专利名称：一株弗氏链霉菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株弗氏链霉菌Streptomyces fradiae及其应用，主要应用与植物病害的生物防治方面，该弗氏链霉菌可以用于拮抗魔芋软腐病菌Erwiniacarotovoravar. carotovora、水稻白叶枯病菌 Xaothomonas campestris pv. oryzae 和水稻稻痕病菌Magnaporthe oryzae。
背景技术：
链霉菌(Sti^ptomyces)在分类学上属于原核生物界、放线菌目、链霉菌科，是一类具有分枝丝状体的好氧革兰氏阳性细菌，是土壤中主要的微生物类群之一。链霉菌基因组约为大肠杆菌基因组的两倍，平均大小为8000kb。同其它生物相比，其基因组最大特征之一就是其DNA具有极高的G+Cmol %，可高达69-78 %，是迄今为止已知的G+Cmol %含量最高的生物类群之一。链霉菌可以产生多种次生代谢物质，包括水解酶及抗生物质，不仅在人体医药、饲料添加剂等领域有广泛的应用，而且在植物保护方面发挥了巨大作用。一般而言，农用抗生素具有较低毒性及低残留性质，可以抑制病原微生物的生长和繁殖，或者能改变病原菌的形态而达到防治病害的效果。农用抗生素可作用于病原菌的细胞壁、细胞膜、蛋白质合成系统、能量代谢系统及细胞分裂而抑制病原菌的生长，同时还可以提高植物的抗病能力。链霉菌产生的农用抗生素种类多，而且大多已在农业生产中广泛应用，可防治真菌、细菌、线虫病害及一些重要的害虫，有的还具有除草活性。链霉菌作为农用抗生素防治病害有广泛的例子，如我国的井R霉素、农抗120、春雷霉素、中生霉素等，对防治植物细菌性病害及真菌性病害有很好的防治效果。国外报道的抗菌素有杀稻瘟素等。链霉菌还产生许多抗生素用于农业害虫防治，仅我国就研制了杀蚜素、韶关霉素、浏阳霉素、南昌霉素等。最著名的为阿维菌素A (vermectins,简称Am)，是一种杀消化道线虫和外寄生虫的高效广谱驱虫剂。它对线虫、蜂蜗类(Aearina)、甲虫类(Coleoptera)及鳞翅目(Lepidoptera)、直翅目(Orthoptera)、双翅目D(Ptiear)和膜翅目H(ymenoPter) a等多种害虫也有杀灭作用。另外，由Sukyo公司研究小组在Streptomyes hygroscopicus的一个菌株中发现的杀蜻菌素(Mlibemycni)也具有广谱杀线虫、昆虫活性。从金色链霉菌(Streptomyes aureus)的菌丝中获得的与杀蜗化合物类似的物质单活菌素(Monaetin)、二活菌素(Dinatin)和三活菌素(Trinactin)也都具有杀螨活性。具有除草活性的双丙氨麟已商品化用于农田杂草的防除。这些农用抗生素的开发和应用带来了巨大的社会效益和经济效益。链霉菌拮抗植物病原菌的原理可分为抗生、竞争和超寄生作用。链霉菌是植物生物防治微生物中的主要成员之一。本发明从魔芋地土壤中分离得到一株拮抗链霉菌，它对魔芋软腐病原菌、水稻白叶枯病原菌和水稻稻瘟病原菌有很好的抑制作用，为开发新的植物生防制剂提供技术支撑
发明内容
本发明的目的之一是提供一种弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae),该弗氏链霉菌对魔芋软腐病原菌、水稻白 叶枯病原菌和水稻稻瘟病原菌有很好的抑制作用，为开发新的生物农药品种、植物生物防治菌剂提供了新选择。所述弗氏链霉菌SJK18,拉丁名为Streptomyces fradiae,分离自三峡大学生物技术研究中心魔芋种植实验地土壤，于2011年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2011457，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。本发明还有一个目的是提供一种分离链霉菌SJK18的方法，该方法的分离过程为将土样自然风干过筛，取IOg置于含90ml无菌水的锥形瓶中(带数粒玻璃珠)，充分混匀。采用梯度稀释法将土样悬液依次稀释至10-2—10-6。分别取10-4、10-5和10-6的土样悬液O. Iml涂布于高氏I号培养基(含O. 15%重铬酸钾)培养皿中，置于30°C培养5d后，计数、标记，并挑取形态不同的菌落纯化后备用。