人源化m-csf小鼠的制作方法
【专利摘要】本发明提供了包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列的经遗传修饰的小鼠。还提供了已经用人细胞诸如人造血细胞嫁接的包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列的经遗传修饰的小鼠及用于生成此类嫁接小鼠的方法。这些小鼠在许多应用中得到使用，诸如在为人免疫性疾病和病原体感染建模中；在调控（例如在健康或患病状态中）造血细胞发育和/或活性的药剂的体内筛选中；在对造血细胞有毒性的药剂的体内筛选中；在针对毒性制剂对造血细胞的毒性影响提供保护、减轻、或反转毒性制剂对造血细胞的毒性影响的药剂的体内筛选中；在预测个体对疾病疗法的响应的来自个体的人造血细胞的体内筛选中，等等。
【专利说明】人源化M-CSF小鼠
发明领域
[0001]本发明涉及包含编码人M-CSF蛋白的基因的经遗传修饰的小鼠，和包含支持人造血细胞嫁接的别的修饰的小鼠。
[0002]发明背景
[0003] 研究人类疾病的动物模型的开发已经显著推进对几种疾病(包括癌症)的根本机制的了解。至今，已经证明了动物模型，特别是小鼠是用于评估药物和疗法选项的效率和效力的卓越候选物。虽然利用这些替代模型研究人生物学和疾病可以很大程度上证明是正当的(由于对进行人类实验疗法的伦理学和技术约束所致)，但是研究已经突出显示将数据从小鼠推断到人的潜在限制(Mestas J, Hughes CC.(2004) Of mice and notmen:differences between mouse and human immunology.J Immunol.172:2731-2738)。
[0004]为了克服这些问题，对开发人源化小鼠模型具有长期存在的兴趣。几个小组的密集工作已经成功证明在小鼠中研究人生物学和疾病的可行性。由于在接受体中具有功能性且有效的免疫系统会导致消除人起源的移植组织/细胞，使用缺乏适应性免疫系统的细胞诸如T、B和NK细胞的遗传突变体已经显著促成人源化小鼠模型的成功。因而，人源化小鼠模型的最有效候选物包括缺乏基因的NOD-SCID和Balb/c品系，所述基因包括重组活化基因(RAG)、常见的Y链(Y C,又称为“白介素2受体，Y”,或IL2rg)、β2微珠蛋白(Β2Μ)和穿孔蛋白(Perforin) I (Prfl) (Shultz LD 等(2007)Humanized mice intranslational biomedical research, Nat.Rev.1mmunol.7:118-130)。在过去几十年里的几项研究已经证明将几类人组织，包括外周血白细胞、胎儿肝细胞、胎儿骨、胎儿胸腺、胎儿淋巴结、血管化的皮肤、动脉段和移动的或脐带血造血干细胞(HSC)移植到某些人源化小鼠中的可行性(Macchiarini F.等(2005)Humanized mice:are we there yet?J.Exp.Med.202:1307-1311)。认为此办法提供更好的模型系统，因为从这些小鼠中的人细胞获得的数据可以反映人系统的生理学。该领域中的主要调查途径是生成具有人起源的完整造血系统和功能性免疫系统的小鼠。虽然在生成具有人T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和树突细胞(DC)的免疫受损的小鼠中已经做出重大进展，但是该领域中仍有几项挑战，其中之一是人源化小鼠中较差的髓样分化。令人感兴趣地，在人源化小鼠中自造血干细胞(HSC)生成人T细胞、B细胞、NK细胞和树突细胞(DC)方面已经有很多进展。在个别造血区室外，这些小鼠中人HSC的注射导致淋巴样器官诸如胸腺和脾的重建。不过，髓样细胞，特别是粒细胞、巨噬细胞、红细胞和巨核细胞的频率是非常低的，即可能是由于这些小鼠中自人HSC的效率低的骨髓组织生成所致的结果(Shultz等(2007) ;Macchiarini等(2005))。考虑到如下的实情，即髓样起源的细胞(诸如红细胞和巨核细胞)对于血液系统的正常运行是至关重要的，以及粒细胞和巨噬细胞对于适应性免疫系统的形成是重要的，生成具有有效的人骨髓组织生成的人源化小鼠具有极为重要的意义。
[0005]因而，本领域中需要在用人HSC嫁接后能够改善人骨髓组织生成的经遗传修饰的小鼠(Manz MG.Human-hemato-lymphoid-system mice:opportunities and challenges.1mmunity.2007May;26(5):537-41)。[0006]发明概述
[0007]本申请提供了包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列的经遗传修饰的小鼠。还提供了已经用人细胞诸如人造血细胞嫁接的包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列的经遗传修饰的小鼠及用于生成此类嫁接小鼠的方法。这些小鼠可用于许多应用，诸如在为人免疫性疾病和病原体感染建模中；在调控(例如在健康或患病状态下)造血细胞发育和/或活性的药剂的体内筛选中；在对造血细胞有毒性的药剂的体内筛选中；在针对毒性制剂对造血细胞的毒性影响提供保护、减轻、或反转毒性制剂对造血细胞的毒性影响的药剂的体内筛选中；在预测个体对疾病疗法的响应性的来自个体的人造血细胞的体内筛选中，等等。
[0008]在本发明的一些方面，提供了人源化M-CSF小鼠，其中所述人源化M-CSF小鼠包含核酸序列，该核酸序列编码人M-CSF蛋白，并且与小鼠M-CSF结构基因基因座5’的调节序列，例如小鼠M-CSF启动子、5’ UTR等可操作连接。在一些实施方案中，所述小鼠包含两个拷贝的所述核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列位于小鼠M-CSF基因座内的小鼠基因组中。在一些实施方案中，核酸序列与小鼠M-CSF基因座处的内源小鼠M-CSF启动子可操作连接，即，小鼠是M-CSFivm小鼠。在一些实施方案中，小鼠包含两个等位基因，其中核酸序列位于小鼠M-CSF基因座内的小鼠基因组中。在一些实施方案中，这两个等位基因的核酸序列与小鼠M-CSF基因座处的内源小鼠M-CSF启动子可操作连接，即小鼠是M-CSFivh小鼠。在一些实施方案中，人源化M-CSF小鼠包含至少一个小鼠M-CSF等位基因中的无效突变。在一些实施方案中，人源化M-CSF小鼠包含这两个小鼠M-CSF等位基因中的无效突变(nullmutation)。在一些此类实施方案中，所述无效突变是小鼠M-CSF外显子2_9的缺失。
[0009]在一些实施方案中，小鼠在骨髓、脾、血液、肝、脑、肺、睾丸、和肾中表达人M-CSF。在一些实施方案中，表达的人M-CSF量与野生型小鼠中表达的小鼠M-CSF量是基本上相同的。在一些实施方案中，人源化M-CSF小鼠的骨髓间充质基质细胞表达的人M-CSF量与由野生型小鼠骨髓间充质基质细胞表达的小鼠M-CSF量是基本上相同的。在一些实施方案中，人源化M-CSF小鼠在血液和/或组织中展现出生理学浓度的M-CSF。在一些实施方案中，小鼠表达小鼠M-CSF和人M-CSF两者。在其它实施方案中，由小鼠表达的唯一 M-CSF是人M-CSF。
[0010]在一些实施方案中，小鼠分泌足够的人M-CSF以将嫁接的人造血干细胞分化成人单核细胞、人巨噬细胞、和人破骨细胞。在一些实施方案中，小鼠分泌有效量的M-CSF以刺激从源自将人造血干细胞嫁接到小鼠中的人单核细胞形成人巨噬细胞。在一些实施方案中，小鼠分泌有效量的M-CSF以在用人造血干细胞嫁接的小鼠中刺激人造血干细胞形成原单核细胞、原单核细胞形成人幼单核细胞、人幼单核细胞形成人单核细胞、以及人单核细胞形成人巨噬细胞。在一些实施方案中，小鼠中分泌的人M-CSF的有效量是为了实现相应的结果由野生型小鼠分泌的小鼠M-CSF的基本上相同量(例如，为了刺激从小鼠单核细胞形成小鼠巨噬细胞的小鼠M-CSF的有效量)。
[0011]在一些实施方案中，经遗传修饰的小鼠中的人M-CSF的转录和翻译控制与缺乏其内源小鼠M-CSF基因修饰的小鼠中的小鼠M-CSF的转录和翻译控制是相同或基本上相同的。
[0012]在一些实施方案中，人源化M-CSF小鼠中人M-CSF的生理学浓度源自从在野生型小鼠中分泌小鼠M-CSF的相同细胞类型分泌人M-CSF，所述野生型小鼠具有小鼠M-CSF基因，而且缺乏编码人M-CSF蛋白的核酸。换言之，以正常组织特异性和发育方式表达一种或多种M-CSF同种型。
[0013]在一些实施方案中，小鼠表达选自下组的人M-CSF同种型:蛋白聚糖M-CSF、糖蛋白M-CSF、和细胞表面M-CSF及其组合。在一个实施方案中，小鼠以正常组织特异性和发育方式表达至少两种同种型。在一个具体的实施方案中，小鼠表达人蛋白聚糖CSF-1和人糖蛋白M-CSF和人细胞表面M-CSF。
[0014]在一些实施方案中，小鼠包含人巨噬细胞，其不是胸腺T细胞衍生的巨噬细胞。在一些实施方案中，小鼠包含人巨噬细胞，其展现出由小鼠中表达的人M-CSF刺激的M-CSF依赖性胞足体形成。
[0015]在一些实施方案中，所述小鼠在Rag2方面是纯合无效(homozygous null)的。在一些实施方案中，小鼠在IL2rg方面是纯合无效的。在一些实施方案中，小鼠在Rag2及在IL2rg方面是纯合无效的。在一些实施方案中，小鼠包含人细胞。在一些实施方案中，人细胞是造血细胞。
[0016]在本发明的一些方面，提供了人免疫系统的小鼠模型，该小鼠模型，包含2个无效的Rag2等位基因、2个无效的IL2rg等位基因、与小鼠M-CSF基因的启动子可操作连接的编码人M-CSF蛋白的核酸序列、和人造血细胞。换言之，小鼠是嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠，其中hM-CSF表示小鼠包含至少一种编码人M-CSF基因的核酸。在一些实施方案中，嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠是包含这些遗传修饰的BALB/c品系小鼠。在一些实施方案中，小鼠也包含其它遗传修饰。
[0017]在一些实施方案中，与表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的包含人造血细胞的小鼠相t匕，约12周龄的嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠在骨髓、脾、和外周血中展现出增加的人⑶14+CD33+(h⑶14+⑶33+)细胞频率。在一个具体的实施方案中，在骨髓h⑶14+⑶33+细胞方面比仅表达小鼠M-CSF的小鼠升高约5至约15倍，在一个实施方案中，约12至约14倍。在一个具体的实施方案中，在脾h⑶14+⑶33+细胞方面比仅表达小鼠M-CSF的包含人造血细胞的小鼠升高约2至约6倍，在一个实施方案中，约5至约6倍。在一个具体的实施方案中，在外周血h⑶14+⑶33+细胞方面比仅表达小鼠M-CSF的包含人造血细胞的小鼠升高约2至约8倍，在一个实施方案中，约5至约7倍。
[0018]在一些实施方案中，约12周龄的嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠展现出约15%至约40%、在一个实施方案中约30%的血液中h⑶14+⑶33+单核细胞/巨噬细胞谱系细胞水平。在一个实施方案中，约16周龄的经遗传修饰的嫁接小鼠展现出约15%至约30%、在一个实施方案中约22%的血液中h⑶14+⑶33+单核细胞/巨噬细胞谱系细胞水平。在一个实施方案中，约20周龄的经遗传修饰的嫁接小鼠展现出约5%至约15%、在一个实施方案中约10%的血液中h⑶14+⑶33+单核细胞/巨噬细胞谱系细胞水平。在一个实施方案中，约20周龄的经遗传修饰的嫁接小鼠展现出比表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠中的水平高约4至8倍、在一个实施方案中高约6倍的血液中h⑶14+CD33+单核细胞/巨噬细胞谱系细胞水平。
[0019]在一些实施方案中，约12周龄的嫁接RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠展现出比表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠高约1.5至约6倍的肝中hCD14+CD33+CD45+细胞水平。在一个实施方案中，约12周龄的经遗传修饰的嫁接小鼠展现出比表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠高约1.5至约10倍的肺中h⑶14+CD33+⑶45+细胞水平。在一个实施方案中，约12周龄的经遗传修饰的嫁接小鼠展现出比表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠高约2至约3倍的腹膜或皮肤中人h⑶14+⑶33+⑶45+细胞水平。
[0020]在一些实施方案中，嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠展现出比缺乏人M-CSF的小鼠就肝中的h⑶14+CD33+细胞百分比而言大大约1.5至大约6倍、在一个实施方案中约2至约4倍的对LPS注射的响应；在肺中，就h⑶14+CD33+细胞而言的LPS响应是约1.5至约10倍、在一个实施方案中约2至约3倍；在皮肤中，就h⑶14+CD33+而言的LPS响应是约2至约5倍、在一个实施方案中约3至约4倍；在腹膜中，就h⑶14+CD33+而言的LPS响应是约2至约5倍、在一个实施方案中约3至约4倍。
[0021]在一些实施方案中，嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠展现出响应LPS刺激的增强的促炎性细胞因子应答，其中就响应促炎性细胞因子的细胞类型的活化和/或分化水平而言，比缺乏hM-CSF基因的经遗传修饰的且嫁接的小鼠增强约2至至少约5倍。
[0022]在一些实施方案中，嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠在LPS注射后约48小时在脾中展现出增强的h⑶14+⑶33+h⑶45+细胞生成，其中比表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠增强约2至约5倍，在一个实施方案中4至约5倍。
[0023]在一些实施方案中，嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠展现出响应LPS的增强的血液人IL-6生成，其中LPS注射后6小时的hIL-6水平比表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠增强约2至约5倍，在一个实施方案中约3至约4倍。
[0024]在一些实施方案中，嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠展现出响应LPS的增强的血清人TNFa生成，其中LPS注射后约6小时的hTNF a水平比表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠增强约2至约4倍，在一个实施方案中约2至约3倍。
[0025]在一些实施方案中，自嫁接RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠分离的单核细胞和/或巨噬细胞展现出比表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠在hTNF α方面高约2至3倍的LPS刺激后体外分泌。
[0026]在一些实施方案中，自嫁接RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠分离的单核细胞和/或巨噬细胞展现出比表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠在hIL-6方面高约2至4倍的LPS刺激后体外分泌。
