柳杉茎段组织培养获得再生植株的方法
【专利摘要】本发明涉及植物组织培养繁殖【技术领域】，具体涉及一种柳杉茎段组织培养获得再生植株的方法，包括如下步骤：（1）外植体消毒；（2）诱导培养；（3）增殖培养；（4）生根壮苗培养；（5）炼苗移栽。本发明采用柳杉茎段为外植体进行组织培养，能够通过选择优良母株进行取材，快速获得大量遗传背景完全一致的优良群体；组织培养能有效保持母株的优良性状，且生产不受季节限制，是工厂化育苗的主要形式，能够在短期内培育大量的优良种苗。本技术将有力推动柳杉无性系良种的选育、繁殖和推广应用，促进柳杉人工林的健康快速发展。
【专利说明】柳杉茎段组织培养获得再生植株的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物组织培养繁殖【技术领域】，具体涉及一种柳杉茎段组织培养获得再生植株的方法。
【背景技术】
[0002]柳杉(Cryptomeriafortunei)为杉科柳杉属(Cryptomeria D.Don)常绿乔木，别名孔雀杉，是我国特有的用材树种，主要分布于四川、浙江、江西等省，现长江以南大多数省区均有栽培。柳杉生长迅速，树干通直，适应性强，是优良的用材和绿化树种。柳杉是我国最主要的人工造林树种之一，在南方地区有广泛的栽培，在木材供给、生态建设和城乡绿化上发挥着重要作用。
[0003]由于柳杉无性繁殖技术一直未达成实用水平，柳杉的育苗几乎全部依靠种子繁殖。由于子代性状分离的必然存在，实生繁殖无法保持母树的优良性状，使得实生良种的遗传增益远低于无性系良种。此外，柳杉树体高大，种子园产量普遍很低，采种困难且危险，种子产量难以满足生产需求。尽管柳杉的扦插和组培等无性繁殖技术曾有研究，但因技术的成熟度不够，无法在生产上推广应用。
[0004]组织培养是一种利用植物组织来培养完整再生植株的无性繁殖技术，是无性系良种培育的主要技术手段。其具有产能大、成本低、可周年生产、条件可控等其他繁殖方式所无法比拟的优点，因而成为工厂化育苗最主要的形式，在林木良种选育和繁殖中起着十分重要的作用。近年来，林 木组织培养技术取得了很大的进展，尤其是在林木良种快繁育苗方面，已经成为杉木、巨桉等树种的主要育苗方式。本发明提供一种以柳杉茎段为外植体的组培快繁技术，可为为柳杉无性系良种选育和工厂化育苗提供技术支撑。
【发明内容】
[0005]本发明是一种利用柳杉茎段通过组织培养快速获得大量再生优良植株的方法。这对解决我国柳杉无性系良种缺乏，实生良种遗传增益不高，种子产量低，采收困难且十分危险，优良种苗供应严重不足的问题，促进无性系良种选育，优良无性系种苗规模繁育具有重要的意义。
[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种柳杉茎段组织培养获得再生植株的方法，包括如下步骤:
[0007](I)外植体消毒:取茎段材料，用洗涤剂溶液浸泡25~35min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成独立的带顶芽的小枝条，长度5cm，将枝条置于烧杯中，流水冲洗3~3.5h，吸干水分，再用浓度为0.2%的多菌灵溶液浸泡30~35min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行无菌消毒，在超净工作台下用浓度为75%的酒精消毒10~20s后，再用0.1%的升汞浸泡6~8min，然后用无菌水清洗4~6次,用无菌纱布吸干备用；
[0008](2)诱导培养:截取2~3cm的茎段，剪去针叶长度的2/3，接入诱导培养基中，先置于黑暗培养箱中培养72~120h，再置于光照培养箱中培养，10~20d即有芽开始膨大萌动，40~50d长出丛生芽；
[0009](3)增殖培养:将诱导产生的丛生芽分株，每株含3~5个芽，接种到增殖培养基上，置于光照培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养；
[0010](4)生根壮苗培养:在丛生芽中，剪取3~5cm带顶芽的材料，接种到生根培养基中，置于光照培养箱中培养25~35d，获得生长健壮且具有效根的幼苗；
[0011](5)炼苗移栽:将已经生根的幼苗置于自然光下驯化培养20~25d，打开瓶盖，将幼苗小心取出栽种，栽种基质为河砂，25~35d后长出新的嫩芽，幼苗成活。
