专利名称：拟南芥糖基转移酶基因ugt76c2在提高植物耐旱性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一个糖基转移酶基因及其应用，尤其涉及一种拟南芥糖基转移酶基因UGT76C2在提高植物耐旱性中的应用，属于基因工程领域。
背景技术：
糖基转移酶是专门负责催化糖基化修饰反应的酶类，它将活性糖基从供体(通常是UDP-glucose)转移到受体分子上。糖基化修饰往往会改变植物分子的生物活性、水溶性、在细胞内和整体植株的转运特性、亚细胞定位以及与受体的相互识别与结合特性，另外还能降低或消除内源和外源物质的毒性(Lim and Bowles, 2004;Bowles et al. , 2006;Wangand Hou, 2009) 0因此，糖基转移酶基因在调节植物细胞代谢平衡、维持植物正常生长发育等方面有重要意义。例如，已有报道糖基转移酶基因参与植物激素平衡调节、植物防御反应、植物次生代谢物合成以及植物信号转导等(Wang and Hou, 2009) 0生物界存在的糖基转移酶按照所催化的底物性质和序列相关性分属94个不同的家族。其中家族I包含的成员数量最多，与植物的关系最密切。在家族I中大多数基因C端具有一个由44个氨基酸组成的保守序列，即PSPG盒(plant secondary productglycosy I transferase box)。随着拟南芥(Arabidopsis thaliana)全基因组测序的完成，通过对PSPG盒的序列分析发现拟南芥中共有119个可能的糖基转移酶，这些糖基转移酶中大部分的功能还不清楚。UGT76C2是拟南芥糖基转移酶家族I中的一个成员，目前它的基因序列已公开于核酸序列数据库中。但是经过检索，拟南芥糖基转移酶基因UGT76C2在增强植物耐旱性中的应用目前未见报道。
发明内容
(I)本发明的目的针对现有技术的不足，本发明的目的是提供了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT76C2在提高植物耐旱性中的应用。(2)实现本发明的具体技术方案本发明所述拟南芥糖基转移酶基因UGT76C2在提高植物耐旱性中的应用。其中所述糖基转移酶基因UGT76C2的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。所述植物优选是十字花科植物，所述十字花科植物优选是拟南芥、芥菜、油菜、白菜或甘蓝。本发明利用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的引物序列，通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆糖基转移酶基因UGT76C2，然后利用该基因构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的耐旱性得到显著提高。 ( 3)本发明实施后可能带来的有益效果实验证实，应用本发明所述拟南芥糖基转移酶基因UGT76C2进行植物转基因操作，可以显著提高转基因植物的耐旱性(见附图I、附图2和附图3)。预示本发明实施后将会创造新型耐旱植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。
图I.干旱处理实验。其中Col-O为拟南芥对照植物，ugt76c2为突变体，UGT76C20E4-2和UGI76C20E19-2为两个过表达株系。拟南芥对照植物、突变体和过表达株系正常培养2周，然后停止浇水12天，突变体几乎全部出现萎蔫，野生型对照只部分出现萎蔫，而两个过表达株系几乎无萎蔫现象。这说明UGI76C2基因过表达之后明显增强了植株的抗旱性。图2.干旱处理后的存活率统计。其中Col-O为拟南芥对照植物，ugt7 6c2为突变体，UGI76C20E4-2和UGI76C20E19-2为两个过表达株系。拟南芥对照植物、突变体和过表达株系正常培养2周，然后停止浇水12天，再恢复浇水3天，统计植株的存活率。结果两个过表达株系的存活率明显高于野生型对照及突变体。突变体ugt76c2的存活率最低。这说明过表达株系的耐旱性最强，UGT76C2基因过表达之后明显增强了植株的抗旱性。图3.离体失水率实验。其中Col-O为拟南芥对照植物，ugt76c2为突变体，UGT76C20E4-2和UGI76C20E19-2为两个过表达株系。实验材料是正常生长2周的拟南芥对照植物、突变体和两个过表达株系。选取生长状态一致的植株，剪取地上部分，放于室温下的台面上，每隔20min测定植株的鲜重，计算每个时间段的离体失水率。结果2个过表达株系的离体失水率最低，说明过表达株系水分散失较慢，保水性优于野生型对照及突变体。说明了 UGI76C2基因在增强抗旱性方面的作用。
具体实施例方式实施例I克隆拟南芥糖基转移酶基因UGI76C2I 拟南芥糖基转移酶基因UGI76C2的克隆通过公开网站http://www. cazy. org获得UGT76C2基因的cDNA序列。根据cDNA序列设计引物，正向引物为 76C2-F: 5，-CGCGGATCCGCCGCCATGGAGGAGAAGAGAAATGG-3 ’，反向引物为 76C2-R:5’ -CGGGAGCTCTTACAACAATAGTATATGATTAGCT-3’。利用 TRIzol 试剂盒提取拟南芥RNA，RT-PCR方法扩增UGI76C2基因的全长cDNA序列。将cDNA克隆的过程是先经过BamHI和Sac I酶切，之后连入相应酶切的pBluescript II SK(+)载体中，构建成测序中间载体，称为PK76C2，然后用载体进行基因全长PCR扩增和BamHI和Sac I酶切验证，最后进行序列测定，验证克隆序列的正确性。2.拟南芥糖基转移酶基因UGI76C2的序列信息与特性分析UGT76C2基因的编码区cDNA为1353bp，编码450个氨基酸的57. 