[0027]在一些实施方案中，自嫁接RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠分离的单核细胞和/或巨噬细胞展现出比表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠在hIFN α方面高约3至6倍的多聚1:C刺激后体外分泌。
[0028]在一些实施方案中，自嫁接RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠分离的单核细胞和/或巨噬细胞展现出比表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠在hIFNii方面高约2至3倍的多聚1:C刺激后体外分泌。
[0029]在一些实施方案中，与表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠相比，自嫁接Rag2v-1L2rgv-hM-CSF小鼠分离的人单核细胞和/或巨噬细胞展现出增强的吞噬。在一个实施方案中，与来自表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠的人细胞相比，增强吞噬速率约两倍，如通过在60分钟的时段里于37°C掺入标记细菌测量的。在一个实施方案中，如上文测量的吞噬速率是来自表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠的人细胞的速率的两倍或更多，例如2倍、3倍、或4倍或更多。[0030]在一些实施方案中，与表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠相比，自嫁接Rag2v^IL2rgv^hM-CSF小鼠分离的人单核细胞和/或巨噬细胞展现出响应Mip3 β的增强的体外趋化性。在一个实施方案中，与来自表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠的人单核细胞/巨噬细胞相比，增强约1.5倍至3倍或更多，例如约1.5倍、2倍、3倍、4倍或更多，如通过在Mip3 β暴露后30或60分钟时迁移细胞数目测量的。
[0031]在一些实施方案中，自嫁接的RagZilI^rgvIl-CSFh小鼠分离的人单核细胞和/巨噬细胞展现出比表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的嫁接小鼠在hIFN α方面高约3至6倍的多聚1:C刺激后的体外分泌。
[0032]在一些实施方案中，自嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠分离的人单核细胞和/巨噬细胞展现出响应LPS刺激的共刺激分子的体外上调。在一个实施方案中，共刺激分子选自人⑶40、人⑶80、人⑶86、人HLA-DR、及其组合。
[0033]在本发明的一些方面，提供了经遗传修饰的嫁接小鼠，其中小鼠包含人造血细胞的嫁接，是RagZ+IUrg+，包含小鼠M-CSF的无效等位基因，并且包含内源M-CSF基因座处编码人M-CSF的核酸序列，其中与表达小鼠M-CSF而非人M-CSF的小鼠相比，所述小鼠展现出人髓样细胞的增强或数 目增加。
[0034]在一些实施方案中，增强包括在选自下组的小鼠部分中h⑶14+⑶33+细胞数目至少加倍:骨髓、脾和外周血。在一个具体的实施方案中，增强包括h⑶14+⑶33+细胞的三倍。在另一个实施方案中，增强包括h⑶14+⑶33+细胞数目增加4至5倍或更多。
[0035]在一些实施方案中，增强包括在选自下组的小鼠区室中h⑶14+⑶33+h⑶45+细胞数目增加2至3倍:皮肤和腹膜。
[0036]在一些实施方案中，增强包括在选自下组的小鼠区室中h⑶14+⑶33+h⑶45+细胞数目增加1.5至10倍:肝和肺。
[0037]在一些实施方案中，增强包括LPS刺激后约48小时时h⑶14+CD33+h⑶45+脾细胞数目增加4至5倍。
[0038]在一些实施方案中，增强包括LPS刺激的血清hIL-6或LPS刺激的血清hTNF α增加2至4倍。
[0039]在一些实施方案中，增强包括人ΜΙΡ3β刺激的h⑶14+⑶33+细胞体外迁移升高2至3倍。
[0040]在本发明的一些方面，提供了人病原体的小鼠模型，小鼠模型包含2个Rag2无效等位基因、2个IL2rg无效等位基因、与小鼠M-CSF基因的启动子可操作连接的编码人M-CSF蛋白的核酸序列、人造血细胞、和人病原体的感染。换言之，小鼠是已经用人病原体感染的嫁接RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠。在一些实施方案中，病原体是病毒、真菌或细菌。在一些实施方案中，病毒是人或猪或禽流感病毒。在一些实施方案中，细胞是分枝杆菌(mycobacterium),例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tuberculosis)。在一些实施方案中，细菌是肠杆菌，例如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi, S.typhi)。
[0041]在本发明的一些方面，提供了多能性、经诱导的多能性、或全能性小鼠细胞，其包含与小鼠M-CSF基因的启动子可操作连接的编码人M-CSF蛋白的核酸序列。在一个实施方案中，小鼠细胞是小鼠ES细胞。
[0042]在本发明的一些方面，提供了小鼠胚胎，其包含与小鼠M-CSF基因的启动子可操作连接的编码人M-CSF蛋白的核酸序列。
[0043]在本发明的一些方面，提供了用于靶向小鼠M-CSF基因的靶向构建体，其包含(a)与(i)编码小鼠M-CSF蛋白的核苷酸序列、或(ii)与编码小鼠M-CSF蛋白的核苷酸序列互补的核苷酸序列的上游和下游核苷酸序列互补或基本上互补的上游和下游靶向臂；(b)编码人M-CSF蛋白或其片段的人核酸序列，或编码人M-CSF蛋白互补物或其片段的核苷酸序列；和(c)标志物和/或选择盒。
[0044]在本发明的一些方面，提供了如本文中描述的来自小鼠的人免疫细胞。在一个实施方案中，人免疫细胞选自人单核细胞和人巨噬细胞。在一个实施方案中，人免疫细胞选自人NK细胞、人B细胞、和人T细胞。
[0045]在本发明的一些方面，提供了如本文中描述的由来自小鼠的人核苷酸序列编码的抗体。在一个实施方案中，抗体选自IgA，IgD，IgE，IgM，或IgG同种型抗体。
[0046]在本发明的一些方面，提供了编码人免疫球蛋白序列的核苷酸序列，其中核苷酸序列获自依照本发明的嫁接的人源化M-CSF小鼠。在一个实施方案中，核苷酸序列编码人免疫球蛋白基因的人可变区或其片段。在一个实施方案中，核苷酸序列编码人TCR可变区或其片段。
[0047]在本发明的一些方面，提供了用于生成表达生物学活性人M-CSF的人源化M-CSF小鼠的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使小鼠多能干细胞，例如ES细胞或iPS细胞与包含人M-CSF蛋白或其片段的编码序列的核酸序列接触，并在促进核酸序列整合入小鼠基因组中的条件下培养多能干细胞；从包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列的小鼠ES细胞生成小鼠；并在足以使小鼠从人M-CSF基因表达人M-CSF的条件下维持小鼠。在一些实施方案中，将核酸序列随机整合入基因组中。在其它实施方案中，将核酸序列整合入靶基因座中。在一些此类实施方案中 ，靶基因座是内源小鼠M-CSF基因座，例如包含人M-CSF蛋白编码序列的核酸序列侧翼有与内源小鼠M-CSF基因座同源的序列，并且核酸序列通过同源重组整合入内源小鼠M-CSF基因座中。在一些实施方案中，小鼠在Rag2方面是纯合无效的。在一些实施方案中，小鼠在IL2rg方面是纯合无效的。在一些实施方案中，小鼠在Rag2和IL2rg方面是纯合的，即它是RagZ+II^rg+。
[0048]在本发明的一些方面，提供了用于生成包含人造血系统的人源化M-CSF小鼠的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含造血祖细胞的细胞群体移植到人源化M-CSF小鼠，例如RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠或亚致死照射的hM-CSF小鼠中。在一些实施方案中，人造血祖细胞是⑶34+细胞。在一些实施方案中，人造血祖细胞是⑶133+。在一些实施方案中，人造血祖细胞是多能干细胞，例如ES细胞或iPS细胞。在一些实施方案中，包含人造血祖细胞的细胞群体来源是胎儿肝。在一些实施方案中，细胞来源是骨髓。在一些实施方案中，细胞来源是外周血。在一些实施方案中，细胞来源是体外细胞群体。
[0049]在本发明的一些方面，提供了用于生成受人病原体感染的小鼠的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含人造血细胞的人源化M-CSF，例如嫁接的Rag2v-1L2rgv-hM-CSF小鼠或嫁接的亚致死照射小鼠暴露于人病原体，并在足以使人病原体感染小鼠的条件下维持小鼠。在一些实施方案中，人病原体是不感染缺乏本文中描述的一处或多处遗传修饰的小鼠的人病原体。在一些实施方案中，人病原体是在缺乏本文中描述的一处或多处遗传修饰的小鼠中不致病的人病原体。[0050]在本发明的一些方面，提供了用于在小鼠中生成生物学活性人M-CSF的方法，所述方法包括生成表达生物学活性人M-CSF的人源化M-CSF小鼠，如上文和本文中别处描述的。在一些实施方案中，所述方法包括从小鼠的血液，例如血清，或组织纯化生物学活性人M-CSF0在一些实施方案中，所述方法包括从小鼠获得表达生物学活性人M-CSF的细胞，在足以使细胞表达和分泌生物学活性人M-CSF的条件下培养细胞，并分离分泌性生物学活性人M-CSF。注意到在本发明的此方面，不需要小鼠具有任何其它遗传修饰，而且小鼠可用于生成某些人免疫细胞制备物。因而，在本发明的一些方面，提供了自转基因小鼠获得的分离的生物学活性人M-CSF。
[0051]在本发明的一些方面，提供了用于在小鼠中生成活化的人单核细胞或活化的人巨噬细胞的方法，包括将用人造血细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠暴露于免疫刺激物，容许小鼠中人单核细胞或巨噬细胞被活化，并从小鼠分离人单核细胞或人巨噬细胞，其中活化的单核细胞或活化的巨噬细胞的分数比从不是人源化M-CSF小鼠，即缺乏人M-CSF基因的嫁接小鼠获得的高约2倍至5倍。在一些实施方案中，免疫刺激物是内毒素。在一个具体的实施方案中，内毒素是LPS。
[0052]在本发明的一些方面，提供对候选药剂筛选在调控人造血细胞功能中的活性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用人造血细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠，例如嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠或嫁接的亚致命照射hM-CSF小鼠与候选药剂接触；并比较与候选药剂接触的小鼠模型中造血细胞的功能与没有与候选药剂接触的小鼠模型中造血细胞的功能；其中与候选药剂接触的小鼠中造血细胞功能的调控指示候选药剂调控造血细胞功能。
[0053]在本发明的一些方 面，提供了用于测定药剂对人病原体的影响的方法，其包括将嫁接的人源化M-CSF小鼠，例如嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠或嫁接的亚致死照射hM-CSF小鼠暴露于有效量的人病原体，病原体的有效量是在小鼠中产生感染需要的病原体量；容许病原体感染小鼠；在存在药剂的情况中随时间测量感染参数；并比较所述测量值与来自未暴露于药剂的嫁接人源化M-CSF小鼠的测量值。在一些实施方案中，在将小鼠暴露于人病原体前提供药剂，例如以测定保护效应。在一些实施方案中，与将小鼠暴露于人病原体同时提供药剂，例如以测定保护或治疗效果。在一些实施方案中，在将小鼠暴露于人病原体后提供药剂，例如以测定治疗效果。在一些实施方案中，暴露于人病原体后的小鼠启动细胞和/或体液免疫应答，其模仿暴露于病原体的人感染。在一些实施方案中，人病原体是不感染缺乏本文中描述的一处或多处遗传修饰的小鼠的病原体。在一些实施方案中，人病原体是感染野生型小鼠的病原体，其中感染后的野生型小鼠不模仿人响应病原体启动的免疫应答。在一些实施方案中，病毒是人或猪或禽流感病毒。在一些实施方案中，细菌是分枝杆菌，例如结核分枝杆菌。在一些实施方案中，细菌是肠杆菌，例如伤寒沙门氏菌。在一些实施方案中，将小鼠暴露于已知数目的人病原体感染单位，并且感染参数是小鼠体液或组织中人病原体的感染单位的数目。在一些实施方案中，感染参数是小鼠体液中的滴度。在一些实施方案中，感染的参数是肉芽肿的形成。在一些此类实施方案中，肉芽肿是肺肉芽肿。在一些此类实施方案中，肉芽肿是定义明确的肉芽肿。
[0054]在本发明的一些方面，提供了用于测定药剂对人病原体的影响的方法，其包括将嫁接的人源化M-CSF小鼠，例如嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠或嫁接的亚致死照射hM-CSF小鼠暴露于有效量的人病原体抗原，抗原的有效量是在小鼠中促进细胞和/或体液应答需要的抗原量；容许形成细胞和/或体液应答；在存在药剂的情况中随时间测量细胞和/或体液应答参数；并比较所述测量值与来自未暴露于药剂的嫁接人源化M-CSF小鼠的测量值。在一些实施方案中，在将小鼠暴露于来自人病原体的抗原前提供药剂，例如以测定药剂的保护效果。在一些实施方案中，与将小鼠暴露于来自人病原体的抗原同时提供药剂，例如以测定药剂的保护或治疗效果。在一些实施方案中，在将小鼠暴露于来自人病原体的抗原后提供药剂，例如以测定药剂的治疗效果。在一些实施方案中，对人病原体暴露后的小鼠发动细胞和/或体液免疫应答，其模仿暴露于病原体的人感染。 [0055]在一些实施方案中，抗原来自人病原体，其不感染缺乏本文中描述的一处或多处遗传修饰的小鼠。在其它实施方案中，抗原来自感染野生型小鼠的人病原体，其中感染后的野生型小鼠不模仿人响应病原体发动的免疫应答。在一些实施方案中，病原体是病毒、真菌、或细菌。在一些实施方案中，病毒是人或猪或禽流感病毒。在一些实施方案中，细菌是分枝杆菌，例如结核分枝杆菌。在一些实施方案中，细菌是肠杆菌，例如伤寒沙门氏菌。
[0056]在本发明的一些方面，提供了对候选药剂筛选对人造血细胞的毒性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用人造血细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠，例如嫁接的Rag2v-1L2rgv-hM-CSF小鼠与候选药剂接触；并比较与候选药剂接触的小鼠中的造血细胞的存活力和/或功能与没有与候选药剂接触的用人造血细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠中的造血细胞的存活力和/或功能；其中与候选药剂接触的小鼠中的造血细胞的存活力和/或功能降低指示候选药剂对造血细胞是有毒性的。
[0057]在本发明的一些方面，提供了对候选药剂筛选保护人造血细胞免于毒性制剂的能力、减轻毒性制剂对人造血细胞的影响、或者反转毒性制剂对人造血细胞的影响的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用人造血细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠，例如，嫁接的Rag2v^IL2rgv^hM-CSF小鼠或嫁接的亚致死照射hM-CSF小鼠与毒性制剂接触；使小鼠与候选药剂接触；并比较与候选药剂接触的小鼠中造血细胞的存活力和/或功能与没有与候选药剂接触的用人造血细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠中造血细胞的存活力和/或功能；其中与候选药剂接触的小鼠模型中造血细胞的存活力和/或功能的增强指示候选药剂保护造血细胞免于毒性制剂毒害。
