一种瘤菌根菌菌株及其应用和菌根真菌接种法
【专利摘要】一种瘤菌根菌（Epulorhiza?sp.）菌株S1（CGMCC?No.8145）及其在促进铁皮石斛生长和促进铁皮石斛多糖积累中的应用。以铁皮石斛（Dendrobium?officinale)的组培苗为材料，对其进行人工接种S1（Epulorhiza?sp.）菌株，共培养60天后，S1真菌与寄主根形成了共生关系，接菌苗的鲜重增长量、干重、株高、茎长、茎粗、茎节数、节间长、分蘖株数、新根数和多糖含量显著高于对照，多糖含量高出未接菌苗含量的141.63%，约是未接菌苗多糖含量的2.4倍。采用该项新技术，可极大地促进铁皮石斛组培苗的生长；提高铁皮石斛组培苗的生物量和多糖含量。该项技术方法操作性强，可生产出高质量的铁皮石斛组培苗，为铁皮石斛的高效栽培技术以及产业化生产带来较高的经济效益。
【专利说明】一种瘤菌根菌菌株及其应用和菌根真菌接种法
【技术领域】:
[0001]本发明属于生物【技术领域】,具体地,涉及一种瘤菌根菌菌株(Epulorhiza sp.)菌株SI (CGMCC N0.8145)及其在促进铁皮石斛生长和多糖积累中的应用和使用其的菌根真菌接种法。
【背景技术】:
[0002]石斛属(Dendrobium)是兰科(Orchidaceae)中的第二大属，全世界石斛属原生种的数量约有1100多种，主要分布在南亚、东亚和东南亚区域(Wang et al., 2011;Chen etal.，2010)。中国有81种，2变种(皱成勇和刘燕，2010)。石斛属多种植物具有较高的药用价值，有生津、止咳、润喉、提高机体免疫力等功效，如铁皮石斛、金钗石斛和鼓槌石斛等(中华人民共和国药典委员会，2010)。
[0003]铁皮石斛(Dendrobium officinale)是兰科(Orchidaceae)石斛属中名贵的药用植物，主要分布于云南、广西、安徽等地。由于其对咽喉疾病、提高人体免疫力乃至肿瘤都具有显著疗效，成为了驰名中外的保健佳品。近年来由于市场对铁皮石斛需求日益增加，如何改善铁皮石斛人工栽培技术成为生产者需解决的重要问题。
[0004]铁皮石斛(Dendrobium officinale)在海拔达1600m的林下古树和水沟旁陆峭的岩壁上生长(Hou and Guo，2009)，具有重要的药用价值，富含多糖，具有提高免疫力和抑制肿瘤细胞生长的功能(Luo et al., 2000;Li`n et al.，2011)。近些年来,天然药物产业飞速发展，人们在高额利润的驱动下，常年毫无节制的采挖，野生铁皮石斛数量急剧下降，而且它们的野外生境受到严重破坏，致使其处于濒危境地(Liu et al.，2010)。因此，寻求有效的保护、重建其野外生境和可持续利用的途径刻不容缓。为了保护这些珍贵的野生兰科植物，扩繁技术是其有效途径之一。目前，扩繁主要采用组培技术，但兰科植物组培苗移栽成活率较低，生长比较缓慢(金辉等，2009)。制约人工大量生产和发展的障碍可能是组培苗到大田栽培的中间环节。在野外生境中，兰科植物要与真菌共生形成菌根，才能健壮的生长(Smith et al.，2008)。本发明【背景技术】所涉及到的参考文献有:金辉，许忠祥，陈金花等，2009.铁皮石斛组培苗与菌根真菌共培养过程中的相互作用.植物生态学报，33 (3):433-441 ;中华人民共和国药典委员会，2010.中华人民共和国药典.北京:化学工业出版社；皱成勇，刘燕，2010.我国石斛属植物研究进展.安徽农业科学，38 (12):6164-6166 ;周玉杰，杨福孙，宋希强等，2009.菌根真菌对华石斛幼苗生长及光合性能的影响.北方园艺，12:11-15 ;Altschul SF, Gish ff, Miller W et al., 1990.Basic localalignment search tool.Journal of Molecular Biology, 215:403-410 ;Chen J, Hu KX,Hou XQ et al.,2010.Endophytic fungi assemblages fromlODendrobium medicinalplants (Orchidaceae).World Journal of Microbiology&Biotechnology, 27:1009-1016；Doyle JJ, Doyle JL, 1987.A rapid DNA isolation procedure for small quantitiesof fresh leaf tissues.Phytochemical Bulletin, 19:11 - 15 ；Hou XQ, Guo SX,2009.1nteraction between a Dark Septate Endophytic Isolate from Dendrobium sp.andRoots of D.nobile Seedlings.Journal of Integrative Plant Biology, 51:374-381 ； Lin Y，Li J，Li B et al., 2011.Effects of light quality on growth and development of protocorm-like bodies of Dendrobium officinale in vitr0.Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 105:329-335 ;Liu HX，Luo YB，Liu H,2010.Studies of mycorrhizal fungal of Chinese orchids and their role in orchid conservation in China-A Review.Botany Review,76:241-262 ；Luo HLjCai TYj Cheng QLj2000.Enhancement of Dendrobium candidum polysaccharides on killing effect of LAK cells of umbilical cord and peripheral cancer patients in vitr0.Chinese Journal of Cancer Research, 19:1124-1126 ；Ma M，Tan TKj Wong SM, 2003.1dentification and molecular phylogeny of Epulorhiza isolates from tropical orchids.Mycological Research, 107:1041-1049 ；Smith SE，Read DJj2008.Mycorrhizal symbiosis.Academic Press, New York ；Wang H，Fang HY，Wang YQ et al., 2011.1n situ seed baiting techniques in Dendrobium officinale Kimuraet Migo and Dendrobium nobile Lindl.: the endangered Chinese endemic Dendrobium (Orchidaceae).World Journal of Micro biology&Biotechnology，27:2051-2059。[0005]目前，现有技术中未见有该种瘤菌根菌菌株(Epulorhiza sp.)菌株SI (CGMCC N0.8145)及其在促进铁皮石斛生长中的应用和在促进铁皮石斛多糖积累中的应用报道。
【发明内容】
:[0006]本发明的目的在于提供一种瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)菌株SKCGMCC N0.8145) 及其在促进铁皮石斛生长中的应用和在促进铁皮石斛多糖积累中的应用和方法。[0007]为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:[0008]一种瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)菌株(CGMCC N0.8145)。[0009]所述的瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)菌株SI (CGMCC N0.8145)在促进铁皮石斛生长中的应用。[0010]所述的瘤菌根菌(Epulorhiza sp.)菌株SI (CGMCC N0.8145)在促进铁皮石斛多糖积累中应用。[0011]所述的应用，是以铁皮石斛4个月苗龄的组培苗为材料，对其进行人工接种SI (Epulorhiza sp.)菌株,培养60天后，SI真菌与寄主根形成共生关系。[0012]所述的应用中，接种是在无菌条件下将铁皮石斛4个月苗龄的组培苗转接入 100ml/瓶的共生培养基(1/2MS培养基+7.5%蔗糖+7.5%琼脂)的玻璃组培瓶中，每瓶8株苗，7天后，选取无污染的苗，取一 PDA平板培养基上活化的SI菌株琼脂块，接入组培瓶中心的培养基上，使染菌的琼脂块离8株苗的距离大致相同，置于温度26±1°C，光照50 μ mol.m-2s-1 12h/d的组培室内共培养。[0013]一种促进铁皮石斛的生长和多糖积累的菌根真菌接种法，将所述的瘤菌根菌 (Epulorhiza sp.)菌株SI (CGMCC N0.8145)人工接种到铁皮石斛4个月苗龄的组培苗上， 置于温度26±1°C，50 μ mol.m_2.s—1，12h/d的组培室内共培养培60天后，SI真菌与寄主根形成共生关系。