用平板对峙法筛选拮抗放线菌。抑菌试验表明，链霉菌SJK18对部分植物病原真菌具有抑制效果，如魔芋软腐病菌 Erwinia carotovora var. carotovora、/K稻白叶枯病菌 Xaothomonas campestrispv. oryzae 和水稻稻痕病菌 Magnaporthe oryzae。本领域技术人员很容易想到将本发明菌株的发酵液或菌悬液作为农药的有效成分用于植物病害的生物防治，或者将本发明菌株制备成菌剂用于植物病害的生物防治。因而，本发明还包括含有所述菌株或者其发酵液的生物农药，以及含有所述菌株的微生物菌剂。本发明还有一个目的是提供一种用于生物防治植物病害的菌剂，其活性成分为链霉菌SJK18或其发酵液。其中所述植物病害为魔芋软腐病、水稻白叶枯病或水稻稻瘟病。本发明还有一个目的是提供一种生物农药，该生物农药含有链霉菌SJK18或其发酵菌液，可拮抗魔芋软腐病原菌、水稻白叶枯病原菌或水稻稻瘟病菌。本发明还有一个目的是将本发明的链霉菌SJK18、含有该链霉菌的菌剂或生物农药应用于植物病害的生物防治。其中所述的植物病害是魔芋软腐病、水稻白叶枯病或水稻稻痕病。本发明还有一个目的是将本发明的链霉菌SJK18或含有该链霉菌的菌剂应用于制备生物农药。其中所述的生物农药抑制魔芋软腐病原菌、水稻白叶枯病原菌或水稻稻瘟病原菌。本发明方法如下I、弗氏链霉菌SJK18的鉴定(I)形态及培养特征观察用扦片法观察SJK18的形态。将SJK18接种于高氏一号、察氏、燕麦粉琼脂、葡萄糖天冬素、酵母膏麦芽、淀粉铵琼脂、克氏一号和甘油天冬素培养基，观察其气生菌丝与基内菌丝的颜色、可溶性色素的有无及颜色。培养基成分高氏一号培养基可溶性淀粉20. 0g, NaClO. 5g，KNO3L 0g, MgSO4O. 5g，K2HPO4O. 5g，FeSO4O. Olg,水 1000ml, pH7. 0。察氏培养基:蔗糖30. 0g，KC10. 5g, MgSO4O. 5g，K2HPO4L 0g，FeSO4O. 01g，NaN032. Og,水 1000ml, pH7. 0。
克氏一号培养基=NaClO.2g，KNO3L 0g, MgSO4O. Olg, K2HPO4L Og,葡萄糖 20. Og,MgCO3O. 3g, CaCO3O. 5g，水 1000ml, ρΗ7· O。葡萄糖天冬素培养基天冬素O. 5g,葡萄糖10. 0g, K2HPO4O. 5g,水1000ml, pH7. O。葡萄糖麦芽汁培养基葡萄糖4. 0g，麦芽10. 0g，酵母膏4. OgjjC 1000ml，pH7. O。燕麦粉培养基燕麦粉20. 0g，痕量盐I. 0ml，水1000ml，pH7. O。甘油天冬素培养基甘油10. 0g，天冬素l.Og，K2HPO4L Og,痕量盐1.0ml，水1000ml, ρΗ7· O。淀粉铵培养基可溶性淀粉10. Og,硫酸铵2. 0g, CaC033. 0g, NaCll. Og,^MgSO4 1.5g, K2HPO4O. 5g，水 1000ml, ρΗ7· O。(2)生理生化特征Α、碳源利用基础培养基成分(NH4)2S042. 64g，Κ2ΗΡ045· 56g，Κ2ΗΡ042· 38g，MgSO4 · 7H20 I. Og,CuSO4 ·5Η20 0. 0064g，FeSO4 · 7H20 0. 001 lg，MnCl2 · 4Η200· 0079g，ZnSO4 · 7H20 0.0015g，琼脂20. Og,蒸馏水1000ml。将D-葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露醇、棉子糖、L-阿拉伯糖、七叶苷、醋酸钠、肌醇、麦芽糖、柠檬酸三钠、甘油、柳醇、果糖、乳糖、木糖醇和D-山梨醇置于紫外灯下灭菌2h后，按I %的量分别加入已熔化的基础培养基中，混匀，待糖溶化后倒入平板上，凝固，接SJK18孢子。30°C培养7天后观察菌落生长情况。B、明胶液化培养基成分:蛋白胨5. 0g，葡萄糖20. Og,明胶200. 0g，蒸馏水1000ml。将SJK18接种于明胶表面，于28°C下培养，经15天后观察明胶液化情况。C、牛奶凝固与胨化将SJK18接种于灭菌的脱脂牛奶中，28°C下培养，于10d，15d，及20d分别观察牛奶凝固与胨化情况。D、淀粉水解培养基成分可溶性淀粉10. 0g, K2HPO4O. 3g，NaCl 0. 5g，MgCO3L 0g, KNO3L Og,琼脂15. OgjjC 1000ml，pH7. 2。将SJK18接种于上述培养基中，28°C下培养10天后，往培养基表面倒入碘液，以菌落周围有无透明圈来判断有无淀粉酶产生。E、纤维素水解培养基=MgSO4· 7H20 0. 5g, K2HPO4O. 5g, NaClO. 5g, KNO3L 0g，蒸馏水 1000ml。上