[0058]在本发明的一些方面，提供了用于预测个体对用治疗剂治疗的响应性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将用来自个体的人造血细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠，例如嫁接RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠或嫁接的亚致死照射hM-CSF小鼠与治疗剂接触；并比较与候选药剂接触的小鼠模型中造血细胞的存活力和/或功能与没有与候选药剂接触的用人造血细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠中造血细胞的存活力和/或功能；其中与候选药剂接触的小鼠中造血细胞的存活力和/或功能的调控指示个体会对用所述治疗剂的治疗响应。
[0059]附图简述
[0060]图1显示了对于骨髓间充质基质细胞，(A)M-CSF的表达；分离来自M_CSFm/m和M-CSFh7h的指定器官，提取RNA，并使用小鼠M-CSF(顶部)或人M_CSF(中间)特异性引物实施逆转录(RT)-PCR分析；使用HPRT水平(底部)作为输入cDNA的对照；数据代表2次独立实验。(B)分离来自M-CSFivm的指定器官，提取RNA，并使用小鼠M-CSF(顶部)或人M-CSF(中间)特异性引物实施逆转录RT-PCR分析。自小鼠肝或人胎儿肝提取的RNA分别充当小鼠和人引物对的阳性对照，无RT，和无模板PCR反应充当阴性对照。数据代表2次独立实验。(C)将来自M-CSFm/m、M-CSFm/h和M-CSFh7h小鼠的骨关联基质细胞分离，并在体外培养10天，将细胞裂解，并提取RNA，并使用小鼠M-CSF (白色)或人M-CSF (黑色)特异性引物实施实时PCR分析；显示了一式两份样品的均值数值；误差棒标示土SEM ;依照HPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)表达水平标准化输入cDNA量；数据代表2次独立实验；和⑶将来自M-CSFm/m、M-CSFm7h和M-CSFivh小鼠的骨关联基质细胞分离，并在体外培养10天；收集细胞培养物上清液，并使用物种特异性M-CSF ELISA试剂盒量化小鼠(白色)和人(黑色)M-CSF的分泌水平；显示了一式三份样品的均值数值；误差棒标示土SEM ;数据代表2次独立实验。(E)将M-CSFn1'M-CSFh'和M-CSFh7h小鼠放血，并经由ELISA量化人和小鼠M-CSF的血清水平。显示了一式三份样品的均值数值。误差棒标示土SEM。
[0061]图2A以每只动物(两个胫骨和腓骨)的平均值显示了 M-CSFdiaiKSFdia和M-CSFiv1MnIl的骨髓(BM)细胞的绝对数目；每组含有n=5只小鼠，4周龄；误差棒标示土SEM;数据代表3次独立实验。
[0062]图2B 显示了 对来自 M-CSFdiai, M-CSFm/hand M-CSFh7h 小鼠的 BM (顶部)、脾(中间)和外周血(PB)的染色单细胞悬浮液的流式细胞术分析；用Grl和CDllb抗体染色。
[0063]图2C显示了对来自M-CSFd^M-CSFdia和M_CSFh/h小鼠的BM (顶部)和脾(中间)的染色单细胞悬浮液的流式细胞术分析；用F4/80和CDllb抗体染色。
[0064]图2D显示了分离并在存在重组小鼠M-CSF(左侧)或人M-CSF(右侧)的情况中培养7天的BM细胞的流式细胞术分析；用F4/80和CDllb抗体染色细胞。
[0065]图2E显示了分离并在存在重组小鼠M-CSF (实心)或人M_CSF(空心)的情况中培养7天的BM细胞的流式细 胞术分析；用指定的表面标志物染色细胞。
[0066]图3A显示了来自人CD34+细胞嫁接的M-CSFd^M-CSFdia和M-CSFh7h小鼠的BM (顶部)、脾(中间)和外周血(PB)的单细胞悬浮液的流式细胞术；用CD45、CD14和CD33人抗体染色；将人⑶45+的细胞预先门控，并基于⑶14和⑶33表达区分。
[0067]图3B显示了 BM(顶部)、脾(中间)和外周血(PB)的人⑶45+⑶14+⑶33+细胞的相对频率；BM细胞的绝对数目以每只动物(两个胫骨和腓骨)的平均值测定，并且外周血的绝对数目按每ml体积血液测定；每组含有n=20只小鼠；每个符号代表个别小鼠，水平棒表示均值数值；数据代表5次独立实验。
[0068]图3C显示了 BM(顶部)、脾(中间)和外周血(PB)的人⑶45+⑶14+⑶33+细胞的绝对频率；BM细胞的绝对数目以每只动物(两个胫骨和腓骨)的平均值测定，并且外周血的绝对数目按每ml体积血液测定；每组含有n=20只小鼠；每个符号代表个别小鼠，水平棒表示均值数值；数据代表5次独立实验。
[0069]图4A显示了移植12、16和20周后放血的人CD34+细胞嫁接的M-CSFni' M-CSFm7h和M-CSFivh小鼠的染色细胞的流式细胞术分析；用CD45、CD14和CD33人抗体染色细胞；将人⑶45+的细胞预先门控，并基于⑶14和⑶33表达区分。
[0070]图4B显示了人CD45+CD14+CD33+细胞的相对频率；每组含有n=10只小鼠；每个符号代表个别小鼠，水平棒表示均值数值；数据代表3次独立实验。
[0071]图5显示了用人⑶34+细胞嫁接并在移植后12周(此时将动物处死并用PBS灌注)的M-CSFm/m、M-CSFm/h和M-CSFh7h小鼠的流式细胞术结果的分析；将肝㈧、肺⑶和皮肤(C)收获，并制备单细胞悬浮液；通过与PBS —起吸出收集腹腔细胞(D);用人CD45、CD14和CD33抗体染色细胞，并通过流式细胞术分析；每个符号代表个别小鼠，水平棒表示均值数值；数据代表3次独立实验。
[0072]图6显示了 LPS刺激的结果。(A)用人⑶34+细胞嫁接M_CSFm/m和M_CSFm/h小鼠，并在移植后12周，1.p.注射LPS，在48小时后将小鼠处死，并测定脾中人⑶45+⑶14+⑶33+细胞的频率；经PBS注射的小鼠充当对照；每个符号代表个别小鼠，水平棒表示均值数值。⑶，(C)用人CD34+细胞嫁接M-CSFm/m和M_CSFm/h小鼠，并在移植后12周，1.p.注射LPS。6小时后，将小鼠放血，并通过ELISA量化人(右侧)和小鼠(左侧)IL-6和TNF α的血清水平；经PBS注射的小鼠充当对照；显示了一式三份样品的均值数值；误差棒标示土SEM。
[0073]图7Α(对于hTNFa )和7B(对于hIL_6)显示了单核细胞/巨噬细胞在LPS刺激后体外分泌促炎性细胞因子的能力。移植12周后分离来自人CD34+细胞嫁接的M-CSFm/m和M-CSFh7h小鼠的脾的人⑶45+⑶14+⑶33+细胞；自胎儿肝获得的人⑶45+CD14+⑶33+细胞充当对照；将细胞用LPS在体外刺激24或48小时，收集细胞培养物上清液，并经由ELISA量化人TNF a (A)和IL-6(B)水平；显示了一式三份样品的均值数值；误差棒标示土SEM。
[0074]图7C显示了响应多聚1:C刺激的干扰素-α和-PmRNA水平。用多聚1:C将人CD45+CD14+CD33+细胞刺激6或12小时，并通过实施PCR量化IFNa (左侧)和IFNP (右侧)mRNA水平；显示了一式两份样品的均值数值；误差棒标示土SEM。[0075]图7D显示了来自嫁接小鼠的细胞的吞噬、迁移、和活化特性。将人⑶45+CD14+⑶33+细胞从人源化小鼠分离，并于37°C与经FITC标记的细菌一起温育30或60分钟，并通过流式细胞术测量；在冰上与经FITC标记的细菌一起温育的细胞充当对照。空心直方图表示来自M-CSFm/m小鼠的细胞，虚线直方图表示来自M-CSFivh小鼠的细胞，而实心直方图表示来自人胎儿肝的细胞。
[0076]图7E显示了响应MIP3 β的细胞趋化性。将自M-CSF—小鼠、M_CSFh/h小鼠和人胎儿肝分离的人CD45+CD14+CD33+细胞在上部孔中保持，并将含有MIP3 β的培养基添加到下部孔中；将细胞温育30或60分钟，并将从上部孔至下部孔的细胞数目计算并绘图；显示了一式两份样品的均值数值；误差棒标不土 SEM。
[0077]图7F显示了基于体外LPS刺激后hCD40、hCD80、hCD86、和hHLA_DR上调的增强的来自嫁接小鼠的人单核细胞/巨噬细胞活化。将自M-CSFm/m小鼠、M-CSFivh小鼠、和人胎儿肝分离的人⑶45+⑶14+CD33+细胞在存在或缺乏LPS的情况中培养；刺激24小时后，将细胞用指定的表面标志物染色，并通过流式细胞术测量。空心直方图表示来自M-CSFm/m小鼠的细胞，虚线直方图表示来自M-CSFivh小鼠的细胞，而实心直方图表示来自人胎儿肝的细胞。
[0078]图8提供了小鼠M-CSF基因座的示意图，其标示外显子1_9的相对位置及用人M-CSF基因的最终靶定等位基因。
[0079]图9A, B显示了 M-CSFn1' M-CSFh7'和M_CSFh/h小鼠中HSC区室和髓样细胞祖先区室的频率。用 lineage、c-Kit、Seal、CD150、CD48、CD16/32、和 CD34 抗体染色来自 M-CSFm7m, M-CSFm7h和M-CSFivh小鼠的BM细胞，并通过流式细胞术分析。(A)将Lineage-细胞(顶部)门控，并基于Scal和c-Kit表达(中间)区别。将Lineage_Scal+c-Kit+(LSK)细胞门控，并进一步基于CD150和CD48表达(底部)区别。(B)将Lineage—细胞预先门控，并基于Scal和c-Kit表达(顶部)区别。将Lineage_c-Kit+Scal_细胞预先门控，并基于CD16/32和⑶34表达(底部)进一步区别。
[0080]发明详述
[0081]在描述本方法和组合物前，应当理解本发明不限于描述的具体方法和组合物，因为其当然可以有所变化。还应当理解，本文中所使用的术语仅为了描述具体的实施方案，而并不意图是限制性的，因为本发明的范围仅会以所附权利要求书为限。
[0082]除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然可以在本发明的实施或测试中使用与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但是现在描述具体的方法和材料。通过提及将本文中提及的所有出版物收入本文以公开及描述引用的出版物有关的方法和/或材料。应当理解，在存在矛盾的情况下，本公开内容替代收录的出版物的任何矛盾公开内容。
[0083]如本领域技术人员在阅读本公开内容后会显而易见的，本文中描述并例示的每个单独实施方案具有离散组分和特征，其可以在不偏离本发明范围或精神的前提下容易地与任何其它几个实施方案的特征分开或组合。可以以叙述事件的次序或以逻辑上可能的任何其它次序实施任何叙述的方法。
[0084]必须注意到，如本文中及所附权利要求书中使用的，单数形式“一种”、“一个”和“该/所述”包括复数个提及物，除非上下文另有明确指示。如此，例如，提及“细胞”包括多个/种此类细胞，且提及“该/所述肽”包括提及一个/种或多个/种肽及本领域技术人员知道的其等同物，例如多肽，等等。
[0085]本文中讨论的 出版物仅提供其在本申请提交日前的公开内容。本文中的内容均不应解释为承认凭借在先发明，本发明没有资格早于此类出版物。
[0086]本申请提供了包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列的经遗传修饰的小鼠。还提供了包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列且已经用人细胞诸如人造血细胞嫁接的经遗传修饰的小鼠，及用于生成此类嫁接小鼠的方法。这些小鼠可用于许多应用，诸如在为人免疫性疾病和病原体感染建模中；在调控(例如在健康或患病状态中)造血细胞发育和/或活性的药剂的体内筛选中；在对造血细胞有毒性的药剂的体内筛选中；在针对毒性制剂对造血细胞的毒性影响提供保护、减轻、或反转毒性制剂对造血细胞的毒性影响的药剂的体内筛选中；在预测个体对疾病疗法的响应性的来自个体的人造血细胞的体内筛选中，等等。
[0087]人源化M-CSF小鼠
[0088]在本发明的一些方面，提供了人源化M-CSF小鼠。人源化M-CSF小鼠，或“hM-CSF小鼠”意指包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列的小鼠。人M-CSF蛋白意指作为人M-CSF或者与人M-CSF基本上相同的蛋白质，例如它与人M-CSF是80%或更多相同的、85%或更多相同的、90%或更多相同的、或95%或更多相同的，例如，与人M-CSF是97%、98%、或99%相同的。因此，编码人M-CSF蛋白的核酸序列是包含人M-CSF蛋白，即人M-CSF或与人M-CSF基本上相同的蛋白质的编码序列的多核苷酸。M-CSF(又称为CSF-1，代表“集落刺激因子I”)是一种控制巨噬细胞生成、分化和功能的细胞因子。人M-CSF的多肽序列和编码人M-CSF的核酸序列可以参见Genbank登录号NM_000757.5 (变体I)、NM_172210.2 (变体2)、和NM_172212.2(变体4)。编码人M-CSF蛋白的基因组基因座可以存在于人基因组中染色体I处；NC_000001.10(110453233-110472355)。蛋白质序列由此基因座处的外显子I到8编码，而外显子9包含非翻译序列。因而，包含人M-CSF编码序列的核酸序列包含人M-CSF基因的外显子1-8中的一个或多个。在一些例子中，核酸序列还包含人M-CSF的基因组基因座的各方面，例如内含子、3’和/或5’非翻译序列(UTR)。在一些例子中，核酸序列包含人M-CSF基因组基因座的整个区域。在一些例子中，核酸序列包含人M-CSF基因组基因座的外显子2至非编码外显子9下游633nt。
[0089]在本申请的人源化M-CSF小鼠中，编码人M-CSF蛋白的核酸序列与小鼠M-CSF基因的一种或多种调节序列可操作连接。小鼠M-CSF调节序列是调节小鼠M-CSF表达的小鼠M-CSF基因组基因座的那些序列，例如5’调节序列，例如M-CSF启动子、M-CSF5’非翻译区(UTR)，等等；3’调节序列，例如3’UTR ;和增强子，等等。小鼠M-CSF在染色体3上位于约位置107，543，966-107，563，387，并且小鼠M-CSF编码序列可以参见Genbank登录号 NM_007778.4(同种型 I)，NM_001113529.1(同种型 2)、和 NM_001113530.1(同种型3)。小鼠M-CSF的调节序列是本领域中定义明确的，并且可以使用在硅中(in silico)方法容易地鉴定，例如通过在UCSC基因组流感器上在环球网上于genome, ucsc.edu参考上述Genbank登录号进行,或者通过实验方法进行，如下文和本领域中描述的，例如Abboud等(2003)Analysis of the Mouse CSF-1Gene Promoter in a Transgenic Mouse Model.J.Histochemistry and Cytochemistry51 (7):941-949,其公开内容通过提及收入本文。在一些例子中，例如在编码人M-CSF蛋白的核酸序列位于小鼠M-CSF基因组基因座时，与人CSF编码序列可操作连接的调节序列对于小鼠基因组而言是内源的或天然的，即它们在整合人核酸序列前存在于小鼠基因组中。