[0014]如所述的方法，组培苗的获得是将铁皮石斛完整的成熟蒴果冲洗干净，75%乙醇表面消毒15min后,在0.1%升萊溶液中浸泡IOmin,无菌蒸懼水漂洗3次,用无菌滤纸吸干后，将种子播种于含有改良Harvais培养基的培养瓶中，在温度26± 1°C,光照50 μ mol.mis1,12h/d的组培室内培养，种子萌发成幼苗后，无菌转入另一含改良Harvais培养基的培养瓶中继续培养4个月；无菌条件下，将上述铁皮石斛4个月苗龄的组培苗转接入每瓶100ml含有1/2MS培养基+7.5%蔗糖+7.5%琼脂的共生培养基的组培瓶中，每瓶8株苗，7天后，选取无污染的苗，用打孔器打取PDA平板培养基上活化的SI菌株琼脂块，每瓶接入一个带菌的琼脂小块，置于瓶中心的培养基上，使染菌的琼脂块离8株苗的距离大致相同；置于温度26± 1°C,光照50 μ mol.m_2.s_\ 12h/d的组培室内共培养,60天后，SI真菌显著地促进了铁皮石斛幼苗的生长和可溶性多糖的积累。
[0015]如所述的方法，培养基的组成为:
[0016]PDA培养基:马铃薯20% (煮汁)葡萄糖2%琼脂1.5% ；
[0017]改良Harvais 培养基:Ca (NO3).4H20200mg/L, NH4NO3140mg/L, KH2PO4IOOmg/L, MgSO4.7H20100mg/L, KNO3IOOmg/!, KC150mg/L, H3BO30.5mg/L, CuSO4.5H200.025mg/L, ZnSO4.7H200.5mg/L, Na2MoO4.2H200.02mg/L, Co (NO3)2.6H200.025mg/L, KI0.lmg/L, MnSO4.H2Ol.54mg/L, (NH4) 3C6H50719mg/L, Fe (NH4) 3 (C6H5O7) 225mg/L, KT0.25mg,椰乳 20ml,蔗糖 20g,琼脂 9g，活性炭 0.3g, 土豆 30g, PH5.6-5.8 ；
[0018]1/2MS 培养基:NH4N03825mg/L, KN03950mg/L, CaCl2.2H20220mg/L, MgSO4.7H20185mg/L, KH2P0485mg/L, KI0.83mg/L, H3B036.20mg/L, MnSO4.4H2022.30mg/L, ZnSO4.7H208.6Omg/L, Na2MoO4.2H200.2 5mg/L, CuSO4.5H200.02 5mg/L, CoCl2.6H200.025mg/L, FeSO4.7H2027.80mg/L, Na-EDTA.2H2037.30mg/L,肌醇 lOOmg/L,烟酸0.5mg/L,盐酸批卩多醇(维生素B6) 0.5mg/L,盐酸硫胺素(维生素BI) 0.5mg/L,甘氨酸
2.0mg/Lο
`[0019]与现有技术相比，本发明的优益性在于:
[0020]本发明主要通过对铁皮石斛组培苗进行接菌试验，筛选铁皮石斛的菌根真菌,为组培苗人工接种菌根真菌，提高移栽成活率，促进其快速生长发育提供技术支持。
[0021]本发明以铁皮石斛4个月龄的组培苗为材料，对其进行人工接种SI (Epulorhizasp.)菌株。共培养60天后，SI真菌与寄主根形成了共生关系，接菌苗的鲜重增长量、干重、株高、茎长、茎粗、茎节数、节间长、分蘖株数、新根数和多糖含量显著高于对照，多糖含量高出未接菌苗141.63%，是未接菌苗的2.4倍。采用该项新技术，可极大地促进铁皮石斛的生长；提高铁皮石斛生物量和多糖含量。该项技术方法操作性强，可生产出高质量的铁皮石斛组培苗，为铁皮石斛的高效栽培技术以及产业化生产带来较高的经济效益。
【具体实施方式】:
[0022]下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
[0023]实施例1:
[0024]I材料与方法
[0025]1.1内生真菌的分离
[0026]取野生铁皮石斛(2009年4月采自云南西双版纳亚热带森林中)的健康根，用水洗净，在超净工作台上，放入0.1%升汞溶液中浸泡8~lOmin，无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干，在无菌培养皿中横切成0.5~Icm的小段,置于PDA平板培养基上培养,每皿放8个小段，25°C恒温暗培养。待菌丝从根组织上长出并形成一定大小菌落时，从菌落的边缘挑取菌丝转移到另一 PDA平板上纯培养。然后转入PDA斜面培养基，培养10~15d后，置于4°C冰箱保存。通过离体接种实验，检测到SI菌株对铁皮石斛有很好的促进作用。[0027]1.2S1菌株的分子生物学鉴定:[0028]DNA提取:在PDA平板培养基上活化菌株后，无菌条件下挑取少量菌丝于1.5ml离心管中。采用CTAB法提取真菌的DNA (Doyle and Doyle, 1987)。