专利名称：一种红树植物根际纤维素降解真菌新种Xylariaceae sp. DPZ-SY43及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种红树植物根际纤维素降解真菌新种 Xylariaceae sp. DPZ-SY43及其在生产纤维素酶和制备生物有机质降解菌肥中的应用。
背景技术：
红树林生态系统(Mangrove ecosystems)是处于热带、亚热带海岸潮间带，包括种类丰富的动物群落、红树木本植物群落，微生物群落的复杂而独特的生态系统，在沿岸自然海洋生态系统中能维持较高的生产力水平，是海岸带重要的湿地生态系统类型之一 (Holguin et al.，2001 ；曹启民等，2008)。由于地处海洋、陆地交界处，其潮间带生境的高度盐责化、土壤的缺氧、高光辐射及周期性的海水浸淹，使其蕴涵大量的独特微生物、酶和基因资源(Takeuchi M et al，1998 ；Lyimo TJ et al.，2000)。红树林生态系统中，植物凋落物、有机碎屑含量非常丰富。蕴涵着大量的降解纤维素、木质素和几丁质等大分子有机物的微生物(Pointing SB et al.，1999 ；Yuan KP et al.，2005)。但由于红树林生态系统被认识的相对较晚，对其微生物资源的组成、分布、功能和结构知之甚少。虽然国内外关于纤维素降解菌株的研究报道有很多(Andreas Ulrich et al.，2008 ；Moon-Jung Cho et al.， 2010)，但来源于红树林生态系统的纤维素降解微生物的研究报道却很少(Yuan kang-pei et al.，200 。故应该加强对本土红树林生态系统中纤维素降解微生物等生物质资源的发掘与利用。随着经济和社会的发展，化石燃料的供应日益紧缺，寻找和开发可再生能源和新能源成为世界各国的普遍共识。美国能源部在1993年和1997年两次规划中都将生物质能源作为重点发展方向，并预测2010年生物能源将占整个能源市场的50%。2000年欧盟提出了清洁能源“绿皮书”，又于2002年启动了“欧洲聪明能源计划”，计划2010年生物能源达到12%左右。我国于“八五计划”期间逐步开始了生物质能源的开发利用研究，已取得了一定的研究成果。纤维素是一类重要的生物质能源，它是地球上光合作用的初级产物，占植物干重的35%-45%，每年全球生物合成的可再生性纤维素达1000亿吨以上(Lyndl R et al.，200幻。我国是农业大国，每年可产生大量的秸秆纤维素，但主要是通过传统简单的焚烧方式利用，能源利用率极低，环境污染较大。如何高效地利用纤维素资源已成为关乎国家能源安全的重要议题。由于微生物在纤维素利用方面的独特优势，寻找新的纤维素利用菌种和开发高产纤维素酶菌种，是纤维素资源高效利用的关键。由于真菌和细菌、放线菌相比具有较全的酶系，FPA酶活、CMC酶活都比后两者高，故国内外用于研究生产纤维素酶的微生物大多属于真菌。国内外对纤维素降解真菌的研究已有20多年的历程，研究报道集中于白腐菌、平革菌、栓菌等几个菌属(Christopher HV et al. ,2003 ；Lekounougou S et al.， 2008)，其中木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌，世界纤维素酶市场中20%的纤维素酶来自木霉属和曲霉属。但近年来，新的纤维素降解菌株的研究报道也日渐增多(Mario CNS et al.，2008 ；Revankar MS et al. ,2006)。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种从中国海南省三亚市红沙河沿岸红树林区红海榄(lihizophora stylosa)根际沉积物中筛选出的，具有较高的纤维素降解活性的红树植物根际纤维素降解真菌新种炭角菌(Xylariaceae sp.) DPZ-SW3，该菌于2011年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No :4871。本发明的红树植物根际纤维素降解真菌新种炭角菌(Xylariaceae sp.) DPZ-SY43是中国海南省三亚市红沙河沿岸红树林区红海榄(Rhizophora stylosa)根际沉积物中筛选出的其菌学特性描述如下菌种描述如图1所示，营养菌丝浅褐色，壁光滑或粗糙，具分隔，分枝，宽 1.0-2. 5 μ m0产生厚垣孢子，深褐色或黑色，形状不规则，成串生于菌丝中间或单生于菌丝短的分枝上。菌株在麦芽汁琼脂培养基上菌落生长较快，25°C黑暗条件下14天菌落直径 60-65mm,初期白色，后期灰褐色，絮状，气生菌丝茂盛；菌落背面暗褐色，无水溶性色素，对多种抗生素有明显抗性。该菌株可以在以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的平板上生长并产生较明显的水解透明圈，表明具有较高的生物质降解活性。按照常规方法从炭角菌(Xylariaceae sp. )DPZ_SY43的纯培养物提取基因组 DNA，运用rDNA内转录间隔区(ITS)序列特定的引物ITS1/ITS4，通过PCR扩增和测序分析得到ITS序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示。