[0090]在一些例子中，通过将编码人M-CSF蛋白或其片段的人核酸序列，即“人M-CSF核酸序列”或“人M-CSF序列”随机整合入或插入基因组中生成人源化M-CSF小鼠。通常，在此类实施方案中，编码人M-CSF蛋白的核酸序列在基因组中的位置是未知的。在其它例子中，通过例如同源重组将人M-CSF核酸序列靶向整合到或插入基因组中来生成人源化M-CSF小鼠。在同源重组中，将多核苷酸在靶基因座处插入宿主基因组中，期间同时从靶基因座除去宿主基因组材料，例如50个碱基对(bp)或更多、IOObp或更多、200bp或更多、500bp或更多、IkB或更多、2kB或更多、5kB或更多、IOkB或更多、15kB或更多、20kB或更多、或50kB或更多基因组材料。因此，例如在编码通过将人M-CSF核酸序列靶向至小鼠M-CSF基因座创建的人源化M-CSF小鼠中，人M-CSF核酸序列可以替换M-CSF基因座处的某个或整个小鼠序列，例如外显子和/或内含子，所述人源化M-CSF小鼠包含编码人M-CSF蛋白的核酸序列。在一些此类例子中，将人M-CSF核酸序列整合入小鼠M-CSF基因座中，使得人M-CSF序列的表达受到小鼠M-CSF基因座处天然的、或内源的调节序列调节。换言之，与编码人M-CSF蛋白的核酸序列可操作连接的调节序列是小鼠M-CSF基因座处的天然M-CSF调节序列。
[0091]在一些例子中，人M-CSF序列的整合没有影响已经接受人M-CSF序列整合的基因的转录。例如，若人M-CSF序列以内含肽整合入编码序列中，或者人M-CSF序列包含2A肽，则会与已经接受人M-CSF序列整合的基因同时转录和翻译人M-CSF序列。在其它情况中，人M-CSF序列的整合中断已经接受人M-CSF序列整合的基因的转录。例如，在通过同源重组整合人M-CSF序列后，可以除去整合基因座处的某个或整个编码序列，从而取而代之转录人M-CSF序列。在一些此类例子中，人M-CSF序列的整合创建无效突变，并且因此创建无效等位基因。无效等位基因是完全缺乏所述基因的正常功能的基因突变体拷贝。这可以是由于在分子水平上完全缺乏基因产物(蛋白质、RNA)，或者非功能性基因产物的表达所致。在表型水平上，无效等位基因与整个基因座的缺失可区别。
[0092]在一些例子中，人源化M-CSF小鼠包含编码人M-CSF蛋白的一个拷贝的核酸序列。例如，小鼠可以在核酸序列方面是杂合的。换言之，基因座处的一个等位基因会包含核酸序列，而另一个会是内源等位基因。例如,如上文讨论的,在一些例子中,将人M-CSF核酸序列整合入小鼠M-CSF基因座中，使得它创建小鼠M-CSF的等位基因。在一些此类实施方案中，人源化M-CSF小鼠可以在编码核酸序列方面是杂合的，即人源化M-CSF小鼠包含一个小鼠M-CSF无效等位基因(包含所述核酸序列的等位基因)和一个内源M-CSF等位基因(野生型或其它情况)。换言之，小鼠是M-CSFh7n小鼠，其中“h”代表包含人序列的等位基因，而“m”代表内源等位基因。在其它情况中，人源化M-CSF包含两个拷贝的编码人M-CSF蛋白的核酸序列。例如，小鼠在所述核酸序列方面可以是纯合的，即二倍体基因组中基因座的这两个等位基因会包含核酸序列，即人源化M-CSF小鼠包含两个小鼠M-CSF无效等位基因(包含所述核酸序列的等位基因)。换言之，小鼠是M-CSFivh小鼠。
[0093]显著地，人源化M-CSF小鼠，例如诸如上文描述的那些人源化M-CSF小鼠，例如M-CSFh7h和M-CSFivm小鼠展现出巨噬细胞和单核细胞的正常的、或野生型发育和功能和从巨噬细胞谱系细胞发育的组织，例如骨。例如，人源化小鼠正常的牙齿和骨特性以及正常的骨髓含量、骨髓、脾和外周血中髓样细胞频率、和骨髓和脾中的巨噬细胞频率。
[0094]在一些例子中，人源化M-CSF小鼠包含其它遗传修饰。例如，人源化M-CSF小鼠可以包含至少一个Rag2基因无 效等位基因(“重组活化基因2”，可以参见Genbank登录号1.NM_009020.3的编码序列)。在一些实施方案中，人源化M-CSF小鼠包含两个Rag2无效等位基因。换言之，人源化M-CSF小鼠是Rag2方面纯合的。作为另一个例子，人源化M-CSF小鼠包含至少一个IL2rg基因无效等位基因(“白介素2受体，Y”，又称为常见的Y链，或￥(:，可以参见661*&1^登录号1.匪_013563.3的编码序列)。在一些实施方案中，人源化M-CSF小鼠包含两个IL2rg无效等位基因。换言之，人源化M-CSF小鼠是IL2rg方面纯合无效的。在一些实施方案中，小鼠包含Rag2和IL2rg两者的无效等位基因，即它是Rag2^IL2RG^0还涵盖其它遗传修饰。例如，人源化M-CSF小鼠可以包含与造血细胞和免疫系统的发育和/或功能有关的其它基因中的修饰，例如，用编码人直向同系物的核酸序列替换一种或其它小鼠基因。另外/或者，人源化M-CSF小鼠可以包含与其它细胞和组织的发育和/或功能有关的基因中的修饰，例如与人病症或疾病有关的基因，或者在小鼠中修饰时提供人病症和疾病的小鼠模型的基因。
[0095]在本发明的一些方面，用细胞嫁接或移植人源化M-CSF小鼠，例如Rag2v^IL2rgv^hM-CSF小鼠或亚致死照射的hM-CSF小鼠。细胞可以是有丝分裂细胞或分裂期后细胞，并且包括感兴趣的细胞诸如多能干细胞，例如ES细胞、iPS细胞、和胚胎生殖细胞；和体细胞，例如成纤维细胞、造血细胞、神经元、肌细胞、骨细胞、血管内皮细胞、肠细胞，等等，及其谱系限制性祖先和前体。特别感兴趣的细胞群包括那些包含造血干细胞或祖细胞的细胞群，其会促成或重建人源化M-CSF小鼠的造血系统，例如，外周血白细胞、胎儿肝细胞、胎儿骨、胎儿胸腺、胎儿淋巴结、血管化皮肤、动脉段、和纯化的造血干细胞，例如移动的HSC或脐带血HSC。细胞可以来自任何哺乳动物物种，例如鼠、B齿齿类、犬、猫科、马、牛、绵羊、灵长类、人，等等。细胞可以来自建立的细胞系或者它们可以是原代细胞，其中“原代细胞”、“原代细胞系”、和“原代培养物”在本文中可互换使用，指已经自受试者衍生并且容许在体外生长达有限数目的培养物传代(即分开)的细胞和细胞培养物。例如，原代培养物是可以已经传代O次、I次、2次、4次、5次、10次、或15次，但是没有足够的时间经历临界阶段(crisis stage)的培养物。通常，将本发明的原代细胞系在体外维持少于10次传代。
[0096]若细胞是原代细胞，则可以通过任何方便方法将它们从个体收获。例如，可以通过脱落、白细胞脱落、密度梯度分离等收获细胞，例如血细胞，例如白细胞。作为另一个例子，可以通过活组织检查收获细胞，例如皮肤、肌肉、骨髓、脾、肝、胰腺、肺、肠、胃组织等。可以使用合适的溶液来分散或悬浮收获的细胞。此类溶液一般会是平衡的盐溶液，例如正常的盐水、PBS、Hank氏平衡盐溶液，等等，其方便地补充有胎牛血清或其它天然存在的因子以及低浓度(一般5-25mM)的可接受缓冲剂。方便的缓冲剂包含HEPES、磷酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂，等等。
[0097]在一些例子中，会将异质细胞群体移植到人源化细胞中。在其它例子中，会将富含特定细胞类型，例如祖细胞，例如造血祖细胞的细胞群体嫁接到人源化小鼠中。可以通过任何方便的分离技术进行感兴趣细胞群体的富集。例如，可以通过培养方法富集感兴趣的细胞。在此类培养方法中，通常将特定的生长因子和营养物添加到培养物，其促进一种细胞群在其它细胞上的存活和/或增殖。影响存活和/或增殖的其它培养条件包括在粘附或非粘附基质上的生长、培养特定的时间长度，等等。此类培养条件是本领域中公知的。作为另一个例子，通过亲和分离技术从初始群体分离感兴趣细胞来富集感兴趣细胞。用于亲和分离的技术可以包括使用用亲和试剂包被的磁珠进行的磁性分离、亲和层析、用附接于固体基质(例如板)的亲和试剂“淘洗”、与亲和试剂连接或结合亲和试剂使用的细胞毒性制剂例如补体和细胞毒素、或其它方便的技术。提供精确分离的技术包括荧光活化细胞分选仪，其可以具有不同程度的精密化，诸如多色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道，等等。可以通过采用与死亡细胞有关的染料(例如，碘化丙啶)针对死亡细胞选择细胞。可以采用对感兴趣细胞的存活力不是过度不利的任何技术。
[0098]例如，使用亲 和分离技术，可以通过使群体与亲和试剂接触从群体消减不作为移植感兴趣的细胞的细胞，所述亲和试剂特异性识别并选择性结合不在感兴趣细胞上表达的标志物。例如，为了富集造血祖细胞群体，可以消减表达成熟造血细胞标志物的细胞。另外/或者，可以通过使群体与亲和试剂接触实施正选择和分离，所述亲和试剂特异性识别并选择性结合与造血祖细胞有关的标志物，例如CD34，CD133，等等。“选择性结合”意指分子优先结合感兴趣的靶物或者以比针对其它分子更大的针对靶物的亲和力结合。例如，抗体会结合包含对其特异性的表位而非无关表位的分子。在一些实施方案中，亲和试剂可以是抗体，即对⑶34、⑶133等特异性的抗体。在一些实施方案中，亲和试剂可以是对⑶34、⑶133等特异性的受体或配体，例如对CD34、CD 133等特异性的肽配体和受体；效应分子和受体分子、T细胞受体，等等。在一些实施方案中，可以使用对感兴趣标志物特异性的多种亲和试剂。
[0099]可用作亲和试剂的抗体和T细胞受体可以是单克隆或多克隆的，并且可以通过转基因动物、免疫动物、永生化人或动物B细胞、用编码抗体或T细胞受体的DNA载体转染的细胞生成，等等。制备抗体及其用作特异性结合成员的适合性的详情是本领域技术人员公知的。特别感兴趣的是使用经标记的抗体作为亲和试剂。方便地，将这些抗体与标志物缀合，用于分离。标记物包括磁珠，其容许直接分离；生物素，其可以用与支持物结合的亲合素或链霉亲合素除去；荧光染料，其可以与荧光活化细胞分选仪一起使用；等等，以容许容易地分离特定细胞类型。可使用的荧光染料包括藻胆蛋白，例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白、荧光素和德克萨斯红(Texas red)。经常用不同荧光染料标记每种抗体，以容许每种标志物的独立分选。
[0100]使初始细胞群体与亲和试剂接触，并温育一段时间，以便足以结合可用的细胞表面抗原。温育通常至少约5分钟，且通常小于约60分钟。期望反应混合物中具有足够浓度的抗体，使得分离效率不受限于抗体的缺乏。适当的浓度通过滴度确定，但是通常将抗体稀释到细胞悬浮液体积中，所述稀释度约1:50(即，1份抗体与50份反应体积)、约1:100、约1:150、约1:200、约1:250、约1:500、约1:1000、约1:2000、或约1:5000。悬浮细胞的培养基会是维持细胞存活力的任何培养基。优选培养基是含有0.1至0.5%BSA或1-4%山羊血清的磷酸盐缓冲盐水。多种培养基是商品化的，并且可以依照细胞的性质使用，包括Dulbecco氏改良的Eagle培养基(dMEM)、Hank氏碱性盐溶液(HBSS)、Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(dPBS)、RPM1、Iscove氏培养基、具有5mM EDTA的PBS，等等，其经常补充有胎牛血清、BSA、HAS、山羊血清，等等。
[0101]通过任何方便的亲和分离技术选择接触群体中得到亲和试剂标记的细胞，例如如上文描述的或者本领域中已知的。分离后，可以在维持细胞存活力的任何合适培养基中收集分离的细胞，通常在收集管底部具有血清垫。多种培养基是商品化的，并且可以依照细胞的性质使用，包括dMEM、HBSS、dPBS、RPM1、Iscove氏培养基，等等，其经常补充有胎牛血清。
[0102]以此方式实现高度富集感兴趣细胞类型，例如造血细胞的组合物。细胞会占所述细胞组合物的约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或更多、占富集细胞组合物的约95%或更多，并且优选地，会占富集细胞组合物的约95%或更多。换言之，组合物会是感兴趣细胞的基本上纯的组合物。
[0103]可以立即移植要移植入人源化M-CSF小鼠中的细胞(它们是异质细胞群体或富集的细胞群体)。或者， 可以将细胞于液氮温度冷冻，并贮存较长的一段时间，其融化并能够再次使用。在此类情况中，通常会将细胞在10%DMS0、50%血清、40%缓冲培养基、或本领域中通常使用的一些其他此类溶液中冷冻以在此类冷冻温度保护细胞，并以本领域中通常已知的用于融化冷冻培养细胞的方式融化。另外/或者，可以在各种培养条件下在体外培养细胞。培养基可以是液体或半固体，例如含有琼脂、甲基纤维素等。可以将细胞群体方便地在合适的营养培养基，诸如Iscove氏改良的DMEM或RPM1-1640(其通常补充有胎牛血清(约5-10%)、L-谷氨酰胺、硫醇，特别是2-巯基乙醇、和抗生素，例如青霉素和链霉素)中悬浮。培养物可以含有细胞响应的生长因子。如本文中定义的，生长因子是能够经由对跨膜受体的特异性影响来促进培养物中或完整组织中细胞存活、生长和/或分化的分子。生长因子包括多肽和非多肽因子。
[0104]可以在移植到人源化M-CSF小鼠前将细胞遗传修饰，例如以提供选择或可追踪标志物，以诱导细胞中的遗传缺陷(例如用于疾病建模)，以修复遗传缺陷或在细胞中异位表达基因(例如，以测定此类修饰是否会影响疾病的过程)，等等。可以通过用合适的载体转染或转导、同源重组、或其它合适的技术将细胞遗传修饰，从而它们表达感兴趣的基因，或者用反义mRNA、siRNA或核酶遗传修饰以阻断不想要的基因表达。用于将核酸导入靶细胞中的多种技术是本领域中已知的。为了证明具有已经遗传修饰细胞，可以采用多种技术。将细胞的基因组限制性处理，并在扩增或不扩增的情况下使用。聚合酶链式反应；凝胶电泳；限制性分析；Southern、Northern、和Western印迹；测序等都可以采用。为了本申请中公开的这些和其它目的的分子和细胞生物化学中的一般方法可以参见标准教科书，诸如 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd Ed.(Sambrook等,Cold Spring Harbor Laboratory Press2001);Short Protocols in MolecularBiology, 4th Ed.(Ausubel et al.eds., John Wiley&Sonsl999);Protein Methods(Bollaget al., John Wiley&Sonsl996) ;Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner etal.eds., Academic Press 1999) ;Viral Vectors(Kaplift&Loewy eds., AcademicPressl995);Immunology Methods Manual(1.Lefkovits ed.，Academic Pressl997);andCell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sonsl998)，其公开内容通过提及并入本文。本公开内容中提及的用于遗传操作的试剂、克隆载体、和试剂盒可购自商业厂商诸如BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich,和 ClonTech0
[0105]可以通过任何方便的方法将细胞在人源化M-CSF小鼠中移植，所述方法包括例如肝内注射、尾静脉注射、眶后注射，等等。通常，移植约0.5x105-2xl06个多能细胞或祖细胞，例如约IxlO5-1xlO6个细胞，或约2xl05-5xl05个细胞。在一些例子中，在移植人细胞前将小鼠亚致死照射。换言之，将小鼠暴露于亚致死剂量的照射，例如如下文实施例部分中描述的及本领域中公知的。然后，将嫁接的人源化M-CSF小鼠在实验室动物资源管理条件下维持至少I周，例如I周 或更多，或两周或更多，有时4周或更多，且在一些例子中6周或更多，以容许具有嫁接细胞的免疫系统的充分重建。