[0029]PCR扩增:利用引物ITS1/ITS4对SI菌株的5.8S rDNA上的ITS区域进行扩增(Ma et al.，2003)。PCR 反应体系(25 μ L):2.5 μ LlO XBuffer (with Mg+), 2 μ L dNTP (2.5mM), 0.5μ L Taq polymerase (2.5U), 2 μ I (5 μ M *L_1)的各种引物，2 μ LDNA，14 μ L ddH20。反应条件为94°C变性3min，进入94°C变性Imin的35个循环，53°C退火50s，72°C延伸lmin，循环结束后72°C再延伸7min。反应结束后，1.5%琼脂糖胶检测。将PCR产物送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序。[0030]序列分析:将测得的序列用软件ContigExpress进行校对，然后通过BLAST搜索在 GenBank 中进行序列比对(http:1Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/)，与 GenBank 中的序列相似度大于95%的,可以鉴定为同属真菌(Altschul et al.，1990)。[0031]1.3真菌接种物[0032]将SI接种于含有PDA培养基的平板培养皿(直径9cm)中，25°C暗培养3周后，备用。[0033]1.4接种实验[0034]1.4.1铁皮石斛组培苗的获得[0035]将铁皮石斛完整的成熟蒴果，用流水冲洗干净，75%乙醇表面消毒15min。然后在 0.1%升汞溶液中浸泡lOmin，无菌蒸馏水漂洗3次。用无菌滤纸吸干后，剖开。将种子播种于含有改良Harvais培养基(121 °C灭菌30min)的培养瓶(直径8cm)中，放入温度26 ± I °C， 光照50 μ mol.m_2.s_S 12h/d的组培室内培养。种子萌发成幼苗后，无菌转入另一含改良 Harvais培养基的培养瓶中继续培养。[0036]1.4.2接种方法[0037]选取上述步骤铁皮石斛4个月苗龄的组培苗，在超净工作台上，转接入玻璃组培瓶中(容积600ml，瓶口内径5cm)的定量(100ml/瓶)共生培养基(1/2MS培养基+7.5%蔗糖+7.5%琼脂)中(Hou and Guo，2009)，每瓶8株幼苗。接苗前先在电子天平上称装有培养基的组培瓶重量(精确到0.01g),接入苗后，再称重，计算每瓶的苗重。7天后，选取无污染的苗，用打孔器(0.33cm2)打取PDA平板培养基上活化的SI菌株琼脂块，每瓶接入一个带菌的琼脂小块，置于瓶中心的培养基上，使染菌的琼脂块离8株苗的距离大致相同；对照组接入同样大小无菌琼脂块。每个处理重复25瓶。所有接菌处理苗和对照苗均置于温度 26±1°C，光照50 μ mol.m-2.s'12h/d的组培室内培养。
[0038]1.5共生真菌的分离[0039]取共培养60天后的铁皮石斛组培苗的根，分离方法同1.1内生真菌的分离。[0040]1.6生长指标的数据收集和数据分析[0041]共培养60天后，准确称取处理组苗和对照组苗的重量，结合处理前的重量，计算苗鲜重的增长量。测量株高、主茎长、茎粗、节间长。统计每瓶中8株苗的新根数、分蘖株数和茎节数，然后将苗置80°C烘箱中48h，记录苗的干重，以上均以瓶为单位统计。称量完干重之后将其磨成粉末，采用苯酚-硫酸法(中华人民共和国药典委员会，2010)对石斛多糖含量进行测定。所有数据都使用SPSS17.0for Windows进行分析，不同处理间的差异比较采用单因素方差分析(ANOVA)和LSD检验。所有统计图用SigmaPlotl0.0for Windows软件绘制。
[0042]2结果与讨论
[0043]2.1Sl菌株的分子鉴定
[0044]利用引物ITS1/ITS4能对SI菌株DNA的ITS区域扩增出约750bp的特异条带，测序结果校对后，在GenBank中Blast结果为与Epulorhiza sp.有96%的相似度(表1 )。根据Altschul et al.(1990)的判定标准，SI菌株是Epulorhiza sp.真菌。该菌种已于2013年09月09日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号:CGMCC N0.8145，保存期限:30年。同时本 申请人:在实验室内将该菌株接种于若干支PDA斜面培养基试管，于25°C的恒温培养箱中暗培养,10~15d后,置于4°C冰箱保藏备用。
[0045]表1Sl基于ITS序列的Blast结果
【权利要求】
1.一种瘤菌根菌（Epulorhiza sp.)菌株（CGMCC No. 8145)。
2.权利要求1所述的瘤菌根菌（Epulorhizasp.)菌株SI (CGMCC No. 8145)在促进铁 皮石斛生长中的应用。