述培养基分装试管后，每管插一滤纸条，使其一半浸入培养基中，一半露于管内空气中。将SJK18接种于滤纸条上，28°C下培养30天后，观察其是否能在滤纸上生长。F、H2S 的产生培养基蛋白胨10.0g，柠檬酸铁0. 5g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，pH7. 2。将SJK18接种于上述培养基上，培养一周后观察有无黑色硫化铁产生作为H2S产生的依据。(3)总DNA的提取采用改进的CTAB法提取总DNA，以反复冻融破碎细胞，氯仿/异戊醇(24 I)抽提。取约0. 2g菌体于2ml的离心管中，加I. 5ml提取液(I % CTAB, I. 5molNaCl,0. lmolEDTA，0. Imol Tris，0. Imol 磷酸缓冲液，pH8. 0)混匀后置于 _70°C冰箱静置 30min,取出后于65水浴融化，反复冻融三次；加20% SDS 200μ 1,65水浴2h(期间每20min轻轻颠倒混勻)，8000rpm离心15min,收集上清；上清液加O. 5倍体积的聚己二醇6000(50%PEG, I. 5mol NaCl)混勻，沉淀过夜；6000rpm离心30min,弃上清，沉淀加入O. 5mll XTE溶解；用等体积的氯仿异戊醇(24 I)抽提，12000rpm离心20min收集上清，重复一次；用O. I倍体积NaAc (3mol/L)和O. 6倍体积异丙醇(-20°C预冷)室温沉淀4h，12000rpm离心20min弃上清；沉淀用70%乙醇洗漆，12000rpm离心20min弃上清，晾干；沉淀加50 μ I超纯水溶解。(4) 16S rDNA 序列分析采用通用引物扩增16S rDAN序列。上游引物F27 :5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '，下游引物 Rl522 :5 ' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 '。反应体系如下
IOxPCRBuflFer2.5μ1
(Mg2+) (20mM)2.0μ1
dNIPmixture (IOmM)0.5μ1
Primer-F27 (20μΜ)0.5μ1Primer-Rl522 (20μΜ)0.5μ1
DNA 模板Ι.ΟμΙ
Taq Polymerse(3U^l)0.5μ1
ddH2017.5μ1
Total Volume25 μ 反应条件94°C预变性5min，94°C变性 lmin，55°C退火 lmin，72°C延伸 90s，30 个循环，最后72°C延伸8min。PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳检测，挑取1500bp左右的条带进行凝胶回收。将回收的DNA连接载体上并转化到感受态细胞；筛选阳性克隆子送上海生工测序。将测得的序列提交的美国GenBank，并获得登录号。将此序列在GenBank中进行序列比对，并选取同源性较高的菌株的序列用MEGA4. I软件构建16S rDNA系统发育树。(5) 16S-23S转录间区序列ITS分析上游引物从SJK18菌株的16S rDNA末端设计。下游引物设计从GenBank中下载弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae) 23S rDNA的序列，用CLUSTALXl. 8软件进行多序列比对，寻找高同源性的保守序列，从中设计引物。引物通过01igo6.5软件进行分析评价。反应条件根据设计的引物进行确定。其它步骤同16S rDNA—样。2、弗氏链霉菌SJK18拮抗魔芋软腐病原菌采用打孔法考察弗氏链霉菌SJK18发酵液抑制魔芋软腐病病原菌。3、弗氏链霉菌SJK18拮抗水稻白叶枯病原采用打孔法考察弗氏链霉菌SJK18发酵液抑制水稻白叶枯病原菌。