6kDa蛋白，C端具有44个氨基酸的PSPG盒，为植物次生代谢物糖基转移酶所共同具有的保守序列。3.拟南芥糖基转移酶基因UGI76C2的表达分析组织特异性表达对成熟的野生型拟南芥Col-O的各个组织器官包括根、茎、莲座叶、茎生叶、花、角果等进行RT-PCR分析，发现UGI76C2在各个组织器官中都有表达。UGT76C2启动子驱动⑶S表达为了定位UGI76C2基因表达的精细部位，将UGT76C2启动子区域2000bp的片段构建到pBI121 (⑶S表达载体)，取代该载体上的35S启动子。通过农杆菌GV3101转化拟南芥，最后筛选获得pUGI76C2启动子⑶S纯系植株。GUS染色分析发现，在4天之内的幼苗期，UGI76C2在根、下胚轴、子叶中都有较强表达。在随后的生长发育阶段，UGT76C2在花絮柄、花絮、种子、根中有较强表达。实施例2拟南芥糖基转移酶基因UGI76C2的转基因应用I.含有UGI76C2编码区cDNA表达载体的构建pK76C2中间测序载体经过BamHI和Sac I双酶切后，获得带有酶切粘性末端的全长cDNA序列。将此基因片段与用相应酶酶切后的PBI121载体部分相连，得到以CaMV 35S启动子驱动糖基转移酶基因过表达的植物表达载体，称为PBI76C2。2.农杆菌介导植物转化农杆菌GV3101具有侵染植物和转移基因的能力，故将构建的UGI76C2植物表达载 体(pBI76C2)转入农杆菌，然后进行PCR验证和酶切验证。利用浸花法(一种公开的通用方法)，使含有植物表达载体的农杆菌GV3101浸染拟南芥花蕾。待其长出的角果成熟之后，收集Tl代种子并在筛选培养基(MS培养基附加30mg/L卡那霉素)上进行筛选，将能够正常生长的绿色转化苗移栽至营养土中培养，分别收获其T2代种子再进行下一轮的卡那霉素筛选，挑选出绿苗白苗为3 1的培养皿。将此培养皿上的绿苗移栽，单株收获种子(T3代)。对每一单株的种子部分用于卡那霉素平皿筛选，直到选出在筛选培养基上为全绿的株系，即为纯合转基因株系。3.转基因植株分子鉴定对上述转基因植株进行基因表达水平的检测。分别提取转基因植株和野生型植株的RNA，反转录后进行RT-PCR扩增，分析过表达植株和野生型植株的基因表达差异。UGT76C2在过表达植株中的表达量都明显高于野生型植株。利用两个UGI76C2表达量高的株系，即UGI76C20E4-2、UGI76C20E19-2，来进行后续的工作。4.UGI76C2基因的抗旱性功能验证(I)幼苗的干旱处理实验。将在土壤中正常生长2周的拟南芥对照植物(Col-0)、突变体(ugt76c2)、两个过表达株系(UGI76C20E4-2、UGT76C20E19-2)停止浇水12天，结果发现突变体几乎全部出现萎蔫，野生型对照有部分出现萎蔫，而两个过表达株系几乎无萎蔫现象(见附图I)。然后再恢复浇水3天，统计植株的存活率。结果两个过表达株系的存活率明显高于野生型对照及突变体。突变体ugt76c2的存活率最低(见图2)。这些结果表明UGI76C2基因过表达之后能明显增强植株的抗旱性。(2)干旱处理条件下的叶片气孔运动。当植株受到干旱胁迫时，为了降低体内的水分散失，植株会启动自身的防御机制，譬如调节气孔的开度来抵抗胁迫条件，于是实验测试了干旱胁迫下气孔的运动情况。在正常生长条件下，Col-0、ugt76c2、UGI76C20E4-2、UGT76C20E19-2的气孔开度没有表现出任何的差异，当叶片干旱处理0. 5及I小时后，以上四个株系的气孔开张度发生了不同程度的变化，表现为过表达体UGI76C20E4-2、UGT76C20E19-2的开度明显小于野生型Col_0，而突变体ugt76c2气孔开度大于野生型。说明UGI76C2过表达之后可以通过减小气孔开度来减少水分的散失，提高保水能力。(3)离体失水率实验。实验材料是正常生长2周的拟南芥对照植物、突变体和两个过表达株系。选取生长状态一致的植株，剪取地上部分，放于室温下的台面上，每隔20min测定植株的鲜重，计算每个时间段的离体失水率。结果2个过表达株系的离体失水率最低，说明过表达株系水分散失较慢，保水性优于野生型对照及突变体。再次说明了 UGI76C2基 因在增强抗旱性方面的作用(见附图3)。
权利要求
1.拟南芥糖基转移酶基因UGI76C2在提高植物耐旱性中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述糖基转移酶基因UGI76C2的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
3.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述植物是十字花科植物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述十字花科植物是拟南芥、芥菜、油菜、白菜或甘蓝。
全文摘要
本发明公开了一种拟南芥糖基转移酶基因UGT76C2在提高植物耐旱性中的应用，其中所述糖基转移酶基因UGT76C2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其是通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆的。本发明利用基因UGT76C2构建植物过表达载体，进行植物转基因操作，获得转基因植物。检测表明转基因植物的耐旱性得到显著提高，预示本发明实施后将会创造新型耐旱植物，可用于后续的作物品种改良，对我国农业生产具有重大意义。
文档编号A01H5/00GK102796762SQ20121033436
公开日2012年11月28日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者侯丙凯, 王波 申请人:山东大学