黄花叶病毒p2蛋白及其基因在培育抗黄花叶病小麦中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了黄花叶病毒P2蛋白及其基因在培育抗黄花叶病小麦中的应用。本发明提供的如下1）-3）中任一种物质在调控植物抗病性中的应用：1）蛋白P2；2）编码蛋白P2的DNA分子；3）含有编码蛋白P2的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述蛋白P2的氨基酸序列为序列表中的序列2。本发明的实验证明，本发明将P2蛋白的编码基因导入小麦中，得到转基因小麦，该转基因小麦的抗黄花病性大于非转基因小麦，且同时获得了对病毒病具有较强抗性的转基因小麦新品系，说明该蛋白抗黄花病性，从而对于减少病毒病危害，保障小麦稳产具有重要意义。
【专利说明】黄花叶病毒P2蛋白及其基因在培育抗黄花叶病小麦中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种黄花叶病毒P2蛋白及其基因在培育抗黄花叶病小麦中的应用。
【背景技术】
[0002]小麦是世界最重要谷物资源之一，是人类主要的食物资源，也是重要的工业原料。近年来，全球能源紧缺的不断加重，小麦作为最主要的谷物资源之一，其需求量也越来越大。世界种植小麦的国家很多，但产量主要集中在中国、印度、美国、俄罗斯、加拿大和澳大利亚等国家，这几个国家小麦产量占世界总产量的一半；而中国的产量位居世界第一。
[0003]小麦在中国谷物生产中占有极其重要的地位，其种植面积与产量均占谷物产量的1/4以上，小麦作为我国三大粮食作物之一，其常年种植面积约2000万公顷，总产量达1200亿公斤。然而，近些年来，由于小麦病毒病逐渐加重，已成为我国小麦生产上的重要病害，尤其是小麦黄花叶病。小麦黄花叶病于1927年日本首次报道(Sawada，1927)，我国20世纪60年代以前只是零星发生，70年代以来不断扩大蔓延(孙谦等，1997;陶家风等，1980;王鸣岐等，1980;于善谦，1986)，主要分布于我国长江、黄河中下游和淮河流域，涵盖了我国小麦主要产区的大部分省区，包括四川、陕西、江苏、浙江、安徽、湖北、山东和河南等省，其中江苏省的里下河地区和宁镇扬丘陵地区、山东半岛及潍坊和临沂等地区、河南信阳、南阳和驻马店等地区、湖北省东北沿大别山地区、陕西省渭河流域关中地区发生较重(Han etal.，2000)。自90年代以来每年该病发生面积都达66.67万公顷以上，2005年仅江苏省发生面积达4.636万公顷，危害日趋严重。一般病田减产10-30%，严重地达70-80%，一些发病严重的田块甚 至绝收(孙谦等，1992)。目前，小麦黄花叶病已成为我国小麦生产上的重要病毒病害之一。
[0004]在我国小麦黄花叶病害的病原是小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaicvirus, WYMV)，基因组是由两条正义单链RNA组成，属马铃薯Y病毒科(Potyviridae),大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)。在自然条件下，WYMV是由根肿菌目多粘菌属的禾谷多粘菌(Polymyxa graminis)传播(Barr, et al., 1988)。过多年对WYMV的研究，已经获得了一些有关小麦黄花叶病毒分子生物学特性的研究结果(Chen et al., 2000a;Chen etal., 2000b; Namba et al., 1998; Yu et al.，1999;董家红等，2003;于嘉林等，1995)。对于RNA2编码的P2蛋白的功能尚不确定。
【发明内容】
[0005]本发明的一个目的是提供如下物质在调控植物抗病性中的应用。
[0006]本发明提供的如下I) -3)中任一种物质在调控植物抗病性中的应用:1)蛋白P2 ；2)编码蛋白P2的DNA分子；3)含有编码蛋白P2的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；[0007]所述蛋白P2的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0008]上述应用中，所述编码蛋白P2的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列I ;
[0009]所述含有编码蛋白P2的DNA分子的重组载体为将所述编码蛋白P2的DNA分子插入表达载体中，得到表达蛋白P2的重组载体。
[0010]在本发明的实施例中，表达载体为pActl.cas，重组载体为将序列I所示的核苷酸插入载体pActl.cas的Sma I位点得到的重组载体。
[0011 ] 上述应用中，所述调控植物抗病性为提高植物抗病性。
[0012]上述应用中，所述病为小麦黄花叶病,所述小麦黄花叶病的病原菌为小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus)；