[0012]进一步，所述步骤(2)中的诱导培养基为WPM基本培养基+6-BA0.5-1.0mg.L-1+IBAO-0.05mg.L:+ 鹿糖 30g.L:+ 琼脂 7g.L、
[0013]进一步，所述步骤(3)中的增殖培养基为WPM基本培养基+6-BA0.25-0.5mg.L_1+IBA0-0.02mg.L-1+ 鹿糖 30g.L-1+ 琼脂 7g.L'
[0014]进一步，所述步骤(4)中的生根培养基为1/2WPM基本培养基+NAA0.01-0.03mg.L_1+IBA0-0.02mg.L-1+ 鹿糖 30g.L-1+ 琼脂 7g.L'
[0015]进一步，所述步骤(4)中的光照培养箱培养温度为20~25°C，光照强度1500~2000Lx,光照时间为12~15h/d。
[0016]本发明中，1/2WPM指WPM培养基中的大量元素减半，其他均保持不变。
[0017]本发明的有益技术效果是:本发明采用柳杉茎段为外植体进行组织培养，能够通过选择优良母株进行取材，快速获得大量遗传背景完全一致的优良群体；组织培养能有效保持母株的优良性状，且生产不受季节限制，能够在短期内培育大量的优良种苗。本技术将有力推动柳杉无性系良种的选育、繁殖和推广，促进柳杉人工林的健康快速发展。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1:外植体开始萌动；
[0019]图2:诱导产生的丛生芽；
[0020]图3:丛生芽的增殖；
[0021]图4:生根的试管苗；
[0022]图5:移栽成活的幼苗。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0024]以下实施例可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0025]实施实例I
[0026](1)取茎段材料，用洗涤剂溶液浸泡30min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成独立的带顶芽的小枝条，长度5cm,将枝条置于烧杯中,流水冲洗3h,吸干水分,再用浓度为0.2%的多菌灵溶液浸泡33min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行无菌消毒，在超净工作台下用浓度为75%的酒精消毒15s后,再用0.1%的升汞浸泡7min，然后用无菌水清洗5次，用无菌纱布吸干备用；
[0027](2)诱导培养，截取2.5cm的茎段，剪去针叶长度的2/3，接入诱导培养基(诱导培养基为 WPM 基本培养基 +6-BA1.0mg.L-1'+ΙΒΑΟ.03mg.L—1+蔗糖 30g.L—1+琼脂 7g.L—1)中，先置于黑暗培养箱中培养IOOh,再置于光照培养箱中培养,15d即有芽开始膨大萌动(如图1)，45d长出丛生芽(如图2)；
[0028](3)增殖培养:将诱导产生的丛生芽分株，每株含4个芽，接种到增殖培养基(增殖培养基为 WPM 基本培养基 +6-BA0.25mg.L-1'+ΙΒΑΟ.0lmg.L—1+ 蔗糖 30g.L—1+ 琼脂 7g.L—1)上，置于光照培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽,继续进行分株增殖培养(如图3)；
[0029](4)生根壮苗培养:在丛生芽中，剪取4cm带顶芽的材料，接种到生根培养基(生根培养基为 1/2WPM 基本培养基+NAA0.01mg.L^+IBAOmg.L—1+蔗糖 30g.L—1+琼脂 7g.L—1)，置于培养箱温度为20°C、光照强度为15001x光照培养箱中培养30d，每天光照时间为12h，获得生长健壮且具有效根的幼苗(如图4)；
[0030](5)炼苗移栽:将已经生根的幼苗置于自然光下驯化培养20d，打开瓶盖，将幼苗小心取出栽种，栽种基质为河砂，25d后长出新的嫩芽，幼苗成活(如图5)。 [0031]实施实例2
[0032](I)取茎段材料，用洗涤剂溶液浸泡25min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成独立的带顶芽的小枝条，长度5cm,将枝条置于烧杯中,流水冲洗3h,吸干水分,再用浓度为0.2%的多菌灵溶液浸泡30min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行无菌消毒，在超净工作台下用浓度为75%的酒精消毒IOs后,再用0.1%的升汞浸泡6min，然后用无菌水清洗4次，用无菌纱布吸干备用；