[0106]如下文实施例部分中表明的，与已经为了此目的开发的其它小鼠品系和其它M-CSF转基因小鼠相比，人源化M-CSF小鼠表明显著升高的嫁接并维持人造血细胞的能力。例如，人胎儿肝衍生的造血干细胞和祖细胞(CD34+)至新生小鼠的肝内转移导致骨髓、脾、外周血、肺、肝和腹腔中人单核细胞/巨噬细胞的更有效分化和增强的频率。在16-20周时观察到相当大比例的人⑶14+⑶33+细胞。具体地，用造血细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠表明下列一项或多项，在一些例子中两项或更多项，在一些例子中，三项或更多项，在一些例子中四项或更多项，在一些例子中下列全部特征:它们以与野生型小鼠中的小鼠M-CSF表达相当的水平在骨髓、脾、血液、肝、脑、肺、睾丸和肾中表达人M-CSF ;展现出比不表达hM-CSF的嫁接小鼠中的h⑶14+⑶33+高2至6倍的脾h⑶14+⑶33+细胞频率；展现出比不表达hM-CSF的嫁接小鼠中的h⑶14+⑶33+高2至8倍的外周血h⑶14+⑶33+细胞频率；展现出约15%至约40%的血液中h⑶14+⑶33+单核细胞/巨噬细胞谱系细胞水平；在约20周龄时展现出约5%至约15%的血液中h⑶14+⑶33+单核细胞/巨噬细胞谱系细胞水平；展现出对LPS注射的响应，其比缺乏人M-CSF的小鼠在肝中的h⑶14+⑶33+细胞百分比方面大大约1.5至大约6倍；在LPS注射后约48小时展现出脾中增强的h⑶14+⑶33+h⑶45+细胞生成，其中所述增强超过缺乏hM-CSF的嫁接小鼠的约2至约5倍；展现出响应LPS的增强的血清人IL-6生成，其中LPS注射后约6小时的hIL-6水平比缺乏hM-CSF的嫁接小鼠增强约2至约5倍；在LPS刺激后展现出单核细胞和/或巨噬细胞的体外分泌，其比缺乏hM-CSF基因的嫁接小鼠在hTNF α方面高约2至3倍；在LPS刺激后展现出单核细胞和/或巨噬细胞的体外分泌，其比缺乏hM-CSF基因的嫁接小鼠在hIL-6方面高约2至4倍；在多聚1: C刺激后展现出单核细胞和/或巨噬细胞的体外分泌，其比缺乏hM-CSF基因的嫁接小鼠在hIFNa方面高约3至6倍；在多聚1: C刺激后展现出单核细胞和/或巨噬细胞的体外分泌，其比缺乏hM-CSF基因的嫁接小鼠在hIFNP方面高约2至3倍；与缺乏hM-CSF基因的经遗传修饰的且嫁接的小鼠相比展现出增强的吞噬；与缺乏hM-CSF基因的经遗传修饰的嫁接小鼠相比展现出增强的响应Mip3 β的体外趋化性；和展现出响应LPS刺激的共刺激分子的体外上调，其中所述共刺激分子选自人⑶40、人⑶80、人⑶86、人HLA-DR及其组合。
[0107]效用 [0108]人源化M-CSF小鼠和用人造血细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠，例如嫁接的Rag2v^IL2rgv^hM-CSF小鼠，和任选地其它遗传修饰可用于许多应用。例如，这些小鼠提供了可用于对人免疫性疾病和人病原体建模的系统。例如，本发明小鼠可用于对源自早期人造血细胞，例如人造血干细胞或祖细胞的人造血恶性建模。作为另一个例子，本发明小鼠可用于研究通常不感染小鼠的人病原体，例如病毒、真菌、和细菌。
[0109]通常不感染小鼠的人病原的一个此类例子是伤寒的成因物伤寒沙门氏菌。伤寒在全世界，主要在发展中国家困扰着超过2100万人，包括美国的约400例/年。伤寒已经用药物阿莫西林(amoxicillin)、氨节西林、头孢噻厢(cefotaxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢他卩定(ceftazidime)、氯霉素、环丙沙星(ciprofloxacin)、复方新诺明(co-trimoxazole)、尔他培南(ertapenem)、亚胺培南(imipenem)、氟喹诺酮类(fluoroquinolones)(例如环丙沙星(ciprofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、氧氟沙星ofloxacin)、链霉素、横胺嘧唳(sulfadiazine)、横胺甲噁唑(sulfamethoxazole)、四环素、及其组合治疗。复发感染是常见的，其限制通过抗生素疗法的疾病治理。此外，多药物抵抗在伤寒沙门氏菌感染的情况中也是流行的。
[0110]需要新治疗剂、新疫苗、和新的测试治疗剂和疫苗效力的方式。例如，能够受到伤寒沙门氏菌感染的小鼠可用于鉴定新的治疗剂和新的疫苗。例如，可以在此类小鼠中测试新的治疗剂和新的疫苗，例如通过测定响应推定的抗伤寒沙门氏菌剂治疗的小鼠中(在血液或给定组织中)伤寒沙门氏菌的量，或者通过用推定的疫苗接种小鼠，接着感染性施用伤寒沙门氏菌，并与没有用疫苗接种但用伤寒沙门氏菌感染的对照相比观察由于推定疫苗接种所致的任何感染情况变化来进行。
[0111]用人造血细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠，例如RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠可用于研究人病原体(即感染人的病原体)；人免疫系统对人病原体感染的响应；和药剂在提供保护免于和/或治疗人病原体感染中的效率。病原体可以是病毒、真菌、细菌等。病毒病原体的非限制性例子包括人或猪或禽流感病毒。细菌病原体的非限制性例子包括分枝杆菌，例如，结核分枝杆菌和肠杆菌，例如伤寒沙门氏菌。
[0112]例如，嫁接的人源化M-CSF小鼠可用作伤寒沙门氏菌感染的非人动物模型。比较而言，野生型小鼠和其它已知的免疫受损的小鼠(例如RAG1/RAG2基因敲除小鼠)不能被伤寒沙门氏菌感染。如上文讨论的，与不包含人M-CSF蛋白的嫁接小鼠相比，如本文中描述的嫁接人M-CSF小鼠展现出增强的人细胞嫁接。此增强足以维持产生的伤寒沙门氏菌感染，也就是说，伤寒沙门氏菌能够在小鼠中繁殖，即受感染的小鼠能够在其一个或多个细胞中含有并繁殖伤寒沙门氏菌。在一个具体的实施方案中，小鼠能够在伤寒沙门氏菌的初始引入或感染性暴露后至少一周、10天、2周、3周、或4周繁殖伤寒沙门氏菌。换言之，小鼠能够在其血液中或在至少一种组织中维持伤寒沙门氏菌滴度或水平至少一周、10天、2周、3周、或4周。用于用伤寒沙门氏菌感染小鼠及用于评估感染的方法的例子可以参见例如美国公开的申请N0.2011/0200982，其公开内容通过提及并入本文。
[0113]作为另一个例子，嫁接的人源化M-CSF小鼠，例如嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠可用作结核分枝杆菌感染的非人动物模型。包含编码人M-CSF蛋白的核酸的小鼠中的人造血细胞的增强嫁接足以维持产生的结核分枝杆菌感染，也就是说，结核分枝杆菌能够在小鼠中繁殖，即，感染小鼠能够在其一个或多个细胞中含有并繁殖结核分枝杆菌。在一些此类实施方案中，小鼠发动对人病原性分枝杆菌的抗分枝杆菌免疫应答，其中应答包括由人免疫细胞介导的肉芽肿形成，并且其包含人免疫细胞。在一些此类实施方案中，肉芽肿是肺肉芽肿。在一些此类实施方案中，肉芽肿是定义明确的肉芽肿。用于用结核分枝杆菌感染小鼠及用于评估感染的方法的例子可以参见美国公开的申请N0.2011/0200982，其公开内容通过提及并入本文。
[0114]不感染表达人M-CSF、且在一些例子中含一种或多种其它遗传修饰的小鼠(例如如本文中描述的)或者感染野生型小鼠的人病原体的其它例子会是本领域普通技术人员公知的，其中感染后的野生型小鼠不模仿人响应病原体发动的免疫应答。
[0115]病原体感染的此类小鼠模型可用于研究，例如以更好地了解人感染的进展。感染的此类小鼠模型也可用于药物研究，例如以鉴定提供保护免于感染的候选药剂或治疗感染的候选药剂。
[0116]用人造血细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠提供了有用的系统，其用于也对候选药剂筛选其它期望的体内活性，例如用于能够调控(即，促进或抑制)(例如在健康或患病状态下)造血细胞发育和/或活性，例如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞等的活性的药剂，例如以鉴定新的治疗剂和/或对免疫系统的发育和功能的分子基础做更好的了解；用于对造血细胞，例如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞等及其祖先有毒性的药剂；以及用于提供保护免于、减轻、或反转毒性制剂对造血细胞，例如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞等及其祖先等的毒性影响的药剂。作为又一个例子，本文中描述的经遗传修饰的小鼠提供了可用于预测个体对疾病疗法的响应性的系统，例如通过提供用于筛选个体免疫系统对药剂，例如治疗剂的响应性的体内平台，以预测个体对所述药剂的响应性进行。
[0117]在生物学活性剂的筛选测定法中，使已经用人造血细胞嫁接并且在一些例子中用人病原体感染的人源化M-CSF小鼠，例如RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠，或者要嫁接到人源化M-CSF小鼠中的细胞与感兴趣的候选药剂接触，并且通过监测一种或多种输出参数评估候选药剂的效应。通过本领域中公知的方法，这些输出参数可以反映细胞的存活力，例如造血细胞的总数目或特定造血细胞类型的细胞数目，或者反映细胞的凋亡状态，例如DNA片段化的量、细胞起泡的量、细胞表面上的磷脂酰丝氨酸量等。或者/另外，输出参数可以反映细胞的分化能力，例如分化细胞和分化细胞类型的比例。或者/另外，输出参数可以反映细胞的功能，例如，由细胞生成的细胞因子和趋化因子、细胞归巢及外渗到攻击位置的能力、细胞在体外或体内调控，即促进或抑制其它细胞活性的能力，等等。其它输出参数可以反映动物中病原体感染程度，例如小鼠中病原体的滴度、小鼠中的肉芽肿存在，等等。
[0118]参数是可量化细胞组分，特别是可以精确测量(期望在高通量系统中)测量的组分。参数可以是任何细胞组分或细胞产物，包括细胞表面决定子、受体、蛋白质或其构象或翻译后修饰、脂质、碳水化合物、有机或无机分子、核酸，例如mRNA、DNA等，或自此类细胞组分衍生的部分或其组合。虽然大多数参数会提供定量读数，在一些例子中，半定量或定性结果将是可接受的。读数可以包括单一测定数值，或者可以包括均值、中值数值或方差，等等。在特征上，会从许多相同测定法对每个参数获得参数读出数值的范围。变化性是预期的，并且会使用标准统计学方法及用于提供单一数值的常见统计学方法获得每组测试参数的数值范围。
[0119]用于筛选的感兴趣候选药剂包括已知的和未知的化合物，其涵盖许多化学类别、主要是有机分子(其可以包含有机金属分子)、无机分子、遗传序列、疫苗、怀疑具有抗生素特性的抗生素或其它药剂、肽、多肽、抗体、已经批准作为人用药物的药剂，等等。本发明的重要方面是评估候选药物，包括测试其毒性，等等。
[0120]候选药剂包括包含对于结构相互作用，特别是氢键键合必需的官能团的有机分子，并且通常至少包含胺、羰基、羟基或羧基基团，经常至少两个官能化学基团。候选药剂经常包含用一种或多种上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳香族或多芳香族结构。也从生物分子中寻找候选药剂，包括肽、多核苷酸、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。包括药理学活性药物、遗传活性分子，等等。感兴趣的化合物包括化学治疗剂、激素或激素拮抗剂，等等。适合于本发明的例示性药剂是那些记载于〃The Pharmacological Basis of Therapeutics，"Goodman and Gilman, McGraw-Hill, NewYork, N.Y.，(1996)，第9版的药剂。还包括毒素、和生物学和化学制剂，例如参见Somani，S.M.(编)，"Chemical Warfare Agents, "Academic Press, New York, 1992)。
[0121]用于筛选的感兴趣候选药剂还包括核酸，例如，编码siRNA、shRNA、反义分子、或miRNA的核酸，或者编码多肽的核酸。许多可用于将核酸转移到靶细胞中的载体是可用的。载体可以以附加体维持，例如，以质粒、微环DNA、病毒衍生载体诸如巨细胞病毒、腺病毒等维持，或者它们可以经由同源重组或随机整合，例如逆转录病毒衍生载体诸如MMLV，HIV-1，ALV等整合到靶细胞基因组中。可以对本发明细胞直接提供载体。换言之，使多能细胞与包含感兴趣核酸的载体接触，使得细胞吸收载体。
[0122]用于使细胞(例如培养物中的细胞或小鼠中的细胞)与核酸载体接触的方法，诸如电穿孔、氯化钙转染、和脂转染是本领域中公知的。或者，可以经由病毒对细胞提供感兴趣的核酸。换言之，使细胞与包含感兴趣核酸的病毒颗粒接触。逆转录病毒，例如慢病毒特别适合于本发明的方法。常用的逆转录病毒载体是“缺陷的”，即不能生成产生感染所需要的病毒蛋白质。取而代之，载体的复制需要在包装细胞系中生成。为了生成包含感兴趣核酸的病毒颗粒，通过包装细胞系将包含核酸的逆转录核酸包装到病毒壳体中。不同包装细胞系提供掺入壳体中的不同被膜蛋白质，此被膜蛋白质决定病毒颗粒对细胞的特异性。被膜蛋白质具有至少三种类型、同向性、兼向性和异向性。用同向性被膜蛋白质(例如MMLV)包装的逆转录病毒能够感染大多数鼠和大鼠细胞类型，并且通过使用同向性包装细胞系诸如B0SC23生成(Pear等(1993)P.N.A.S.90:8392-8396) ?携带兼向性被膜蛋白质(例如 4070A)的逆转录病毒(Danos等，见上文)能够感染大多数哺乳动物细胞类型，包括人、犬和小鼠，并且通过使用兼向性包装细胞系诸如PA12生成(Miller等(1985)Mol.Cell.Biol.5:431-437);PA317(Miller 等(1986)Mol.Cell.Biol.6:2895-2902);GRIP (Danos 等(1988)PNAS85:6460-6464)。除了鼠细胞外，用异向性被膜蛋白质(例如AKR env)包装的逆转录病毒能够感染大多数哺乳动物细胞类型。可以使用合适的包装细胞系来确保经过包装的病毒颗粒靶向感兴趣的细胞，在一些例子中，所述感兴趣的细胞为嫁接的细胞，在一些例子中，为宿主细胞，即人源化M-CSF。
[0123]用于对本发明细胞提供感兴趣核酸的载体通常包含适合于驱动感兴趣核酸的表达(即有转录活性)的启动子。这可以包括遍在起作用的启动子，例如CMV-b-肌动蛋白启动子、或诱导型启动子，诸如在特定细胞群中有活性或者响应药物诸如四环素存在的启动子。通过转录活化，意图在靶细胞中使转录在基础水平上升高至少约10倍、至少约100倍、更通常至少约1000倍。另外，用于对本发明细胞提供重编程序因子的载体可以包含后来必须例如使用重组酶系统诸如Cre/Lox除去的基因，或者表达它们且例如通过包含容许选择性毒性的基因诸如疱疹病毒TK，bcl-xs等破坏的细胞。
[0124]用于筛选的感兴趣候选药剂还包括多肽。任选地，此类多肽可以与提高产物溶解度的多肽域融合。该域可以经由限定的蛋白酶切割位点，例如TEV序列(其被TEV蛋白酶切割)与多肽连接。接头还可以包含一种或多种柔性序列，例如I至10个甘氨酸残基。在一些实施方案中，在维持产物溶解度的缓冲液中，例如在存在0.5至2M尿素的情况中、在存在提高溶解度的多肽和/或多核苷酸的情况中等等实施对融合蛋白的切割。感兴趣的域包括核内体溶解(endosomolytic)域，例如流感HA域；和有助于生成的其它多肽，例如IF2域、GST域、GRPE域，等等。另外/或者，可以配制此类多肽以实现改善的稳定性。例如，可以将肽进行PEG化，其中聚乙烯氧基基团在血流中提供增强的寿命。可以将多肽与另一种多肽融合以提供增加的功能性，例如以提高体内稳定性。一般地，此类融合配偶是稳定的血浆蛋白质，其在以融合物存在时可以例如延长多肽的体内血浆半衰期，特别是其中此类稳定的血浆蛋白质是免疫球蛋白恒定域。在稳定血浆蛋白质通常以多聚形式(例如，免疫球蛋白或脂蛋白)找到的大多 数情况中，其中相同或不同多肽链通常是二硫化物和/或非共价结合以形成装配的多链多肽，本文中含有多肽的融合物也会以与稳定的血浆蛋白质前体具有基本上相同结构的多聚体形式生成和利用。这些多聚体就它们包含的多肽剂而言是同质的，或者它们可以含有超过一种多肽剂。
