专利名称：壳聚糖在防治植物细菌性果斑病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物保护的生物防治技术领域，尤其涉及壳聚糖在防治植物细菌性果斑病中的应用。
背景技术：
瓜类一直是非常重要的蔬菜品种，特别是西瓜，汁多味甜，清凉可口，已经成为居民日常生活中不可缺少的夏季食用商品。农民也因种植西瓜获得了较好的经济效益。但是近年来西瓜细菌性果斑病侵染西瓜后，在果实表面产生水溃状半点，扩展蔓延后深入果肉， 导致西瓜果实腐烂，失去食用价值，给瓜农造成了巨大的经济损失。细菌性果斑病最早在美国佛罗里达州发现，Crall等对其症状进行了描述，但未做病原菌鉴定(Crall et al. 1969)。1988年Wall和Santos在关岛报道了西瓜细菌性果斑病的发生，并首次将病原菌鉴定为类产碱假单胞菌西瓜亚种Pseudomonaspseudoalcaligenes subsp. Citrulli (Wall et al. 1989)。此后在韩国、土耳其、美国东方及各州相继报道了该病的发生。该病传播快、危害广、损失重，引起了植病学家的重视。1992年Willems等人根据西瓜果斑病病原菌的rRNA_DNAHE DNA-DNA分子杂交研究结果，将其更名为燕麦食酸菌西瓜亚种 Acidovorax avenae subsp. Citrulli (Willems et al. 1992)。我国从1987年开始就不断有人发现和报道该病在国内的发生和危害情况(李明远.1987 ;张老章.1992 ;平文祥等.1996 ;张荣意等.1998)。由于该病在美国发生普遍、严重，加上近几年美国种子公司在我国北方有西瓜种子繁育业务，使该病传入我国风险性加大，因此我国已将其定位为检疫对象，严格进行种子检疫，以避免该病继续传入我国。关于病害防治，主要采取农业管理和化学防治=Hopkins等认为种子发酵处理能有效降低种子传病率(Hopkins et al. 1996), Nomurahe和Shirakawa报道54_55°C温汤浸种能减少病害的发生(Nomura et al. 2001)，但不能根除，抗生素和铜制剂是较为有效的化学药剂(赵廷昌等.2001)。目前还没有西瓜果斑病关于生物防治的研究。壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化处理后的产物，通常将脱乙酰度大于55%的甲壳素称作壳聚糖，其学名为聚氨基葡萄糖，化学名(I，4) -2-氨基-2-脱氧-β -D-葡萄糖，广泛存在于虾、蟹等动物外壳和藻类、真菌的细胞壁中。壳聚糖是一种抗菌谱较广的天然物质，对细菌、酵母菌和真菌等均有不同程度的抑制作用(Li et al. 2008, 2010a, b,2011a, b ；Fang et al. 2010 ；Lou et al. 2011 ； Al gamet al.2011)。壳聚糖具有良好的生物相溶性，可生物降解性以及无毒副作用，其分子内含有-OH和-NH2-活性基团，易与多种有机物发生反应，目前广泛应用在工业、农业、医药、化工、环境保护和水处理等领域。
发明内容
本发明提供了壳聚糖在防治植物细菌性果斑病中的应用，工艺简单，安全性好，防治效果好，解决了现有药剂种类少、防效差等问题。