运用β微管蛋白(β-tubulin)序列特定的引物Bth/Bt2b，通过PCR扩增和测序分析得到β-tubulin序列，其序列如SEQ ID NO. 2所示。运用钙调节蛋白(calmodulin)序列特定的引物cmd5/cmd6，通过PCR扩增和测序分析得到calmodulin序列，其序列如SEQ ID N0. 3所示。通过GenBank中的BLAST软件将ITS 序列、β -tubulin序列和calmodulin序列与GenBank数据库中的序列进行比对，在数据库中没有找到完全相似的序列，表明这3条基因序列为首次发现的新基因序列。在GenBank数据库中选取了部分与测定序列相似性较高的代表性基因序列，通过ClustalW软件和Mega软件以Neibor-joining方法构建系统进化树(见图2、3、4)， 进行系统发育分析。从系统发育树可以看出炭角菌(Xylariaceae sp. )DPZ-SY43与已知的真菌具有较大的差异性。其rDNA内转录间隔区(ITS)序列达到86;3bp，较其他真菌约大400-500bp，其BLAST序列比对覆盖率约只有50 %，与其亲缘关系较近的Hypoxylon multiforme (AF201717. 2)序列相似性只有88%。其β微管蛋白(β-tubulin)序列与 Annulohypoxylon i lanense (AY951657. 1)具有 97 % 的相似性，与 Annulohypoxylon minutellum(AY951659. 1)具有92%的相似性。另外其钙调节蛋白(calmodulin)序列比对覆盖率只有45-65%，与其亲缘关系最近的Glomerella acutata(FJ917511. 1)序列相似性只有78%。结合其形态学特征，我们确定它是一株真菌新种，将其归入炭角菌科 (Xylariaceae)，命名为炭角菌(Xylariaceae sp. )DPZ-SY43。该菌于 2011 年 05 月 16 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No :4871。对炭角菌(Xylariaceae sp. )DPZ_SY43的纤维素酶活(CMC酶活)研究表明菌株在30°C、ph 7. 0条件下，液体发酵纤维素酶活在10天左右达到最大值60. 1U/L (图5)。同时用含有炭角菌(Xylariaceae sp.) DPZ-SY43的菌液制剂进行木榄(Bruguiera gymnorhiza) 叶片的生物质降解试验。结果表明经过10天的降解处理木榄叶片失重率达到79. 1%，说明炭角菌(Xylariaceae sp. ) DPZ-SY43菌株具有较好的纤维素等生物质降解活性。因此本发明的第二个目的是提供炭角菌(Xylariaceae sp.)DPZ-SY43在产纤维素酶中的应用。本发明的第三个目的是提供炭角菌(Xylariaceae sp. )DPZ_SY43在制备生物有机质降解菌肥中的应用。本发明提供了一种真菌新种炭角菌(Xylariaceae sp. ) DPZ-SW3，该菌具有产纤维素酶活性，可用于生产纤维素酶，因此对纤维素酶的生产和利用具有重要的价值。进一步可以用于制作生物有机质降解菌肥。本发明的炭角菌(Xylariaceae sp. ) DPZ-SW3，该菌于2011年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia 北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No :4871。
图1是Xylariaceae sp. DPZ-SY43在麦芽汁培养基上生长情况(A)、光学显微镜照片 、(和〕)；图2是Xylariaceae sp. DPZ-SY43在rDNA内转录间隔区(ITS)无根系统发育树中位置图；图3是Xylariaceae sp. DPZ-SY43在β微管蛋白(β -tubulin)无根系统发育树中位置图；图4是Xylariaceae sp. DPZ-SY43在钙调节蛋白(calmodulin)无根系统发育树中位置图；图5是Xylariaceae sp. DPZ-SY43的液体发酵纤维素酶活(CMC酶活)图。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1 一、材料与方法1、材料11 土样采集样品采自海南省三亚市红沙河沿岸红树林区红海榄(Rhizophora stylosa)根际沉积物，样品采集后装入灭菌的封口聚乙烯袋中，带回实验室4°C低温保存。1. 2培养基1. 2. 1 初筛培养基(g/L)每升初筛培养基的配制方法如下马铃薯汁(马铃薯去皮，挖芽眼，洗净，切片。称200g放入IOOOml自来水中，用文火煮沸30min，双层纱布过滤，滤液加水补至 1000ml) 800ml，蔗糖，20. Og ；NaCl, 1. 5g ；琼脂，15g，土壤浸提液，200ml ；121°C 灭菌后等培养基冷却至60°C加入过滤除菌的100μ g/ml的氨苄青霉素和100μ g/ml的硫酸链霉素各Iml。1.2.2 复筛培养基(g/L)每升复筛培养基的配制方法如下=CMC-Na 10. Og ；蛋白胨0. 5g ；酵母提取物0. 5g ； 蔗糖 0. 5g ；KNO3L Og ；K2HPO4O. 5g ；MgSO4. 7H20 0. 5g ；NaCl 1. 5g ；琼脂 15g，水 IOOOmL0 121 °C