[0013]所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。
[0014]本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0015]本发明提供的方法，为将编码蛋白P2的DNA分子导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物抗病性高于所述目的植物；
[0016]所述蛋白P2的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0017]上述方法中，所述病为小麦黄花叶病,所述小麦黄花叶病的病原菌为小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus)；
[0018]所述编码蛋白P2的DNA分子通过重组载体导入所述目的植物中；
[0019]所述编码蛋白P2的 DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列I。
[0020]上述方法中，所述重组载体为将所述编码蛋白P2的DNA分子插入表达载体中，得到表达蛋白P2的重组载体；在本发明的实施例中，表达载体为pActl.cas，重组载体为将序列I所示的核苷酸插入载体pActl.cas的Sma I位点得到的重组载体。
[0021]所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。
[0022]本发明的第三个目的是提供一种重组载体。
[0023]本发明提供的重组载体，为将编码蛋白P2的DNA分子插入表达载体中，得到表达蛋白P2的重组载体；在本发明的实施例中，表达载体为pActl.cas，重组载体为将序列I所示的核苷酸插入载体pActl.cas的Sma I位点得到的重组载体。
[0024]所述蛋白P2的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0025]上述重组载体中，所述编码蛋白P2的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列I。
[0026]本发明的实验证明，本发明将编码P2蛋白的DNA分子导入小麦中，得到转基因小麦，该转基因小麦的抗小麦黄花叶病大于非转基因小麦，且同时获得了对病毒病具有较强抗性的转基因小麦新品系，说明该蛋白抗小麦黄花叶病，从而对于减少病毒病危害，保障小麦稳产具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为植物表达载体p34的构建
[0028]图2为植物表达载体p34酶切鉴定
[0029]图3为转化各阶段植物状态及田间表型
[0030]A:小麦幼胚从未成熟胚中挑出置于培养基上；B:基因枪轰击前在高渗培养基上处理愈伤；C:基因枪轰击后恢复培养；D:抗性愈伤分化出小苗；E和F:小苗移到三角瓶生根；G:移栽到小盆中；H:子代在田间的表型，左为对照，右为转基因品系。
[0031]图4为转P2小麦植株TO代基因组PCR检测结果
[0032]图5为转P2小麦植株Tll代基因组PCR检测结果
[0033]图6为转P2小麦植株的PCR-Southern检测
[0034]图7为2004-2013年两个转P2小麦品系在病圃的病情指数线状图
【具体实施方式】
[0035]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037]实施例1、转P2小麦的培育
[0038]一、重组载体p34和质粒pAM2001获得
[0039]1、重组载体p34的制备
[0040]WY-8:5 ' -CTCAACCATATGGTCGGCTCAGCTGAGG-3'，与 WYMV RNA2 的 904 ~93Int(P2蛋白基因片段的I~28nt)对应，[0041 ] WY-9:5' -ATGCGGATCCCTAATGGCCCGG-3'，与 WYMV RNA2 的 2881 ~2860nt(P2 蛋白基因片段的1978~1957nt)互补。人工合成序列I所示的DNA分子为模板，用引物WY-8和WY-9进行PCR扩增，得到1978bp的PCR产物。
[0042]经过测序，该PCR产物具有序列表中序列I所示的核苷酸(编码区为序列表中序列I自5'末端第10-1968位核苷酸)，为P2蛋白全长基因P2，该基因编码的蛋白为P2，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
[0043]将上述PCR产物用Sma I切平，与经过Sma I酶切的载体pActl.cas(CAMBIA, TG0063)连接，得到重组载体p34，载体构建策略见图1。该载体为将序列表中序列I所示的核苷酸插入载体pActl.cas的Sma I位点得到的重组载体。