壳聚糖在防治植物细菌性果斑病中的应用。优选地，所述壳聚糖的脱乙酰度在85%以上，易获得，成本较低。优选地，所述的植物为瓜类植物；更优选地，所述的植物为西瓜、甜瓜、香瓜或哈密瓜；最优选地，所述的植物为西瓜。所述的应用可以通过如下步骤将植物种子置于壳聚糖溶液中浸泡3_5h或用壳聚糖溶液对植株三叶期的叶片进行喷雾处理。 植株苗太小加上外界各环境因素影响，其抵抗力较弱，发病率难控制；苗太大时植株抗病性增强，壳聚糖不能发挥最佳效果。在所述的三叶期对叶片进行处理效果最好。所述的壳聚糖溶液以壳聚糖为主要成份，可以添加常规的药用赋形剂，如水、乙酸等；可以制成水剂、粉剂等剂型。优选地，所述的壳聚糖溶液为含有壳聚糖的乙酸水溶液，乙酸水溶液中乙酸的体积百分比浓度为O. 01-0. 08%，壳聚糖在乙酸水溶液中的浓度为O. 05-0. 40g/L。一定范围内，随着壳聚糖浓度的增加，对细菌性果斑菌的抑制作用增强。为了获得更好的生防效果，更优选地，所述的乙酸水溶液中乙酸的体积百分比浓度为O. 04% -O. 08%，壳聚糖在乙酸水溶液中的浓度为O. 20-0. 40g/L ;最优选地，所述的乙酸水溶液中乙酸的体积百分比浓度为O. 08%，壳聚糖在乙酸水溶液中的浓度为O. 40g/L,以该条件的壳聚糖溶液对植物进行种子处理或叶面喷雾，能有效降低细菌性果斑病的病害发生率。所述的壳聚糖溶液可以通过如下方法制备将壳聚糖粉末溶于体积百分比浓度为
I%的乙酸水溶液中，配制成壳聚糖浓度为5mg/ml的溶液，调节pH至5. 5-6. 5，混匀使壳聚糖溶解；加水稀释至所需浓度，制得所述的壳聚糖溶液。使用时，壳聚糖溶液的用量或壳聚糖的浓度可以根据需要进行调整。本发明还提供了壳聚糖在促进植物种苗生长中的应用。优选地，所述壳聚糖的脱乙酰度在85%以上，易获得，成本较低。优选地，所述的植物为瓜类植物；更优选地，所述的植物为西瓜、甜瓜、香瓜或哈密瓜；最优选地，所述的植物为西瓜。所述的应用可以通过如下步骤将植物种子置于壳聚糖溶液中浸泡3_5h或用壳聚糖溶液对植株三叶期的叶片进行喷雾处理。优选地，将植物种子置于壳聚糖溶液中浸泡3_5h。以该方法进行处理，植株种苗的鲜重和干重增加最显著。优选地，所述的植物为西瓜；所述的壳聚糖溶液为含有壳聚糖的乙酸水溶液，乙酸水溶液中乙酸的体积百分比浓度为O. 08%，壳聚糖在乙酸水溶液中的浓度为O. 40g/L。该壳聚糖溶液的制备方法可以参照上述防治植物细菌性果斑病壳聚糖溶液的制备。本发明以脱乙酰度在85%以上的壳聚糖为主要原料，制备获得含一定浓度壳聚糖的溶液。试验证明，浓度为O. 05-0. 40g/L的壳聚糖溶液能有效抑制细菌性果斑病菌的活性，且一定范围内溶液浓度越大抑制作用越强；采用浓度为O. 40g/L的壳聚糖溶液对植物进行生防处理，能有效防治植物细菌性果斑病，尤其适用于西瓜等瓜类植物；采用浓度为O. 40g/L的壳聚糖溶液对西瓜种子进行处理，能有效促进西瓜种苗的生长。本发明原料易得，工艺简单，操作方便，低毒低害，对瓜类植物细菌性果斑病防治效果好，同时在一定程度上还能促进植物种苗生长，适用于实际生产，易于推广应用。
图I为本发明实施例3中壳聚糖浓度对西瓜果斑病菌PFB-Ol生长的影响；图2为本发明实施例4中接种时间对西瓜果斑病菌PFB-Ol生长的影响；图3为本发明实施例6中透射电镜结果图；其中，a为未经壳聚糖处理的西瓜果斑病菌PFB-Ol培养4h后的透射电镜照 片，b为未经壳聚糖处理的西瓜果斑病菌PFB-Ol培养12h后的透射电镜照片，c为经壳聚糖处理的西瓜果斑病菌PFB-Ol培养4h后的透射电镜照片，d为经壳聚糖处理的西瓜果斑病菌PFB-Ol培养12h后的透射电镜照片。