4、弗氏链霉菌SJK18拮抗水稻稻瘟病原菌
采用平板对峙培养法考察弗氏链霉菌SJK18抑制水稻稻瘟病原菌。
图I为本发明的弗氏链霉菌SJK18的孢子链。图2为本发明的弗氏链霉菌SJK18的基内菌丝。图3为本发明的弗氏链霉菌SJK18菌株的16S rDAN系统发育树，括号内为GenBank登录号。图4为本发明的弗氏链霉菌SJK18菌株的ITS系统发育树，括号内为GenBank登录号。图5为本发明的弗氏链霉菌SJK18发酵抑制魔芋软腐病病原菌效果，四个重复。图6为本发明的弗氏链霉菌SJK18发酵抑制水稻白叶枯病原菌和稻瘟病原菌效果，其中，a SJK18高氏一号发酵液，b SJK18LB发酵液，c SJK18LB发酵液乙醇沉淀物；1 水稻白叶枯病0249，2 :水稻白叶枯病05105，3 :水稻白叶枯病11201，4 :水稻白叶枯病134，5 :水稻稻痕病IK81_3,6 :水稻稻痕病χ，7 :水稻稻痕病1366,8 :水稻稻痕病65Α,9 :水稻稻痕病 1073-2。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述。以下实施例将有助于本领域普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。通过下述实例对本发明的技术特征作详细描述。实施例I、弗氏链霉菌SJK18的鉴定(I)形态及培养特征观察分别用普通光学显微镜100Χ油镜观察孢子丝和基内菌丝。SJK18孢子丝链状，弯曲(图I)，基内菌丝发达，多分枝、无横隔无断裂(图2)。SJK18在高氏一号、燕麦粉琼脂、淀粉铵琼脂培养基中气生菌丝为淡紫色，基内菌丝橙色；在察氏培养基中气生菌丝茶色，基内菌丝无色；在葡萄糖天冬素培养基中无气生菌丝，基内菌丝乳白色；在克氏一号培养基中气生菌丝灰白色，基内菌丝白色；在甘油天冬素培养基中，气生菌丝灰白色，基内菌丝橙色。SJK18在以上培养基中均不产可溶性色素(表I)。表I本发明的链霉菌SJK18培养特征
权利要求
1.弗氏链霉菌SJK18，于2011年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 2011457。
2.一种用于生物防治植物病害的菌剂，其活性成分为权利要求I的弗氏链霉菌SJK18或其发酵液。
3.权利要求2所述的菌剂，其中所述植物病害为魔芋软腐病菌、水稻白叶枯病菌或水稻稻痕病菌。
4.一种生物农药，其含有权利要求I的弗氏链霉菌SJK18或其发酵液。
5.权利要求4所述的生物农药，其中该生物农药可拮抗魔芋软腐病、水稻白叶枯病或水稻稻瘟病的病原菌。
6.权利要求I所述的弗氏链霉菌SJK18、权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的生物农药在植物病害生物防治中的应用。
7.权利要求6所述的应用，其中所述的植物病害是魔芋软腐病、水稻白叶枯病或水稻稻痕病。
8.权利要求I所述的弗氏链霉菌SJK18或权利要求2所述的菌剂在制备生物农药中的应用。
9.权利要求8所述的应用，其中所述的生物农药抑制魔芋软腐病、水稻白叶枯病或水稻稻瘟病的病原菌。
全文摘要
本发明涉及一株弗氏链霉菌SJK18及其在植物病害的生物防治中的应用，所述弗氏链霉菌SJK18于2011年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2011457，该链霉菌及其发酵液对魔芋软腐病、水稻白叶枯病或水稻稻瘟病的病原菌有较好的拮抗作用，效果稳定且持续，不产生公害，为开发新的生物农药品种、植物生物防治菌剂提供了新选择，具有一定的经济和社会效益。
文档编号A01P3/00GK102618455SQ20121004466
公开日2012年8月1日 申请日期2012年2月26日 优先权日2012年2月26日
发明者乐超银, 叶晶龙, 廖甜甜, 望慧星, 潘虹, 王钧, 程海丽, 许克静, 陈云, 雷珍珍 申请人:三峡大学