3.权利要求1所述的瘤菌根菌（Epulorhizasp.)菌株SI (CGMCC No. 8145)在促进铁 皮石斛多糖积累中的应用。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于以铁皮石斛4个月苗龄的组培苗为材料， 对其进行人工接种SI (Epulorhiza sp.)菌株，培养60天后,S1真菌与寄主根形成共生关 系。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的接种是在无菌条件下，将铁皮石斛4个 月苗龄的组培苗转接入100ml/瓶的共生培养基（1/2MS培养基+7. 5%蔗糖+7. 5%琼脂）的 玻璃组培瓶中，每瓶8株苗，7天后，选取无污染的苗，取一 PDA平板培养基上活化的S1菌株 琼脂块，接入组培瓶中心的培养基上，使染菌的琼脂块离8株苗的距离大致相同，置于温度 26±1°C，光照50iimol.nT2. s_1,12h/d的组培室内共培养。
6.一种促进铁皮石斛的生长和多糖积累的菌根真菌接种法，其特征在于将权利要求1 所述的瘤菌根菌（Epulorhiza sp.)菌株SI (CGMCC No. 8145)人工接种到铁皮石斛4个月 苗龄的组培苗上，置于温度26 土 1°C，光照50 u mol. m_2. s' 12h/d的组培室内共培养培60 天后，S1真菌与寄主根形成共生关系。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的组培苗的获得是将铁皮石斛完整的成 熟蒴果冲洗干净，75%乙醇表面消毒15min后，在0. 1%升萊溶液中浸泡lOmin,无菌蒸懼水 漂洗3次，用无菌滤纸吸干后，将种子播种于含有改良Harvais培养基的培养瓶中，在温度 26土 1°C,光照50 li mol. m_2. s_\ 12h/d的组培室内培养,种子萌发成幼苗后，无菌转入另一 含改良Harvais培养基的培养瓶中继续培养4个月；无菌条件下，将上述铁皮石斛4个月苗 龄的组培苗转接入每瓶100ml含有1/2MS培养基+7. 5%蔗糖+7. 5%琼脂的共生培养基的组 培瓶中，每瓶8株苗，7天后，选取无污染的苗，用打孔器打取PDA平板培养基上活化的S1菌 株琼脂块，每瓶接入一个带菌的琼脂小块，置于瓶中心的培养基上，使染菌的琼脂块离8株 苗的距离大致相同，置于温度26± 1°C,光照50 ii mol. m 2. s \ 12h/d的组培室内共培养,60 天后，S1真菌显著地促进了铁皮石斛幼苗的生长和可溶性多糖的积累。
8.如权利要求5或6或7所述的方法，其特征在于所述的培养基的组成为：PDA培养基：马铃薯20% (煮汁）葡萄糖2%琼脂1.5%;改良 Harvais 培养基：Ca (N03) ? 4H20200mg/L, NH4N03140mg/L, KH2P04100mg/ L, MgS04 ? 7H20100mg/L, KN03100mg/L, KC150mg/L, H3B030. 5mg/L, CuS04 ? 5H200. 025mg/ L, ZnS04 ? 7H200. 5mg/L, Na2Mo04 ? 2H200. 02mg/L, Co (N03)2 ? 6H200. 025mg/L, KI0. lmg/ L, MnS04 ? H201. 54mg/L, (NH4) 3C6H50719mg/L, Fe (NH4) 3 (C6H507) 225mg/L, KT0. 25mg,椰乳 20ml, 蔗糖 20g,琼脂 9g，活性炭 0. 3g, 土豆 30g, PH5. 6-5. 8 ；1/2MS 培养基：NH4N03825mg/L, KN03950mg/L, CaCl2 ? 2H20220mg/L, MgS04 ? 7H20185mg/ L, KH2P0485mg/L, KI0. 83mg/L, H3B036 . 20mg/L, MnS04 ? 4H2022. 30mg/L, ZnS04 ? 7H208. 60mg/L, Na2Mo04 ? 2H200. 25mg/L, CuS04 ? 5H200. 025mg/L, CoCl2 *6H200. 025mg/L, FeS04 ? 7H2027. 80mg/ L, Na-EDTA ? 2H2037. 30mg/L,肌醇 lOOmg/L,烟酸 0. 5mg/L,盐酸吡哆醇（维生素 B6) 0. 5mg/ L,盐酸硫胺素(维生素B1) 0. 5mg/L,甘氨酸2. 0mg/L。
【文档编号】A01H4/00GK103497900SQ201310467768
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月9日 优先权日:2013年10月9日
【发明者】严宁, 王秋霞, 纪大干, 李树云, 胡虹 申请人:中国科学院昆明植物研究所