[0125]候选多肽剂可以自真核细胞生成，或者可以由原核细胞生成。它可以通过解除折叠，例如热变性、DTT还原等进一步加工，并且可以使用本领域中公知的方法进一步再折叠。不改变一级序列的感兴趣修饰包括多肽的化学衍生化,例如酰化、乙酰化、羧基化、酰胺化，等等。还包括糖基化的修饰，例如那些通过在其合成和加工期间或者在进一步加工步骤中修饰多肽的糖基化方式作出的修饰；例如通过将多肽暴露于影响糖基化的酶，诸如哺乳动物糖基化或脱糖基化酶进行。还涵盖具有磷酸化氨基酸残基，例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、或磷酸苏氨酸的序列。已经可以使用通常的分子生物学技术和合成化学修饰多肽，从而改善其对蛋白水解降解的抗性或者以优化溶解度特性或者以使它们更适合作为治疗剂。此类多肽的类似物包括那些含有与天然存在的L-氨基酸不同的残基，例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸的那些类似物。可以用D氨基酸取代一些或全部氨基酸残基。
[0126]可以使用如本领域中已知的常规方法通过体外合成制备候选多肽剂。多种商业合成装置是可用的，例如，Applied Biosystems, Inc.，Beckman等的自动化合成仪。通过使用合成仪，可以用非天然氨基酸取代天然存在的氨基酸。特定序列和制备方式会根据便利、经济、需要的纯度等确定。或者，可以依照重组合成的常规方法分离并纯化候选多肽剂。可以制备表达宿主的裂解物，并使用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲和层析、或其它纯化技术纯化裂解物。通常，相对于与制备产物及其纯化方法相关的污染物，使用的组合物会包含至少20% (按重量)的期望产物，更通常至少约75% (按重量)，优选地至少约95% (按重量)，并且出于治疗目的，通常至少约99.5%(按重量)。通常，百分比是基于总蛋白质的百分比。
[0127]在一些情况中，要筛选的候选多肽剂是抗体。术语“抗体”或“抗体模块”意图包括含适合和识别表位的特定形状的分子结构的任何多肽链，其中一种或多种非共价结合相互作用稳定所述分子结构和表位之间的复合物。给定结构和其特定表位的特异性或选择性配合有时称为“锁匙”配合。原型抗体分子是免疫球蛋白，并且认为来自所有来源，例如人、啮齿类、兔、牛、山羊、猪、犬、其它哺乳动物、鸡、其它禽类等的所有类型的免疫球蛋白，即IgG, IgM, IgA, IgE, IgD等是“抗体”。本发明中利用的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。抗体通常在培养细胞的培养基中提供。
[0128]可以从极其多种来源，包括合成的或天然的化合物的文库获得候选药剂。例如，许多手段可用于随机和定向合成极其多种有机化合物，包括生物分子，包括表达随机化的寡核苷酸和寡肽。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式中的天然化合物文库是可用的或者是容易制备的。另外，天然的或合成生成的文库和化合物容易经由常规化学、物理和生物化学手段修饰，并且可以用于生成组合文库。将已知的药理学药剂进行定向或随机化学修饰，诸如酰化、乙酰化、酯化、酰胺化等，以生成结构类似物。
[0129]对候选药剂筛选生物学活性，其通过对至少一种且通常多种样品，有时以及缺乏所述药剂的样品施用所述药剂进行。测量响应药剂的参数变化，并且通过与例如在存在和缺乏所述药剂的情况中用其它药剂获得的参照培养物比较评估结果，等等。在实施筛选以鉴定会防止、减轻或反转毒性制剂效应的候选药剂的情况中，通常在存在毒性制剂的情况中实施筛选，其中在最适合于测定结果的时间添加毒性制剂。例如，在测试候选药剂的保护/预防能力的情况中，可 以在毒性制剂前、与候选药剂同时、或在用候选药剂处理后添加候选药剂。作为另一个例子，在测试候选药剂反转毒性制剂效应的能力的情况中，可以在用候选药剂处理后添加候选药剂。如上文提及的，在一些例子中，样品是已经用细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠，即对已经用细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠提供候选药剂。在一些例子中，样品是要嫁接的细胞，即，在移植前对细胞提供候选药剂。
[0130]若要对小鼠直接施用候选药剂，则可以通过本领域中用于对小鼠施用肽、小分子和核酸的多种公知方法施用药剂。例如，可以口服、粘膜、表面、皮内施用、或者通过注射，例如腹膜内、皮下、肌肉内、静脉内、或颅内注射等等施用药剂。药剂可以在缓冲液中施用，或者可以例如通过与合适的药学可接受媒介物组合将其掺入多种配制剂中。“药学可接受媒介物”可以是得到联邦或州政府管理局批准或者美国药典或其它公认的药典中列出用于哺乳动物诸如人的媒介物。术语“媒介物”指配制本发明的化合物以对哺乳动物施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类药用媒介物可以是脂质，例如脂质体，例如脂质体树状聚体(dendrimer);液体,诸如水和油(包括来源于石油、动物、植物的那些或合成起源的，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)、盐水；阿拉伯树胶(gum acacia)、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、硅胶、尿素，等等。另外，可以使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。可以将药物组合物配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊、粉末、颗粒剂、软膏剂、溶液、栓剂、注射液、吸入剂、凝胶、微球、和气溶胶。药剂在施用后可以遍布全身或者可以通过局部施用、壁内施用、或者通过使用在植入部位处保持活性的植入物来实现局部化。活性剂可以配制为立即实现活性的制剂或者可以配制成实现持续释放的制剂。在一些情况下，特别是对于中枢神经系统，有必要配制药剂以穿过血脑屏障(BBB)。一种用于将药物投递通过血脑屏障(BBB)的策略需要破坏BBB，其通过渗透手段诸如甘露醇或白三烯，或者通过使用血管活性物质诸如缓激肽通过生物化学方法实现。在通过血管内注射施用组合物时可以与药剂共施用BBB破坏剂。其它经历BBB的策略可以需要使用内源转运系统，包括窖蛋白-1介导的胞转、载体介导的转运蛋白诸如葡萄糖和氨基酸载体、受体介导的胞转(对于胰岛素或转铁蛋白)、和主动流出转运蛋白诸如P-糖蛋白。主动转运模块也可以与本发明中使用的治疗性化合物缀合以促进通过血管的内皮壁转运。或者，在BBB后的药物投递可以通过局部投递，例如通过鞘内投递，例如经由奥马耶(0_aya)贮器(参见例如美国专利N0.5，222，982和5385582，其通过提及并入本文)；通过例如玻璃体内或颅内推注，例如通过注射器；通过连续输注，例如通过套管插入术，例如用对流进行(参见例如美国申请N0.20070254842，其通过提及并入本文)；或者通过植入可逆附加药剂的装置(参见例如美国申请Nos.20080081064and20090196903，其通过提及并入本文)进行。
[0131]若在移植前对细胞提供药剂，则可以以溶液或容易溶解的形式方便地将药剂添加到培养的细胞培养基。可以将药剂在流过系统中以间断流或连续流添加，或者备选地，将化合物单一或增量添加到静态溶液。在流过系统中，使用两种流体，其中一种是生理学中性溶液，而另一种是与添加的测试化合物相同的溶液。将第一流体在池上通过，接着是第二流体。在单一溶液方法中，将测试化合物添加到细胞周围的培养基中。培养基组分的总体浓度不应随所述化合物添加或者在所述流过方法的两种溶液间显著变化。
[0132]可以用不同药剂浓度平行运行多个测定法以获得对各种浓度的差别响应。如本领域中已知的，确定药剂的有效浓度通常使用源自1:10、或其它对数标度稀释的浓度范围。在必要时，可以用后续的连续稀释进一步细化浓度。通常，这些浓度之一充当阴性对照，即处于零浓度或低于药剂的检测水平或者处于或低于不给出表型的可检测变化的药剂浓度。
[0133]可以在用药剂处理后的任何时间实施对人源化M-CSF小鼠细胞对候选药剂的响应分析。例如，在与候选药剂接触后1、2、或3天，有时4、5、或6天，有时8、9、或10天，有时14天，有时21天，有时28天，有时I个月或更长时间，例如2个月、4个月、6个月或更长时间分析细胞。在一些实施方案中，所述分析包括在多个时间点分析。用于分析的时间点的选择基于要实施的分析的类型，如普通技术人员容易理解的那样。
[0134]所述分析可以包括测量本文描述或本领域已知用于测量细胞存活力、细胞增殖、细胞身份、细胞形态学、和细胞功能的任何参数，特别是它们涉及免疫细胞时。例如，可以使用流式细胞术来测定造血细胞的总数或特定造血细胞类型的细胞数目。可以实施组织化学或免疫组织化学以测定细胞的凋亡状态，例如测量DNA片段化的末端脱氧核苷酸基转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)、或检测膜联蛋白V对细胞表面磷脂酰丝氨酸结合的免疫组织化学。也可以采用流式细胞术以评估分化细胞和分化细胞类型的比例，例如以测定造血细胞在存在药剂情况下分化的能力。可以实施ELISA、Western、和Northern印迹以测定嫁接人源化M-CSF小鼠中表达的细胞因子、趋化因子、免疫球蛋白等的水平，例如以评估嫁接细胞的功能。也可以实施测试免疫细胞功能的体内测定法以及与感兴趣的特定疾病或病症诸如糖尿病、自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、AMD等相关的测定法。参见例如Current Protocols in Immunology(Richard Coico, ed.John ffiley&Sons, Inc.2012)andImmunology Methods Manual (1.Lefkovits 编，Academic Pressl997),其公开内容通过提及并入本文。
[0135]因此，例如，提供了用于测定药剂对人病原体的影响的方法，其包括将嫁接的人源化M-CSF小鼠，例如嫁接的RagZ+II^rg+hM-CSF小鼠暴露于有效量的人病原体，病原体的有效量是在小鼠中产生感染需要的病原体量；容许病原体感染小鼠；在存在药剂的情况下随时间测量感染参数；并比较所述测量值与来自未暴露于药剂的嫁接人源化M-CSF小鼠的测量值。若药剂在单一施用或在选择的时间段里两次或更多次施用后，小鼠血液或组织中病原的量降低至少一半，则所述药剂被确定为抗病原性药剂，例如抗伤寒沙门氏菌剂。
[0136] 作为另一个例子，提供了测定用于感兴趣的病原体分离群或株是否有药物抗性(例如多药物抗性)的方法。在这些方法中，将嫁接的人源化M-CSF小鼠，例如嫁接的Rag2v-1L2rgv-hM-CSF小鼠暴露于有效量的感兴趣人病原体分离群或株，病原体的有效量是在小鼠中产生感染需要的病原体量；容许病原体感染小鼠；在存在药物的情况下测量感染参数，例如小鼠血液或组织中感兴趣的分离群或株的滴度、感兴趣分离群或株维持小鼠中感染的能力，或者感兴趣分离群或株在施用药物后某个时间点在小鼠中繁殖的能力；以及比较所述测量值与来自未暴露于所述药剂的用病原体感染的嫁接人源化M-CSF小鼠的测量值。感兴趣药物的例子包括阿莫西林、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、复方新诺明、尔他培南、亚胺培南、氟喹诺酮类(例如环丙沙星、加替沙星、氧氟沙星、链霉素、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、四环素、及其组合。在一个具体的实施方案中，药物或药物组合的施用在暴露于产生感染的感兴趣分离群或株后持续至少I周、10天、2周、3周、或4周。
[0137]本文中还提供了本发明小鼠的使用的其它例子。在阅读本公开内容后，本公开内容中描述的经遗传修饰的嫁接小鼠的其它应用对于本领域技术人员会是显而易见的。
[0138]试剂、装置和试剂盒
[0139]本发明还提供了用于实施上文描述的一种或多种方法的试剂、装置和其试剂盒。本发明的试剂、装置和其试剂盒可以有极大变化。
[0140]在一些实施方案中，试剂或试剂盒包含在本发明所描述方法中使用的一种或多种药剂。例如，试剂盒可以包含人源化M-CSF小鼠。试剂盒可以包含用于养育人源化M-CSF小鼠的试剂，例如引物和在一些例子中，用于对人源化M-CSF小鼠确定基因型的试剂。试剂盒可以包含用于移植到人源化M-CSF小鼠中的人造血细胞或人造血祖细胞的富集群体，或用于从人制备造血细胞群体或造血细胞的富集群体以移植到人源化M-CSF小鼠中的试剂。其它试剂可以包括用于例如在存在/缺乏候选药剂，例如对由不同类型的造血细胞表达的标志物特异性的一种或多种抗体的情况下测定造血细胞存活力和/或功能的试剂，或用于检测特定细胞因子、趋化因子等的试剂。其它试剂可以包括培养基、培养物上清液、基质组合物等。
[0141]除上述组分外，本发明的试剂盒还进一步包含用于实施本方法的说明书。这些说明书可以以一种或多种形式一份或多份存在于本试剂盒中。这些说明书可以存在的一种形式是作为合适介质或基片，例如印刷信息的一片或多片纸上、在试剂盒的包装中、在包装插页等中的印刷信息。又一种手段是已经记录信息的计算机可读介质，例如磁盘、CD等。可以存在的又一种手段是网站地址，其可以经由因特网使用以在取出位置获取信息。任何方便的手段可以存在于试剂盒中。
实施例
[0142]提出以下实施例以给本领域普通技术人员提供如何实施和使用本发明的完整公开内容和描述，而并不意图限制发明人视为其发明的范围，它们也不意图代表下述实验是实施本发明的所有或唯一实验。已经努力确保使用数字(例如量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份是重量份，分子量是重量平均分子量，温度以摄氏度计，而压力为或接近大气压。
[0143]集落刺激因子-1 (CSF-1)或巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)是发现促进造血的早期细胞因子之一。在造血系统中，认为M-CSF对髓样祖先特异性起作用，从共同髓样祖先(CMP)阶段开始，促成CMP分化成单核细胞/巨噬细胞谱系(Sherr，C.J.等(1988)Macrophage colony-stimulating factor, CSF-1, and its proto-oncogene-encodedreceptor, Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.53Ptl:521-530)。 另 ^hM-CSF 对于巨噬细胞的存活、粘着、和运动是必要的(Pixley，F.J.，and Stanley, E.R.(2004)CSF-1regulation of the wandering macrophage:complexity in action, Trends CellBiol.14:628-638;Socolovsky, M.等(1998)Cytokines in hematopoiesis: specificityand redundancy in receptor function, Adv.Protein Chem.52:141-198;Stanley,E.R.等(1997)Biology and action of colony—stimulating factor-1, Mol.Reprod.Dev.1997;46:4-10)。与其在髓样分化中的关键作用不同，M-CSF对于破骨细胞的分化、对于雌性生殖道细胞的分化、存活和增殖、以及对于胎盘的形成是至关重要的(Pixley等(2004) ; Socolovsky 等(1998) ; Stanley 等(1997))。M-CSF 由多种细胞生成，包括成纤维细胞、骨髓(BM)基质细胞、活化的T细胞和巨噬细胞、和分泌性上皮细胞。M-CSF经由M-CSF受体(Fms; CDl 15)发信号，并且其受体被M-CSF连接导致Fms的酪氨酸磷酸化及随后几种宿主细胞蛋白诸如Grb2, She, Sosl和p85的磷酸化(Pixley等(2004);Stanley 等(1997);Rohrschneider, L.R.等(1997)Growth and differentiationsignals regulated by the M-CSF receptor, Mol.Reprod.Dev.46:96-103;Yeung, Y.G.and Stanley,E.R.(2003)Proteomic approaches to the analysis of earlyevents in colony-stimulating factor-lsignal transduction, Mol.Cell.Proteomics2:1143-1155)。