具体实施例方式实施例I制备壳聚糖溶液取脱乙酰度为85%的壳聚糖粉末溶解于体积百分比为I %的乙酸水溶液中，配制成壳聚糖浓度为5mg/ml的溶液；用NaOH调节pH至6. 0，在室温下以160rpm摇24h ;用高压灭菌锅121°C灭菌20min，待用。实施例2制备西瓜果斑病菌PFB-Ol种子液西瓜果斑病菌PFB-Ol分离自浙江省发病的西瓜样本，并保存在浙江大学生物技术所菌物保藏中心。将西瓜果斑病菌PFB-Ol在NA琼脂平板上划线，置于28°C下培养48h ；挑取单菌落接种至LB液体培养基中，于28°C，160r/min的摇床中振荡培养24h，制成种子液，使种子液中菌体浓度为109CFU/ml。实施例3壳聚糖浓度对西瓜果斑病菌PFB-Ol生长的影响将实施例I的5mg/ml壳聚糖溶液稀释成浓度为O. 05，O. 10，O. 20，O. 40mg/ml的壳聚糖溶液；接种实施例2中的西瓜果斑病菌PFB-Ol种子液，使得菌浓度为108CFU/ml。在280C，160rpm下摇床培养6h后平板计数法测定西瓜果斑病菌PFB-Ol的活菌数量。实验以pH为6. O的无菌去离子水作为壳聚糖处理的对照。结果如图I所示，不同浓度的壳聚糖溶液都对西瓜果斑病菌PFB-Ol有显著的抑制作用，且随着壳聚糖浓度的增加抑制作用增强。O. 05mg/ml的壳聚糖溶液处理后,西瓜果斑病菌PFB-Ol的活菌数量减少了 I. 17LogCFU/ml ;而O. 40mg/ml的壳聚糖溶液处理后，西瓜果斑病菌PFB-Ol的活菌数量减少了 6. 48Log CFU/ml。这些结果与相关文献(Li etal. 2008a, b ；2010a, b ；2011)报道的壳聚糖抑菌活性受其浓度影响的结论相一致。实施例4接种时间对西瓜果斑病菌PFB-Ol生长的影响将实施例I的5mg/ml壳聚糖溶液稀释成浓度为O. 40mg/ml的壳聚糖溶液；接种实施例2中的西瓜果斑病菌PFB-Ol种子液，使得菌浓度为108CFU/ml。在28°C，160rpm下摇床分别培养0，2，4，6，12，24h后检测壳聚糖溶液对西瓜果斑病菌PFB-Ol的抑菌活性。实验以PH为6. O的无菌去离子水作为壳聚糖处理的对照。结果如图2所示，0.40mg/ml的壳聚糖溶液处理后，在0_2h内，西瓜果斑病菌PFB-Ol的活菌数量显著下降；在2-24h内，西瓜果斑病菌PFB-Ol的活菌数量基本保持一致，其中接种4h后活菌数量值最低，与最初相比下降了 6. 66Log CFU/ml。而空白对照在接种2h后活菌数量下降了 6. 36Log CFU/ml，在之后24h内保持恒定。研究表明，不考虑时间因素，O. 40mg/ml的壳聚糖溶液对西瓜果斑病菌PFB-Ol有显著的抑菌作用。研究同时表明壳聚糖的抑菌活性受时间因素的影响，这与相关文献(Li et al. 2008 ；2010a, b ；2011)报道的时间是影响壳聚糖发挥其抑菌效果一个重要的影响因素的结论相一致。实施例5壳聚糖溶液对西瓜果斑病的生防效果试验将实施例I的5mg/ml壳聚糖溶液稀释成浓度为O. 40mg/ml的壳聚糖溶液，分别用叶面喷雾或种子处理方法(Algam et al. 2010)评价壳聚糖对西瓜果斑病的生防效果。叶面喷雾法将刚萌发的西瓜种子播种在以无菌营养土或珍珠岩为基质的盆中，每个盆中播种4棵，每个处理4盆。三叶期先用浓度为O. 40mg/ml的壳聚糖溶液喷雾叶片，晾干后再接种浓度为108CFU/ml的西瓜果斑病菌PFB-Ol菌悬液(Li et al. 2010)，对照实 验用蒸馏水喷雾叶片。试验植株随机放在12h光照12h黑暗、相对湿度70% -80%、28±2°C的温室中；接种10天内根据Wang et al. (2011)的方法统计西瓜果斑病的病害发生率。 种子处理法将刚萌发的西瓜种子浸种在浓度为O. 40mg/ml的壳聚糖溶液中4h，晾干后播种在以无菌营养土或珍珠岩为基质的盆中，每个盆中播种4棵，每个处理4盆。三叶期接种浓度为108CFU/ml的西瓜果斑病菌PFB-Ol菌悬液(Li et al. 2010)，对照实验用蒸馏水浸种。