灭菌备用。1.2.3 保藏培养基(g/L)每升保藏培养基的配制方法如下马铃薯汁(马铃薯去皮，挖芽眼，洗净，切片。称200g放入IOOOml自来水中，用文火煮沸30min，双层纱布过滤，滤液加水补至 1000ml) 1000ml，蔗糖，20. Og ；NaCI, 1. 5g ；琼脂，15g。121°C灭菌备用。1. 2. 4 发酵培养基(g/L)每升发酵培养基的配制方法如下CMC_Na 5. Og ；蛋白胨1. Og ；酵母提取物1. Og ； iiH 1. Og ；KNO3L Og ；K2HPO4O. 5g ；MgSO4. 7H20 0. 5g ；NaCl 1. 5g ；水 1000mL。121°C 灭菌备用。1. 2. 5红树叶片生物质培养基(g/L)每升红树叶片生物质培养基的配制方法如下蛋白胨0.5g，酵母粉l.Og，蔗糖 0. 5g，可溶性淀粉 0. 5g，红树叶片 10. 0g, NaCl 2. 0g, CaCO3L 0g, MgSO4L Og,水 IOOOmL0 121°C灭菌备用。2、方法2. 1菌株的分离筛选从样地选取三株红海榄(Rhizophora stylosa)，采集它们根际土壤样品50g，将三份样品混勻后取约5g置于含50ml灭菌蒸馏水的三角瓶中37°C、150r/min震荡摇勻15min， 静置30sec后取Iml的菌液梯度稀释至10_3、10_4、10_5，接种量为0. 05mL，涂布于初筛培养基上，每一处理设8个重复。37°C培养3-5天，挑取形态典型的单一菌落进行点接纯化2-3 次得到纯培养物。将得到纯培养物接种到复筛培养基上30°C倒置培养3天，在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为lmg/mL的刚果红溶液10 15min后，倒去刚果红溶液，再加入浓度为lmol/L的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围将会出现透明圈。根据初步脱色效果辨别具有产纤维素酶的菌株，测量透明圈直径和菌落直径， 筛选效果较好的菌株进行下一步研究，由此而获得一株菌株纯培养物，命名为DPZ-SY43，保存于保藏培养基中。2. 2菌株形态学特征菌株的形态学特征及初步的鉴定依据《真菌鉴定手册》。上述步骤筛选到的DPZ-SY43菌株，其菌种形态学描述如下如图1所示，营养菌丝浅褐色，壁光滑或粗糙，具分隔，分枝，宽1.0_2.5μπι。产生厚垣孢子，深褐色或黑色，形状不规则，成串生于菌丝中间或单生于菌丝短的分枝上。菌株在麦芽汁琼脂培养基上菌落生长较快，25°C黑暗条件下14天菌落直径60-65mm，初期白色， 后期灰褐色，絮状，气生菌丝茂盛；菌落背面暗褐色，无水溶性色素，对多种抗生素有明显抗性。该菌株可以在以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的平板上生长并产生较明显的水解透明圈，表明具有较高的生物质降解活性。2. 3菌株基因组DNA的提取及分子生物学鉴定
对获得的纯培养物菌株DPZ-SY43使用上海生工公司基因组抽提试剂盒提取DNA， 然后用于rRNA基因的扩增。真菌ITS区部分序列的扩增采用通用引物ITS1/ITS4(T. J.White，T.Bruns，et al 1990)ITS-I 5' —TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3‘，ITS-4 5' —TCCTCCGCTTAT TGATATGC—3'。β-微管蛋白(β-tubulin)序列的扩增采用通用引物Bt2a/ Bt2b (Glass&Donaldson, 1995)Bt2a 5' —GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC—3‘Bt2b 5' —ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC—3'。 钙调节蛋白(calmodul in)序列的扩增采用通用引物cmd5/cmd6 (Seung-Beom Hong, Hye-Sun Cho, et al 2006)cmd5 5' -CCGAGTACAAGGAGGCCTTC-3‘，cmd6 5' -CCGATAGAGGTCATAACGTGG-3‘。PCR反应体系如下premix Taq 25 μ 1，上、下游引物(ImM)各0. 5 μ 1，模板 DNA2. 0μ 1,2 % DMSO 1. 5 μ 1，无菌水 21 μ 1。扩增程序如下95 °C 5min ;94 °C 45sec， 55°C 45sec，72°C 2min，30 个循环；72°C IOmin0取2yL PCR产物，琼脂糖电泳进行产物检测。