[0144]发明人假设人源化小鼠中缺陷性人髓样分化可能是由于缺乏促进髓样分化的特定信号所致。为了确认这点，发明人工程化改造了新一代人源化小鼠以从合适的组织以生理学水平分泌人M-CSF。对这些人源化M-CSF小鼠的定性和定量分析揭示了人M-CSF的正常表达。对用人CD34+细胞嫁接的人源化M-CSF小鼠的分析指示各种组织中提升的人单核细胞/巨噬细胞频率。此外，从这些小鼠获得的人单核细胞/巨噬细胞展现出增强的功能特性。
[0145]本文中描述的人源化M-CSF小鼠显示提升的人髓样细胞频率和功能。将人M-CSF插入重组活化基因2 (Rag2; Genbank登录号1.NM_009020.3)和Y链U C，又称为“白介素2 受体，Y 链”或 IL2RG;Genbank 登录号 1.NM_013563.3)方面缺陷的 Balb/c 小鼠(Balb/c Rag2+ Y cv mice)的小鼠M-CSF基因座中定性和定量导致这些小鼠中人M-CSF的忠实表达。人源化M-CSF(M-CSFivh)新生幼犬中人胎儿肝衍生的造血干细胞和祖细胞(⑶34+)的肝内转移导致骨髓、脾、和外周血中人单核细胞/巨噬细胞的更有效分化和增强的频率。另外，M-CSFh7h小鼠展现出即使在移植20周后支持单核细胞/巨噬细胞分化的持续能力。此外，与未修饰的对照小鼠不一样，M-CSFivh小鼠在多个组织中，包括肝和肺内含有残留的人单核细胞/巨噬细胞。从人源化M-CSF小鼠获得的人单核细胞/巨噬细胞还显示提升的功能特性，诸如迁移、吞噬、活化和对LPS的响应。
[0146]实施例1:细胞制备物、分析方法、和测定法
[0147]CD34+细胞分离和移植。在 Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY 从人胎儿肝组织保藏所及从Advance Biosciences Resources, Inc.，Alameda, CA获得人胎儿肝样品。在Yale Human Investigations Committee的批准下实施涉及人组织的所有实验。
[0148]为了分离人CD34+细胞，将胎儿肝组织用PBS漂洗一次，并切成小块，用胶原酶D(100ng/mL)于37°C处理45分钟。制备单细胞悬浮液，并使用密度梯度离心(淋巴细胞分离介质，MP biomedicals)分离单个核细胞。用抗人CD34微珠处理细胞后，接着用MACS?技术(Miltenyi Biotech)分离 CD34+细胞。
[0149]对于移植，相隔4小时用两个分开剂量(2xl50cGy)亚致死照射新生幼犬(出生的第 I 天)，并使用 22 号针(Hamilton Company, Reno, NV)将 20uL PBS 中的 IxlO5 至 2xl05 个纯化的人⑶34+细胞注射到肝中。
[0150]间充质基质细胞(MSC)分离和培养。分离小鼠的长骨，并将BM细胞冲出。将骨切成块，并用胶原酶D和P (25ng/mL)的混合物于37°C消化45分钟。将悬浮细胞分离，并在存在MSC培养基(Stem C ell Technologies)的情况下铺板。培养2周后，将CD45-Scal+CD90+细胞分离并培养。
[0151]抗体和流式细胞术。通过流式细胞术分别使用FACS Calibur或LSRII和CELLQUEST? 软件、FACS DIVA? 软件(BD Biosciences, San Jose, CA)或 FL0WJ0? 软件(Tree Star, Inc.，Ashland, OR)分析单细胞悬浮液。使用FACS ARIA?细胞分选仪(BDBiosciences, San Jose, CA)实施限定亚群的细胞分选。
[0152]研究中使用以下人抗体:CDllb,CD14, CD33, CD34, CD38, CD40, CD45, CD80, CD86, CD90 和 HLA-DR。
[0153]本研究中使用以下小鼠抗体:CDllb,CD40, CD45, CD80, CD86, F4/80, Grl, H2Kd 和IAd。
[0154]细胞培养。对于鼠巨噬细胞分化，将BM细胞在存在具有10%FCS和必要补充物(2mML-谷氨酰胺，1%青霉素-链霉素和ImM非必要氨基酸)的DMEM的情况下在6孔板中分配。将细胞用重组鼠M-CSF(10ng/mL)或重组人M-CSF (10ng/mL)处理7天。每三天除去细胞培养上清液，并用新鲜培养基和细胞因子更换培养物。
[0155]对于人巨噬细胞研究，诸如活化、吞噬和迁移，将脾的2xl05个⑶45+CD14+CD33+细胞分选，并在具有15%人AB血清和必要补充物(2mM L-谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和ImM非必要氨基酸)的DMEM在体外培养。
[0156]活化、吞噬和迁移测定法。对于体内LPS刺激，给小鼠1.P.注射LPS(100ng/g体重)。对于体外LPS刺激，将LPS(10ng/mL)添加至细胞，并培养I或2天。对于多聚1:C体外刺激，在存在多聚1:C(10ug/mL)的情况下将细胞培养6或12小时。
[0157]使用商品化VYBRANT?吞曬测定试剂盒(Invitrogen)依照制造商的说明书实施吞噬测定法。
[0158]使用商品化QCM?趋化性细胞迁移测定试剂盒(Millipore)依照制造商的说明书实施迁移测定法。
[0159]RNA提取和实时PCR。使用商品化试剂盒系统(RNEASY?微型试剂盒，Qiagen)分离总RNA。使用寡聚物dT引物和扩充逆转录酶(Roche)合成cDNA。使用7500实时PCR系统和Power SYBR?Green PCR主混合物(Applied Biosystems)依照制造商的说明书使用以下基因特异性引物对一式两份实施PCR反应:人CSFl (有义:5' -TACTGTAGCCACATGATTGGGA-3'(SEQ ID N0:1)和反义:5' -CCTGTGTCAGTCAAAGGAAC-3' (SEQ ID NO:2)),小鼠csfl(有义:5' -CGACATGGCTGGGCTCCC-3' (SEQ ID NO:3)和反义:5' -CGCATGGTCTCATCTATTAT-3'(SEQ ID NO:4)，人IFNa(有义:5' -GTACTGCAGAATCTCTCCTTTCTCCTG-3' (SEQ ID NO:5)和反义:5' -GTGTCTAGATCTGACAACCTCCCAGGCACA-3' (SEQ ID NO: 6)),人 IFNb (有义:5'-TTGTGCTTCTCCACTACAGC-3' (SEQ ID NO: 7)和反义:5' -CTGTAAGTCTGTTAATGAAG-3' (SEQ ID NO:8))，小鼠 hprt 引物(有义:5/ -AAGGACCTCTCGAAGTGTTGGATA(SEQ ID NO:9)和反义:5' -CATTTAAAAGGAACTGTTGACAACG-3' (SEQ ID NO: 10))和人 HPRT 引物(有义:5'-CTTCCTCCTCCTGAGGAGTC-3' (SEQ ID NO: 11)和反义:5' -CCTGACCMGGAMGCMAG-3' (SEQ ID NO: 12)) ο对于正常的PCR，使用商品化试剂盒(DNEASY?血液和组织试剂盒，Qiagen)提取靶细胞的DNA，并使用基因特异性引物对实施PCR分析。
[0160]ELISA。对于细胞因子量化研究，将血液血清或细胞培养物上清液收集，并使用商品化人IL6和人TNF ELISA试剂盒(Ray Biotech, Inc., GA)依照制造商的说明书进行ELISA。
[0161]组织学。将实体组织在4%PFA中固定。将固定的组织在石蜡(BlueRiBbon; Surgipath Medical Industries)中包埋。将块切成切片，并将 5_ μ m 切片用 H&E染料染色，接着通过常规方法放置盖玻片。将切片在没有任何介质的情况下维持。于室温用Zeiss Axio成像仪.Al显微镜(具有2X和IOX物镜)、AxioCam MRc5照相机、和AxioVision4.7.1成像软件(Carl Zeiss Microimaging LLC)记录数字光显微镜图像。
[0162]统计学分析。数据以均值土SEM呈现。使用2侧Student t检验评估统计学显著性。认为P值>0.05是非显著的，而P值〈0.05以*表示。
[0163]实施例2:用于嫁接的经遗传修饰的小鼠
[0164]人M-CSF敲入策略。使用VELOCIGENE?.技术构建用于在单一靶向步骤中用人M-CSF核酸序列(VELOCIGENE?等位基因标识号5093)替换小鼠M-CSF核酸序列的革巴向构建体，如先前描述的(Valenzuela等(2003)High-throughput engineeringof the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat.Biotechnol.21:652-659)。分别自细菌人工染色体(BAC) RPC1-23、克隆 373B18 及自 BACRPC1-11、克隆101M23获得小鼠和人M-CSF DNA。简言之，将通过缺口修复克隆生成的线性化靶向构建体电穿孔到RAG2+/_ Y c+小鼠胚胎干(ES)细胞(其从商品化V17ES细胞系(BALB/c X129F1)生成)，所述线性化靶向构建体含有在从外显子2延伸到非编码外显子9下游633nt的17.5kb人M-CSF序列侧翼的小鼠M-CSF上游和下游同源性臂和flox化的(floxed)药物选择盒。用2种TaqMan qPCR测定法的等位基因缺失筛选鉴定携带M-CSF基因的杂合缺失的小鼠ES细胞，所述TaqMan qPCR测定法识别小鼠Csfl基因的内含子2 (TUF 引物，5' -CCAGGAATGTCCACTATGGATTC-3' (SEQ ID NO: 13) ; TUP探针，5' ACTGCTCCTTGACCCTGCTCTGACTCA-3' (SEQIDNO=H)JUI^WtS' -TGGGCTGACTTCCCAAAGG-3' (SEQID NO: 15))及 3'侧翼序列中(TDF 引物，5' -TTAGGTGCTAGTAGGCTGGAAAGTG-3' (SEQ IDNO: 16) ; TDP 探针，5' -TGCAATCGCAGCTTCTCTCCTTACTAGGCT-3 (SEQ ID NO: 17) ' ; TDR 引物,5' -AATAGGAAGAACGAACAGGTCTAATACC-3' (SEQ ID NO: 18))的序列。通过等位基因获得TaqMan测定法确认用人CSFl基因同时替换小鼠基因，所述等位基因获得TaqMan测定法检测CSFl的内含子2中一个拷贝的序列(正向引物，5' -GCTGCTTGCCTGGGTTAGTG-3' (SEQID NO: 19);探针，5' -TGCCCAGGAACATCAACCACTGATTCTG-3' (SEQ ID NO:20);反向引物，5' -GAGGGACAGCAGACCTCAGAAG-3' (SEQ ID NO:21))和一个拷贝的新霉素抗性(neor)盒(正向引物，5' -GGTGGAGAGGCTATTCGGC-3' (SEQ ID NO: 22);探针，5' -TGGGCACAACAGACAATCGGCTG-3' (SEQ ID NO:23);反向引物，5' -GAACACGGCGGCATCAG-3' (SEQ ID NO:24);参见图8。识别CSFl序列的qPCR测定法没有从小鼠基因组扩增DNA。使用相同的测定法来确认自靶定ES细胞衍生的小鼠的基因型。用nec/ TaqMan测定法确认Cre介导的药物选择盒切除。所有引物-探针组由Biosearch Technologies提供。用6_羧基-突光素(FAM)在其Y端和BHQ-1在其:V端标记探针。
[0165 ]用瞬时Cre表达载体进一步电穿孔正确祀定的ES细胞以除去药物选择盒。通过VELOCSMOUSri法(Poueymirou等(2007))将没有药物盒的靶定ES细胞克隆导入8细胞阶段小鼠胚胎中。通过小鼠等位基因缺失和人等位基因获得的基因型分型，使用改良的等位基因测定法(Valenzuela等(2003))鉴定携带人源化M-CSF基因(VG5093)的VCLOCIMICB^ (完全自供体ES细胞衍生的FO小鼠)。
[0166]小鼠维持。将Balb/c-Rag2^ y c^M-CSFm/m,Balb/c-Rag2^ y d_CSFh/ni 和 Balb/c-Rag2-7- y c-^-CSFh/h小鼠在无特定病原体条件下在耶鲁大学动物护理房中保持。所有小鼠实验得到耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准。
[0167]生成人源化M-CSF小鼠。为了确认小鼠中人M-CSF的生理学表达是否导致人源化小鼠中人巨噬细胞分化改善，将Balb/c Rag2+ y z+小鼠工程化为表达人M-CSF。具有Rag2+Y c+缺陷的Balb/c品系充当用于研究小鼠中人免疫系统的成功模型系统(Traggiai E等(2004)Development of a human adaptive immune system in cord bloodcell-transplanted mice, Science304:104-107)。为了避开这些小鼠中人 M-CSF 的超生理学表达，采用将小鼠M-CSF编码序列用人对应物替换的策略。使用VEL.0CTGENE?.技术构建用于在单一靶向步骤中用人M-CSF编码序列(VELOCIGENE?等位基因标识号5093)替换大部分M-CSF可读框的构建体(图8)，如先前描述的(Valenzuela等(2003))。值得注意的是，在此载体中保留小鼠的启动子和其它调节元件(诸如5’UTR)。将线性化靶向载体电穿孔到Balb/c 11291^2+^(3+胚胎干细胞中。用瞬时Cre表达载体进一步电穿孔正确靶向的ES细胞以除去药物选择盒。通过VELOCIMOUSn.11.法(Poueymirou等(2007))将没有药物盒的靶定ES细胞克隆导入8细胞阶段小鼠胚胎中。通过小鼠等位基因丧失和人等位基因获得的基因型分型，使用改良的等位基因测定法(Valenzuela等(2003))鉴定携带人源化M-CSF基因(VG5093)的VHLOUMICE? (完全自供体ES细胞衍生的H)小鼠)。经由后代的序贯互交，生成具有小鼠和人M-CSF (M-CSFm7h;杂合敲入)和仅人M-CSF (M-CSFh7h;纯合敲入)的Balb/c Rag2^ y z+小鼠嵌合小鼠和种系传送小鼠(germline transmitted mice)。
[0168]人源化M-CSF小鼠的表征。评估人源化M-CSF小鼠中人M-CSF的表达。将来自M-CSFm7m或M-CSFivh小鼠的器官收获，并使用物种特异性引物分析鼠和人M-CSF mRNA表达。如图1A和IB中显示的，M-CSF在大多数分析器官，包括BM、脾、血液、肝、脑、肺、睾丸和肾中表达。然而，胸腺和皮肤没有显示检测到的M-CSF表达。值得注意的是，小鼠和人M-CSF的表达方式在M-CSFm/m和M-CSFivh小鼠之间是相当的。接着，量化小鼠和人M-CSF在M_CSFm/m、M-CSFm/h、和M-CSFivh小鼠中的表达水平。将骨髓间充质基质细胞(MSC)分离，并使用实时PCR量化M-CSF mRNA的表达水平(图1C)，并使用ELISA量化M-CSF蛋白(分泌性)(图1D)。M-CSFdiai小鼠仅表达小鼠M-CSF，M-CSFm7h小鼠表达小鼠和人M-CSF两者，而M-CSFh7h小鼠仅表达人M-CSF。人M-CSF的表达水平与小鼠M-CSF相当。与这些数据一致，对血清中CSF-1的分析揭示m/m，h/m,和h/h小鼠中相当的CSF-1蛋白表达水平(图1E)。半合子没有导致降低的基因和蛋白质表达水平，指示基因剂量水平对于此细胞因子似乎不是限制性的。