试验植株随机放在12h光照12h黑暗、相对湿度70% -80%、28±2°C的温室中；50天以后根据Wang et al. (2011)的方法统计西瓜果斑病的病害发生率。结果显示，以无菌营养土为基质，只接种西瓜果斑病菌PFB-Ol的西瓜果斑病病害发生率达97%，而0.40mg/ml壳聚糖溶液处理以后病害发生率显著下降。其中用壳聚糖进行叶面喷雾后，西瓜果斑病病害发生率下降37. 1% ;而用壳聚糖进行种子处理后，西瓜果斑病的病害发生率下降33. 0%。与病原对照相比，用壳聚糖进行叶面喷雾和种子处理对西瓜种苗的生长都没有明显的促进作用；但用壳聚糖对西瓜种子处理，种苗的鲜重和干重与病原对照有了显著的增加(见表I)。以珍珠岩为基质，西瓜种苗的死亡率很高，因此以死亡率代替病害发生率来评价壳聚糖对西瓜果斑病菌PFB-Ol的防治效果。病原对照的西瓜种苗死亡率达73. 7%，而用壳聚糖对西瓜种苗进行叶面喷雾处理后，西瓜种苗的死亡率下降到63. 8%。这表明壳聚糖能降低西瓜果斑病种苗死亡率，但以珍珠岩为基质壳聚糖对西瓜果斑病菌PFB-Ol的防治效果差于以无菌营养土壳聚糖的防治效果。表I壳聚糖对西瓜果斑病的防治效果和对西瓜种苗促生作用的影响
权利要求
1.壳聚糖在防治植物细菌性果斑病中的应用。
2.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，所述的植物为瓜类植物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的植物为西瓜、甜瓜、香瓜或哈密瓜。
4.根据权利要求I所述的应用，其特征在于，包括将植物种子置于壳聚糖溶液中浸泡.3-5h或用壳聚糖溶液对植株三叶期的叶片进行喷雾处理；其中，所述的壳聚糖溶液为含有壳聚糖的乙酸水溶液，乙酸水溶液中乙酸的体积百分比浓度为O. 01-0. 08%，壳聚糖在乙酸水溶液中的浓度为O. 05-0. 40g/L。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的乙酸水溶液中乙酸的体积百分比浓度为O. 04% -O. 08%，壳聚糖在乙酸水溶液中的浓度为O. 20-0. 40g/L。
6.壳聚糖在促进植物种苗生长中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括将植物种子置于壳聚糖溶液中浸泡.3-5h或用壳聚糖溶液对植株三叶期的叶片进行喷雾处理；其中，所述的植物为西瓜；所述的壳聚糖溶液为含有壳聚糖的乙酸水溶液，乙酸水溶液中乙酸的体积百分比浓度为O. 08%，壳聚糖在乙酸水溶液中的浓度为O. 40g/L。
8.根据权利要求1-7任一所述的应用，其特征在于所述壳聚糖的脱乙酰度在85%以上。
全文摘要
本发明公开了壳聚糖在防治植物细菌性果斑病中的应用，其中，所述壳聚糖的脱乙酰度在85％以上；所述的植物为瓜类植物；所述的应用包括将植物种子置于壳聚糖溶液中浸泡3-5h或用壳聚糖溶液对植株三叶期的叶片进行喷雾处理。本发明以壳聚糖为主要原料，制备获得的壳聚糖溶液能有效抑制细菌性果斑病菌的活性，防治植物细菌性果斑病；一定浓度的壳聚糖溶液还能有效促进西瓜种苗的生长。本发明原料易得，工艺简单，操作方便，低毒低害，对瓜类植物细菌性果斑病防治效果好，同时在一定程度上还能促进植物种苗生长，适用于实际生产，易于推广应用。
文档编号A01P21/00GK102613186SQ201210045419
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者单长林, 周青, 李斌, 石雨, 谢关林 申请人:浙江大学