸和十六烷酸。对技术方案的进一步改进将所述复合菌悬液稀释1000-2000倍施入土壤中。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是
I、本发明的复合菌剂对化感物质降解效率高。由于本发明使用的菌株都筛选自花生根际土壤，充分利用了土壤中降解细菌的作用，高效的降解根际连作残留的化感物质，降解率达75%。2、本发明的复合菌剂无污染。本发明是采用生物技术，以天然土壤中存在的菌种为主，其降解后的产物能够被细菌作为碳源转化为无害物质，增加土壤碳源，有利于作物根系对降解物质的吸收，不存在对环境产生污染。3、本发明的菌株稳定性好。这三种菌株能够连续培养后不会发生基因突变，其降解特性能够稳定遗传；同时能够增加土壤中有益细菌的数量，提高土壤肥力。4、本发明复合菌剂的制备方法采用生物技术中常用方法，条件简单温和，提取工艺简单，而且制备过程中不加入有毒物质，使用简单。
图I是本发明中根系分泌物的气相色谱图谱，其中I :十二酸，2 :十四酸，3 :十六烷酸，4:硬脂酸，5:油酸，6:丁二酸，7:邻苯二甲酸。图2是本发明中邻苯二甲酸降解菌菌株L2的淀粉降解试验鉴定结果。图3是本发明中油酸降解菌菌株06的淀粉降解试验鉴定结果。图4是本发明中十六烷酸降解菌菌株C3的淀粉降解试验鉴定结果。
图5是本发明中里拉微球菌06降解油酸的的降解率测定图谱。
图6是本发明中理氏勒米诺氏菌L2降解邻苯二甲酸的的降解率测定图谱。
图7是本发明中紫金牛叶杆菌C3降解十六烷酸的的降解率测定图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例I I、菌种来源
土壤采集于莱西市古河镇东龙湾庄连续种植花生多年的花生地，分别是花生连作I年、2年、4年、7年的土壤，土壤类型是河潮土，土壤质地类型为砂土，花生品种为花育16号。将样品花生根部的土样用刷子刷入自封袋，并采集根系周围2mm范围内的的土壤，总共收集土重约500g左右，冷藏用于微生物的筛选测定及化感物质的分离鉴定。2、菌种筛选方法
营养琼脂培养基(NA培养基)蛋白胨5. Og ;牛肉浸膏3. Og ;葡萄糖2. 5g ;酵母粉I. Og ;琼脂粉16. 0-18. Og ;蒸馏水1000ml ；pH7. 0-7. 2。另配制NA液体培养基。 无碳基础培养基(CM培养基)K2HPO4 7. 5g ；KH2PO4 2. Og ；MgS04 7H20 0. 2g ；CaCl2 2H20 15mg ；NaCl 0. 5g ； (NH4) 2S04 2. Og ;蒸馏水 1000ml ；pH 7. 2-7. 6。花生化感物质油酸、邻苯二甲酸、十六烷酸，这些化感物质在实验中被测出，其含量比例约为5:1:1。这些化感物质对花生发芽率、株高、根长和叶绿素都有影响，花生连作4年含量即达到较高水平，有较显著的抑制作用。筛选步骤取新鲜土样10 g加入到分别含有油酸2%、邻苯二甲酸1%。、十六烷酸2%的100 ml CM培养基中，置于170 r/min，30°C摇床上培养72 h。继代培养三次，吸取100U I培养液接种到NA平板上，30°C培养24h，然后根据菌落的不同形态随机挑取单菌落纯化3代后保存，待测定它们的降解效能。气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定它们的降解效能后，选取降解效率高、遗传稳定的菌株进行菌种鉴定。化感物质十六烷酸、油酸、邻苯二甲酸的降解率的测定方法将NA培养基分装到IOml的试管中，试管中单独添加已灭菌的油酸2%、邻苯二甲酸1%。、十六烷酸2%的，并分别接种对应的降解菌株I环，置于30°C恒温振荡机，调速170r/min条件下培养72h，按3ml、3ml、4ml顺序分别三次加入I :1的乙醇-乙醚溶剂，振荡lmin，取上层溶液，收集后在旋转蒸发仪中，在40°C转速60r/min条件下蒸干,用lml、lml、lml的1%H2S04-甲醇溶液洗蒸馏瓶三次，将溶液收集于25ml三角瓶中加盖弯径小漏斗，于70°C恒温水浴锅中恒温水浴60min，冷却后按3ml、3ml、4ml顺序加入正己烷萃取，将上清液收集于IOml容量瓶中待上机用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定。