扩增产物经纯化后，送交测序公司测序。运用rDNA内转录间隔区(ITS)序列特定的引物ITS1/ITS4，通过PCR扩增和测序分析得到ITS序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示。运用β微管蛋白(β-tubulin)序列特定的引物Bth/Bt2b，通过PCR扩增和测序分析得到β -tubulin序列，其序列如SEQ ID N0. 2所示。运用钙调节蛋白(calmodulin)序列特定的引物cmd5/cmd6，通过PCR扩增和测序分析得到calmodulin序列，其序列如SEQ ID N0. 3所示。通过GenBank中的BLAST软件将ITS序列、β -tubulin序列和calmodulin序列与GenBank数据库中的序列进行比对，在数据库中没有找到完全相似的序列，表明这3条基因序列为首次发现的新基因序列。在GenBank数据库中选取了部分与测定序列相似性较高的代表性基因序列，通过ClustalW软件和Mega软件以Neibor-joining方法构建系统进化树(见图2、3、4)， 进行系统发育分析。从系统发育树可以看出炭角菌(Xylariaceae sp.)DPZ-SY43与已知的真菌具有较大的差异性。其rDNA内转录间隔区(ITS)序列达到86;3bp，较其他真菌约大400-500bp，其BLAST序列比对覆盖率约只有50 %，与其亲缘关系较近的Hypoxylon multiforme (AF201717. 2)序列相似性只有88%。其β微管蛋白(β-tubulin)序列与 Annulohypoxylon i lanense (AY951657. 1)具有 97 % 的相似性，与 Annulohypoxylon minutellum(AY951659. 1)具有92%的相似性。另外其钙调节蛋白(calmodulin)序列比对覆盖率只有45-65%，与其亲缘关系最近的Glomerella acutata(FJ917511. 1)序列相似性只有78%。结合其形态学特征，我们确定他是一株真菌新种，将其归入炭角菌科 (Xylariaceae)，命名为炭角菌(Xylariaceae sp. )DPZ-SY43。该菌于 2011 年 05 月 16 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No :4871。2. 4纤维素酶活(CMC酶活)的测定
将炭角菌(Xylariaceae sp. )DPZ_SY43接种于发酵培养基中，30°C、ph 7. 0条件下，每天取少量的发酵液测定发酵液的纤维素酶活性。发酵液经6000r/min离心lOmin，上清液作为粗酶液。于25ml的具塞刻度玻璃试管中加入0.5mL适当稀释的酶液，50°C恒温水浴预热anin后，加入2.0!1^用？!1 4. 8醋酸缓冲液配制的1 %羧甲基纤维素钠溶液，50°C恒温水浴酶解30min，然后加入2. 5mL的DNS于沸水浴中5min，流水冷却后定容至25ml混勻， 在520nm下测定其吸光值，对照标准曲线后测算酶活力。发酵液的酶活如图5所示，由图5 可知，发酵液具有纤维素酶活性，随着发酵时间的延长，其纤维素酶活性逐渐升高，10天后发酵液的纤维素酶活达到60. 1U/L。由此表明本发明的炭角菌(Xylariaceae sp. )DPZ_SY43 具有产纤维素酶活性。酶活力按照国际单位规定定义为每分钟催化纤维素水解生成1 μ mol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位U。2. 5菌株制剂滤纸降解试验将炭角菌(Xylariaceae sp. )DPZ_SY43接种到固体PDA平板上，等菌落长到一定大小后用6cm打孔器取三块菌苔分别接种于三个250ml的红树叶片生物质培养基中静置培养10天，10天后，培养基中的红树叶片失重率为79. 1%。
权利要求
1.一种炭角菌(Xylariaceae sp.)DPZ-SY43，其保藏编号为CGMCC No :4871。
2.权利要求1所述的炭角菌(Xylariaceaesp. )DPZ_SY43在产纤维素酶中的应用。
3.权利要求1所述的炭角菌(Xylariaceaesp.)DPZ-SY43在制备生物有机质降解菌肥中的应用。
全文摘要
本发明公开红树植物根际纤维素降解真菌新种Xylariaceae sp.DPZ-SY43及其应用。炭角菌(Xylariaceae sp.)DPZ-SY43，该菌于2011年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No4871。该菌具有产纤维素酶活性，可用于生产纤维素酶，因此对纤维素酶的生产和利用具有重要的价值。进一步可以用于制作生物有机质降解菌肥。
文档编号C05F11/08GK102373159SQ20111030211
公开日2012年3月14日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者凌娟, 张偲, 张燕英, 潘虎, 董俊德, 陈蕾, 龙丽娟 申请人:中国科学院南海海洋研究所