[0033](2)诱导培养，截取2cm的茎段，剪去针叶长度的2/3，接入诱导培养基(诱导培养基为 WPM 基本培养基 +6-BA0.8mg.L-1'+ΙΒΑΟ.05mg.L—1+蔗糖 30g.L—1+琼脂 7g.L—1)中，先置于黑暗培养箱中培养72h，再置于光照培养箱中培养，IOd即有芽开始膨大萌动(如图l)，40d长出丛生芽(如图2);
[0034](3)增殖培养:将诱导产生的丛生芽分株，每株含3个芽，接种到增殖培养基(增殖培养基为 WPM 基本培养基 +6-BA0.5mg.L-1'+ΙΒΑΟ.02mg.L—1+ 蔗糖 30g.L—1+ 琼脂 7g.L—1)上，置于光照培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽,继续进行分株增殖培养(如图3)；
[0035](4)生根壮苗培养:在丛生芽中，剪取3cm带顶芽的材料，接种到生根培养基(生根培养基为 1/2WPM 基本培养基 +NAA0.02mg.L-1'+ΙΒΑΟ.0lmg.L—1+ 蔗糖 30g.L—1+ 琼脂 7g.L—1)，置于培养箱温度为20°C、光照强度为15001x光照培养箱中培养25d，每天光照时间为12h，获得生长健壮且具有效根的幼苗(如图4)；
[0036](5)炼苗移栽:将已经生根的幼苗置于自然光下驯化培养20d，打开瓶盖，将幼苗小心取出栽种，栽种基质为河砂，25d后长出新的嫩芽，幼苗成活(如图5)。
[0037]实施实例3
[0038](I)取茎段材料，用洗涤剂溶液浸泡25min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成独立的带顶芽的小枝条，长度5cm,将枝条置于烧杯中,流水冲洗3h,吸干水分,再用浓度为0.2%的多菌灵溶液浸泡30min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行无菌消毒，在超净工作台下用浓度为75%的酒精消毒IOs后,再用0.1%的升汞浸泡6min，然后用无菌水清洗4次，用无菌纱布吸干备用；
[0039](2)诱导培养，截取2cm的茎段，剪去针叶长度的2/3，接入诱导培养基(诱导培养基为WPM基本培养基+6-BA0.5mg.L^+IBAOmg.L—1+蔗糖30g.L—1+琼脂7g.L—1)中，先置于黑暗培养箱中培养72h，再置于光照培养箱中培养，10d即有芽开始膨大萌动（如图l)，40d长 出丛生芽(如图2)；
[0040](3)增殖培养：将诱导产生的丛生芽分株，每株含3个芽，接种到增殖培养基(增殖 培养基为 WPM 基本培养基 +6-BA0. 45mg. L^+IBAO. Olmg. L^+ 蔗糖 30g. L^+ 琼脂 7g. L—1)上， 置于光照培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养(如图3)；
[0041](4)生根壮苗培养：在丛生芽中，剪取3cm带顶芽的材料，接种到生根培养基(生根 培养基为 1/2WPM 基本培养基 +NAA0. 02mg. L^+IBAO. Olmg. L^+ 蔗糖 30g. L^+ 琼脂 7g. L-1)， 置于培养箱温度为20°C、光照强度为17001x光照培养箱中培养25d，每天光照时间为13h， 获得生长健壮且具有效根的幼苗(如图4)；
[0042](5)炼苗移栽：将已经生根的幼苗置于自然光下驯化培养22d，打开瓶盖，将幼苗 小心取出栽种，栽种基质为河砂，30d后长出新的嫩芽，幼苗成活(如图5)。
[0043]实施实例4
[0044](1)取茎段材料，用洗涤剂溶液浸泡35min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成独 立的带顶芽的小枝条，长度5cm,将枝条置于烧杯中，流水冲洗3h,吸干水分，再用浓度为 0. 2%的多菌灵溶液浸泡35min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行无菌消毒，在超净 工作台下用浓度为75%的酒精消毒20s后，再用0. 1%的升汞浸泡8min，然后用无菌水清洗 6次，用无菌纱布吸干备用；