GC测定土壤中化感物质的含量见图I。根据峰面积测定出土壤中化感物质的相对含量。由气相色谱图(图I)测得土壤中各种根系分泌物的含量，分别为十六烷酸134. 03mg/kg,油酸284. 12mg/kg,邻苯二甲酸11. 58mg/kg (化感物质在该含量下花生无法正常生长)。气相色谱法(GC)测定条件:GC分析在青岛农业大学中心实验室测定，在AgilentTechnologies HP6890N气相色谱仪上进行，采用FID检测器。GC条件柱子型号HP-FFAP，规格 30mX320 u mXO. 25 u m,不分流，载气 He 气(99%)，流量 10ml/min，柱温从 120-280°C，程序升温20°C /min,并在280°C时保持5min，进样口温度120°C，检测器温度280°C，进样量I y I。3、菌种鉴定
GC测定化感物质的降解率，降解率的计算公式为降解率(％)=(对照样品残留量-处理样品残留量)/对照样品残留量X 100%。根据实验结果挑出对化感物质降解能力较高、生长力旺盛且能够稳定遗传的菌株作为目标菌株，做进一步的测试鉴定。参考东秀珠等的方法对降解菌株进行常规形态学鉴定及生理生化测定(东秀珠等.常见细菌系统鉴定手册.北京，科学出版社，2001:353-379)。表I :三个菌株的形态特征
权利要求
1.里拉微球菌06，其保藏编号是CGMCC5064。
2.理氏勒米诺氏菌L2，其保藏编号是CGMCC5063。
3.紫金牛叶杆菌C3，其保藏编号是CGMCC5065。
4.一种花生抗连作复合菌剂，其特征在于它含有里拉微球菌06、理氏勒米诺氏菌L2、紫金牛叶杆菌C3菌株中一种或几种的复合菌悬液。
5.根据权利要求4所述的一种花生抗连作复合菌剂，其特征在于所述菌悬液的有效活菌数为IxiO1c^ljxiOu1 cfu/ml，所述里拉微球菌06 :理氏勒米诺氏菌L2 :紫金牛叶杆菌C3的菌数比例为5:1:1。
6.一种根据权利要求5所述的花生抗连作复合菌剂的制备方法，其特征在于分别将所述里拉微球菌06接种到含油酸的培养基中、理氏勒米诺氏菌L2接种到含邻苯二甲酸培养基中、紫金牛叶杆菌C3接种到含十六烷酸的培养基中，振荡培养，再按照1%接种量接种到液体培养基中，振荡培养。
7.根据权利要求4所述的一种花生抗连作复合菌剂在花生抗连作中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种花生抗连作复合菌剂在花生抗连作中的应用，其特征在于所述复合菌剂可以降解花生中的化感物质。
9.根据权利要求8所述的一种花生抗连作复合菌剂在花生抗连作中的应用，其特征在于所述化感物质为油酸、邻苯二甲酸和十六烷酸。
10.根据权利要求8所述的一种花生抗连作复合菌剂在花生抗连作中的应用，其特征在于将所述复合菌悬液稀释1000-2000倍施入土壤中。
全文摘要
本发明提供了一种花生抗连作复合菌剂及其制备方法和应用，具体提供了里拉微球菌O6、理氏勒米诺氏菌L2、紫金牛叶杆菌C3，以及花生抗连作复合菌剂。本发明的复合菌剂对化感物质降解效率高；它以天然土壤中存在的菌种为主，其降解后的产物能够被细菌作为碳源转化为无害物质，增加土壤碳源，有利于作物根系对降解物质的吸收，不存在对环境产生污染；本发明的三种菌株能够连续培养后不会发生基因突变，其降解特性能够稳定遗传；同时能够增加土壤中有益细菌的数量，提高土壤肥力；而且本发明复合菌剂的制备方法简单，提取工艺简单，而且制备过程中不加入有毒物质，使用简单。
文档编号A01P21/00GK102776136SQ20111026219
公开日2012年11月14日 申请日期2011年9月6日 优先权日2011年9月6日
发明者咸洪泉, 宋杰, 崔德杰, 李旭霖, 袁云云 申请人:青岛三农富康肥料有限公司, 青岛农业大学