[0169]为了调查用人M-CSF替换小鼠M-CSF是否导致不利影响，尤其是对骨和造血，在多个龄分析M-CSFivh小鼠。早期研究已经证明具有缺陷性M-CSF信号传导的小鼠(Csf l°p/°p和Csflr+)显不出牙失败和骨缺陷(Dai, X.Μ.等(2002) Targeted disruption of the mousecolony-stimulating f actorlreceptor gene results in osteopetrosis, mononuclearphagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, andreproductive defects, Blood99:111-120;Felix，R.等(1990)Macrophage colonystimulating factor restores in vivo bone resorption in the op/op osteopetroticmouse, Endocrinology127:2592-2594;Wiktor-JedrzejczakjW.等(1990)Total absenceof colony-stimulating factorlin the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op)mouse, Proc.Natl Acad.Sc1.USA87:4828-4832;YoshidajH.等(1990)The murinemutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colonystimulating factor gene，Nature345:442-444)。比较而言，M-CSFh7h 小鼠揭不了正常的牙齿和骨特性。此外，与Csfl°p/°p和Csflr+小鼠不一样，BM的总细胞含量(图2A)、BM、脾(SP)和外周血(PB)中的髓样细胞频率(图2B)及BM和SP中的巨噬细胞频率(图2C)在M-CSFm7m,M-CSFh7m和M-CSFivh小鼠之间是相当的。与此观察结果一致，HSC区室(包括长期HSC、短期HSC和多能祖先)和髓样祖先区室(包括共同的髓样祖先、粒细胞单核细胞祖先和巨核细胞红细胞祖先)的频率在M-CSFn^M-CSFh7m and M_CSFh/h小鼠间是相当的(图9)。
[0170]关于M-CSFh7h小鼠中正常造血和骨发育的可能解释可以是人M-CSF与小鼠细胞是交叉反应性的。为了确认这点，将来自M-CSFm/m的总BM细胞分离，并在存在重组鼠M-CSF或重组人M-CSF的情况中培养。在缺乏细胞因子情况中培养的BM细胞不能存活，而在存在人或小鼠M-CSF情况中培养的细胞显示相当的体外分化水平(图2D)。对这些体外分化的巨噬细胞分析共刺激分子和MHC的表达指示在存在人或小鼠M-CSF的情况中这些分子的相当水平(图2E)。与我们的发现一致，先前的研究证明人M-CSF在小鼠靶细胞中有活性，而小鼠M-CSF与人细胞不是交叉反应性的(Sieff, C.A.(1987) Hematopoietic growth factors, J.Clin.1nvest.79:1549-1557)。
[0171]实施例3:人源化M-CSF小鼠中人单核细胞/巨噬细胞的分化
[0172]为了评估M-CSF人源化的影B向，给亚致死照射的新生Rag2+ Y c+M-CSF1^m, Rag2+ y c+M-CSF1^ 和 Rag2+ y CvIFCSFh7h 幼犬在肝内(1.h)移植约 2xl05 个纯化的人胎儿肝CD34+细胞。然后，在移植后8周时将接受体放血以确认供体起源的细胞(基于人⑶45表达)。移植后12周，将接受体处死，并收获其BM、SP和PB。分析揭示与M_CSFm/m小鼠相比，M-CSFh7ni和M-CSFh7h小鼠两者的BM、SP和PB中CD14+CD33+单核细胞/巨噬细胞谱系细胞的相对和绝对频率的提升(图3A-C)。虽然M-CSFh7m小鼠展现出升高的⑶14+⑶33+细胞频率，但是⑶14+⑶33+细胞的最大频率存在于M-CSFh7h小鼠中。令人讶地，在此增加外，CD14-CD33+细胞频率在M-CSFivni和M_CSFh/h小鼠的BM、SP和PB中也是增加的(图3A)。 [0173]为了分析人M-CSF敲入小鼠是否支持持续的人髓细胞生成，在移植后12、16和20周时分析接受体。虽然人⑶14+CD33+单核细胞/巨噬细胞谱系细胞在M-CSFm/m小鼠中在移植后16周时略微降低且在20周时严重降低，但是即使在16和20周时在M-CSFh7ni和M-CSFh7h小鼠两者中观察到相当大比例的人⑶14+⑶33+细胞。不过，在M-CSFh7h小鼠中看到人⑶14+⑶33+细胞的最大频率(图4A和4B)。
[0174]接着，评估人源化M-CSF小鼠是否支持人组织巨噬细胞的有效分化。为此，用PBS灌注M-CSFm/m、M-CSFm/h和M-CSFh7h小鼠，并收获其器官(包括肝、肺和皮肤)。通过用PBS冲洗腹腔获得腹膜细胞。制备单细胞悬浮液，并计算人CD14+CD33+细胞的频率。如预期的，人⑶14+CD33+细胞的频率在M-CSFm/h和M_CSFh/h小鼠两者的肝、肺和腹膜中显著升高。然而，对皮肤外植体的分析揭示了 M-CSFm/m和M-CSFm/h小鼠之间人⑶14+CD33+细胞的相当频率，尽管在M-CSFh7h小鼠的皮肤外植体中观察到这些细胞的显著增加(图5)。总之，这些数据提示小鼠中人M-CSF的表达改善人HSC的髓样/巨噬细胞谱系分化。
[0175]实施例4:人源化M-CSF小鼠中人单核细胞/巨噬细胞功能
[0176]为了研究人源化M-CSF小鼠中的人⑶14+⑶33+单核细胞/巨噬细胞是否正常发挥功能，实施体内和体外功能研究两者。给亚致死照射的M-CSFm/m和M-CSFm/h幼犬注射胎儿肝CD34+细胞，并在移植后12周，评估供体衍生的造血功能，并给接受小鼠注射LPS或PBS。LPS注射后2天，对接受体分析脾中人⑶14+⑶33+细胞的频率。在与PBS注射组相比时，虽然LPS注射仅在M-CSFm/m小鼠中诱导单核细胞/巨噬细胞谱系细胞的适度增加，但是经LPS注射的M-CSFm/h小鼠在脾中显示人⑶14+CD33+细胞的几倍增加(图6A)。接着，检查这些细胞在体内响应LPS刺激而生成促炎性细胞因子的能力。
[0177]给用人⑶34+细胞嫁接的M_CSFm/m和M_CSFm/h小鼠注射LPS。注射后6小时，将小鼠放血，并通过ELISA测定人和小鼠IL6和TNFa的血清水平。与人源化M-CSF小鼠中升高的单核细胞/巨噬细胞频率一致，在105?°1/11小鼠中检出升高的人11^6和1即(1水平。虽然这些细胞因子的基础水平在M-CSFm/h小鼠中较高，但是LPS刺激导致血清中提升的人IL6和TNF α水平(图6B和6C)。接着，分析单核细胞/巨噬细胞(获自人源化M-CSF小鼠)在体外分泌促炎性细胞因子的能力。在用人⑶34+细胞重建12周后，从M-CSFm/m或M-CSFivh小鼠的脾分离人⑶14+CD33+细胞，并用LPS在体外刺激24或48小时。通过ELISA评估细胞培养物上清液中的IL-6和TNF α细胞因子水平。与体内数据一致，从M-CSFh7h小鼠纯化的⑶14+⑶33+细胞响应LPS而提升这些细胞因子的分泌水平(图7Α和7Β)。类似地，从人源化M-CSF小鼠分离的人⑶14+⑶33+细胞响应多聚1:C刺激而提升干扰素-α和干扰素-PmRNA的表达水平(图7C)。最终，分析从人源化M-CSF小鼠获得的人单核细胞/巨噬细胞的吞噬、迁移和活化特性。从人⑶34+重建的M-CSFivh小鼠纯化的人⑶14+⑶33+细胞展现出升高的吞噬特性(图7D)，而且展现出响应细胞因子Μ?ρ3β的提升的趋化性(图7Ε)。如预期的，从M-CSFh7h小鼠获得的人单核细胞/巨噬细胞展示增强的活化特性，如基于响应体外LPS刺激的共刺激分子，包括⑶40，⑶80和⑶86，及HLA-DR的上调评估的(图7F)。总体上，在人源化小鼠中在存在人M-CSF的情况下分化的人单核细胞/巨噬细胞展现出提升的功能特性。
[0178]生成具有完全重建的且功能性的人起源造血/免疫系统的小鼠在该领域中一直是一项极大的考验。至今，已经开发出3种小鼠品系(NOD-scid Y c+，[NSG]，NOD/Sh1-scid Y CvINOG]，和Balb/c-RagZ+ y z+、。尽管这些品系都各有优点，但人造血功能在这些小鼠中是不完全的。
[0179]为了克服此主要技术挑战，将小鼠CSF-1基因用其人对应物替换。这导致用人造血干细胞和祖细胞重建的小鼠中有效的人巨噬细胞分化。对人源化CSF-1小鼠的分析显示BM、脾和外周血中人单核细胞/巨噬细胞的有效分化。此外，在这些小鼠中的几种不同组织，包括肺和肝中检出人巨噬细胞，指示人源化小鼠中CSF-1的存在足以促进人组织巨噬细胞分化。另外，涉及自CSFlm/n^P CSFlivh小鼠分离的人单核细胞/巨噬细胞的本文中描述的功能性研究指示来自CSFlh7h小鼠的细胞在实施功能诸如吞噬、迁移、活化和细胞因子分泌方面更好。基于这些发现，可以推断在存在人CSF-1的情况下分化的单核细胞/巨噬细胞更好地发挥功能。
[0180]使用VE LOCIGENE?遗传工程化技术生成表达人CSF-1的新颖Balb/c-RagZ+Yc+小鼠系。因而，在不破坏小鼠csfl基因的调节元件诸如启动子的情况下将小鼠CSF-1编码区用人对应物替换。这生成嵌合基因，其含有小鼠调节元件和人CSF-1编码区。这些小鼠的表达研究指示此嵌合基因以定性和定量方式两者忠实表达。
[0181 ] CSF-1在小鼠巨噬细胞分化中的作用已经完善建立。CSF-1 (Csflop7op)或其受体(Csflr+)缺陷的小鼠展现出巨噬细胞和破骨细胞频率的严重降低、骨硬化病(osteopetrosis)、出牙失败、多种组织(包括神经系统、雄性和雌性生殖、真皮和滑膜)的发育缺陷。虽然这些研究已经提供了对CSF-1在小鼠中作用的非常重要的了解，但是CSF-1在人造血中的意义很大程度上仍然是未知的。在这点上，本文中描述的小鼠会充当有价值的工具，因为它将实现对细胞因子在人造血和造血细胞功能方面生理学和功能改善的了解。另外，可以使用此小鼠来为疾病建模，并测试药剂对人免疫系统的影响。此小鼠模型在了解多种人病症和疾病的病理生理学方面及在治疗方面是有价值的工具。
[0182] 上文仅例示本发明的原则。应当领会，本领域技术人员会能够想出各种排列，虽然本文中没有明确描述或显示，但是其体现本发明的原则，并且包含在其精神和范围内。此外，本文中叙述的所有例子和条件语言在原则上意图帮助读者了解本发明的原则和发明人促成技术进步的概念，而且应解释为不限于此类具体叙述的例子和条件。此外，本文中叙述本发明原则、方面和实施方案及其具体例子的所有陈述意图涵盖其结构和功能等同方案两者。因而，此类等同方案包括目前已知的等同方案和未来开发的等同方案两者，即，包括为实施相同功能而开发的、与结构无关的任何要素。因此，本发明的范围并不意图限于本文中显示及描述的例示性实施方案。而所附权利要求书体现本发明的范围和精神。
【权利要求】
1.一种人源化M-CSF小鼠，其包含: 核酸序列，该核酸序列编码人M-CSF蛋白，并且与小鼠M-CSF基因的启动子可操作连接。
2.依照权利要求1的人源化M-CSF小鼠，其中所述小鼠包含两个拷贝的所述核酸序列。
3.依照权利要求1的人源化M-CSF小鼠，其中所述核酸序列与小鼠M-CSF基因座处的内源小鼠M-CSF启动子可操作连接。
4.依照权利要求1的人源化M-CSF小鼠，其中所述小鼠包含在至少一个小鼠M-CSF等位基因中的无效突变。
5.依照权利要求4的人源化M-CSF小鼠，其中所述无效突变是小鼠M-CSF外显子2_9的缺失。
6.依照权利要求1的人源化M-CSF小鼠，其中所述小鼠就Rag2而言是纯合无效的。
7.依照权利要求6的人源化M-CSF小鼠，其中所述小鼠就IL2rg而言是纯合无效的。
8.依照权利要求1的人源化M-CSF小鼠，其中所述小鼠包含人细胞。
9.依照权利要求8的人源化M-CSF小鼠，其中所述人细胞是造血细胞。
10.依照权利要求9的人源化M-CSF小鼠，其中所述小鼠包含人病原体的感染。
11.一种人造血系统的小鼠模型，其包含: Rag2中的2处无效突变； IL2rg中的2处无效突变； 与小鼠M-CSF基因的启动子可操作连接的核酸序列，该核酸序列编码人M-CSF蛋白；和 人造血细胞。
12.依照权利要求11的小鼠模型，其中所述核酸序列与小鼠M-CSF基因座处的内源小鼠M-CSF启动子可操作连接。
13.依照权利要求11的小鼠模型，其中所述小鼠包含小鼠M-CSF的无效缺失。
14.依照权利要求11的小鼠模型，其中所述小鼠展现出选自下组的一项或多项特征: a.以与野生型小鼠中的小鼠M-CSF表达相当的水平在骨髓、脾、血液、肝、脑、肺、睾丸和肾中表达人M-CSF ； b.展现出比不表达hM-CSF的嫁接小鼠中的h⑶14+⑶33+高2至6倍的脾h⑶14+⑶33+细胞频率； c.展现出比不表达hM-CSF的嫁接小鼠中的hCD14+CD33+高2至8倍的外周血hCD14+CD33+细胞频率； d.展现出约15%至约40%的血液中h⑶14+⑶33+单核细胞/巨噬细胞谱系细胞水平； e.在约20周龄时展现出约5%至约15%的血液中h⑶14+CD33+单核细胞/巨噬细胞谱系细胞水平； f.展现出对LPS注射的响应，其比缺乏人M-CSF的小鼠在肝中h⑶14+CD33+细胞百分比方面高大约1.5至大约6倍； g.在LPS注射后约48小时展现出脾中增强的h⑶14+⑶33+h⑶45+细胞生成，其中所述增强超过缺乏hM-CSF的嫁接小鼠的约2至约5倍； h.展现出响应LPS的增强的血清人IL-6生成，其中LPS注射后约6小时的hIL_6水平比缺乏hM-CSF的嫁接小鼠增强约2至约5倍；i.在LPS刺激后展现出单核细胞和/或巨噬细胞的体外分泌，其比缺乏hM-CSF基因的嫁接小鼠在hTNF α方面高约2至3倍； j.在LPS刺激后展现出单核细胞和/或巨噬细胞的体外分泌，其比缺乏hM-CSF基因的嫁接小鼠在hIL-6方面高约2至4倍； k.在多聚1:C刺激后展现出单核细胞和/或巨噬细胞的体外分泌，其比缺乏hM-CSF基因的嫁接小鼠在hIFN α方面高约3至6倍； .1.在多聚1:C刺激后展现出单核细胞和/或巨噬细胞的体外分泌，其比缺乏hM-CSF基因的嫁接小鼠在hIFNP方面高约2至3倍； m.与缺乏hM-CSF基因的经遗传修饰的且嫁接的小鼠相比展现出增强的吞噬；η.与缺乏hM-CSF基因的经遗传修饰的嫁接小鼠相比展现出增强的响应Mip3 β的体外趋化性；和 .ο.展现出响应LPS刺激的共刺激分子的体外上调，其中所述共刺激分子选自人CD40、人⑶80、人⑶86、人HLA-DR及其组合。
15.依照权利要求14的小鼠模型，其中所述小鼠展现出两项或更多项所述特征。
16.依照权利要求14的小鼠模型，其中所述小鼠展现出三项或更多项所述特征。
17.—种人病原体的小鼠模型,其包含: Rag2中的2处无效突变； IL2RG中的2处无效突变； 与小鼠M-CSF基因的启动子可操作连接的核酸序列，其编码人M-CSF蛋白； 人造血细胞；和 人病原体的感染。
18.依照权利要求17的小鼠模型，其中所述病原体选自病毒、真菌、和细菌。
19.依照权利要求18的小鼠模型，其中所述细菌是分枝杆菌或肠杆菌。
【文档编号】A01K67/027GK103547148SQ201280018139
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年2月14日 优先权日:2011年2月15日
【发明者】A·J·墨菲, S·史蒂文斯, C·雷西南, E·艾农, M·曼茨, R·弗拉维尔, G·D·雅克波罗斯 申请人:再生元制药公司, 耶鲁大学, 生物医学研究院