[0045](2)诱导培养，截取3cm的茎段，剪去针叶长度的2/3，接入诱导培养基(诱导培养 基为WPM基本培养基+6-BA0. 8mg. L^+IBAO. 03mg. 1^+蔗糖30g. 1^+琼脂7g. L—1)中，先置于 黑暗培养箱中培养120h，再置于光照培养箱中培养，20d即有芽开始膨大萌动(如图l)，50d 长出丛生芽(如图2);
[0046](3)增殖培养：将诱导产生的丛生芽分株，每株含5个芽，接种到增殖培养基(增殖 培养基为WPM基本培养基+6-BA0. 4mg. L^+IBAOmg. L^+蔗糖30g. L^+琼脂7g. L—1)上，置于 光照培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养(如图3)；
[0047](4)生根壮苗培养：在丛生芽中，剪取3cm带顶芽的材料，接种到生根培养基(生根 培养基为1/2WPM基本培养基+NAA0. 03mg. L^+IBAOmg. L^+蔗糖30g. L^+琼脂7g. L—1)，置于 培养箱温度为20°C、光照强度为20001x光照培养箱中培养35d，每天光照时间为15h，获得 生长健壮且具有效根的幼苗(如图4)；
[0048](5)炼苗移栽：将已经生根的幼苗置于自然光下驯化培养25d，打开瓶盖，将幼苗 小心取出栽种，栽种基质为河砂，35d后长出新的嫩芽，幼苗成活(如图5 )。
[0049]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种柳杉茎段组织培养获得再生植株的方法，其特征是，包括如下步骤: (1)外植体消毒:取茎段材料，用洗涤剂溶液浸泡25~35min，将表面灰尘用毛刷轻轻刷去，并剪成独立的带顶芽的小枝条，长度5cm，将枝条置于烧杯中，流水冲洗3~3.5h，吸干水分，再用浓度为0.2%的多菌灵溶液浸泡30~35min，用蒸馏水清洗2次，放入无菌培养室进行无菌消毒，在超净工作台下用浓度为75%的酒精消毒10~20s后，再用0.1%的升汞浸泡6~8min,然后用无菌水清洗4~6次,用无菌纱布吸干备用； (2)诱导培养:截取2~3cm的茎段，剪去针叶长度的2/3，接入诱导培养基中，先置于黑暗培养箱中培养72~120h，再置于光照培养箱中培养，10~20d即有芽开始膨大萌动，40~50d长出丛生芽； (3)增殖培养:将诱导产生的丛生芽分株，每株含3~5个芽，接种到增殖培养基上，置于光照培养箱内培养，45d后产生大量丛生芽，继续进行分株增殖培养； (4)生根壮苗培养:在丛生芽中，剪取3~5cm带顶芽的材料，接种到生根培养基中，置于光照培养箱中培养25~35d，获得生长健壮且具有效根的幼苗； (5)炼苗移栽:将已经生根的幼苗置于自然光下驯化培养20~25d，打开瓶盖，将幼苗小心取出栽种，栽种基质为河砂，25~35d后长出新的嫩芽，幼苗成活。
2.根据权利要求1所述柳杉茎段组织培养获得再生植株的方法，其特征是，所述步骤(2)中的诱导培养基为WPM基本培养基+6-BA0.5-1.0mg.L^+IBAO-0.05mg.171+蔗糖30g.L-1+琼脂 7g.L-1。
3.根据权利要求1所述柳杉茎段组织培养获得再生植株的方法，其特征是，所述步骤(3)中的增殖培养基为WPM基本培养基+6-BA0.25-0.5mg.L^+IBAO-0.02mg.171+蔗糖30g.L-1+琼脂 7g.L-1。
4.根据权利要求1所述柳杉茎段组织培养获得再生植株的方法，其特征是，所述步骤(4)中的生根培养基为1/2WPM基本培养基+NAA0.01-0.03mg.L^+IBAO-0.02mg.171+蔗糖30g.L—1+琼脂 7g.L-1。
5.根据权利要求1所述柳杉茎段组织培养获得再生植株的方法，其特征是，所述步骤(4)中的光照培养箱培养温度为20~25°C，光照强度1500~2000Lx，光照时间为12~15h/d。
【文档编号】A01H4/00GK103609442SQ201310572842
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】万雪琴, 张帆, 蒋时姣, 刘海鹰, 钟宇, 吴富雨, 黄金亮, 张双 申请人:四川农业大学