[0044]分别用Hind III和Pst I对重组载体p34进行单酶切鉴定，结果如图2所示，p34用Hind III酶切(p34/H)后可以得到6.2kb和0.5kb两条带，p34用Pst I酶切(p34/p)后可以得到6.2kb、0.5kb和0.1kb的三条带(见图2)。说明载体构建正确。
[0045]2、ρΑΜ2001 质粒
[0046]pAM2001质粒，公众可从中国农业大学获得,记载在如下文献中:董槿,抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的研究，中国农业大学，博士学位论文，2004。
[0047]二、用于基因枪轰击的小麦愈伤及基因枪微弹的准备
[0048]1、幼胚准备
[0049]由于小麦的品种，及天气如温度、光照的影响，小麦开花后籽粒发育到适合转化的时间的不同，应当注意观察籽粒的灌浆情况。
[0050]I)扬麦11(记载在如下文献中:高德荣等，《安徽农业科学》，2000，28(6):759-760,公众可从中国农业大学获得；以下也成为野生型小麦)开花后，15d左右的幼胚最适合做转化。将正合适的麦穗剪下，剥出饱满籽粒，置于灭过菌的三角瓶中，待消毒，此后的操作在超净工作台内完成；
[0051]2)先用70%乙醇表面消毒2min，用灭过菌的蒸馏水漂洗一次；
[0052]3)加入适量的次氯酸钠溶液(I体积次氯酸钠原液:I体积灭菌蒸馏水)，加一滴Tween20，置于摇床，室温下慢速振荡20min ；
[0053]4)再用灭菌蒸馏水洗5次，将多余的水分控出，便可用于挑胚；
[0054]5)用解剖针挑出籽粒尖端的幼胚，盾片面向上，置于含有2mg/L2，4_D的MSD2诱导培养基上，27°C暗培养7d，盾片周围有愈伤出现，得到幼胚愈伤组织，即可用于转化(图3-A)。
[0055]2、基因枪微弹的制备
[0056]称取金粉8mg (供射击50次使用)，放入一只灭菌的1.5mL离心管中，加入1.5mL无水乙醇,在镟润混合器上剧烈振荡IOmin,静置5min, 12, OOOrpm离心Imin,用移液器小心
吸弃上清，重复上述步骤三次；
[0057]加入1.5mL灭菌的蒸馏水，高强度振荡重新悬浮，静置lmin，12，OOOrpm离心lmin，
用移液器小心吸弃上清，重复上述步骤三次；
[0058]加入1.0mL灭菌的50%甘油，重新悬浮，品均分配到20支0.5mL的离心管中(每管50 μ L，可供射击4次使用)，可在-20°c存放；
[0059]轰击用微弹制备方法如下:按照1.0 μ g质粒DNA/轰击(质粒DNA为由质粒PAMM2001和上述I制备的重组载体p34等体积混合的质粒DNA)、80 μ g金粉/轰击的比例，加入十倍于DNA体积的2.5M CaC12，加入四倍于DNA体积的亚精胺，震荡5min，12，OOOrpm离心lmin,吸弃上清后,加入1.5mL70%乙醇,振荡悬浮，12，OOOrpm离心lmin,吸弃上清后，加入1.5mL70% 乙醇,振荡悬浮，12，OOOrpm离心lmin,吸弃上清,反复洗三次。按照10 μ L/轰击的比例，加入无水乙醇，振荡悬浮备用。
[0060]3、基因枪轰击转化获得转ρ2小麦
[0061]I)试剂制备
[0062](I)、基因枪耗材
[0063]金粉、阻拦网(可多次使用)、微弹载体(一次性使用)、易裂片(1100PSI，一次性使用)等均购自美国Bio-Rad公司。
[0064](2)、试剂的配制
[0065]2.5mol/L CaC12,过滤灭菌,分装在1.5mL离心管中，_20°C保存；
[0066]0.lmol/L亚精胺，过滤灭菌，分装在1.5mL离心管中，_20°C保存；
[0067]50%的甘油溶液，高压灭菌，_20°C保存；
[0068]无水乙醇，原液；异丙醇，原液；灭菌的蒸馏水。
[0069](3)、培养基的配制
[0070]表1为MS基本培养基
[0071]组分母液
大量营养成分(20x)50 ml/L
微量营养成分(400χ)2.5 ml/L
有机物(400x)2.5 ml/L
Fe 盐溶液(200x)5 ml/L
抗坏血酸0.1 g/L
蔗糖30 g/L pH 5.8
[0072]高压灭菌115°C, 15min。
[0073]MS高渗培养基:MS基本培养基，其中C源为12%的蔗糖；
[0074]MS低渗培养基:MS基本培养基，其中C源为6%的蔗糖；
[0075]2)、基因枪轰击
[0076]轰击前将上述I获得的幼胚愈伤组织集中置于含12%蔗糖的MS高渗培养基上，进行高渗处理12h (见图3-B)，操作步骤如下:
[0077](I)打开超净工作台，用70%乙醇擦拭超净工作台和基因枪表面及内部，打开紫外灯，灭菌30min ；
[0078](2)将微弹载体、阻拦网等置于70%乙醇中lmin，放在滤纸片上吹干；
[0079](3)用移液器吸取10 μ L制备好的轰击用微弹，均匀地涂在微弹载体的内圈，在超净工作台内吹干；
[0080](4)打开氦气瓶阀门，调节压力至1300psi ；
[0081](5)将易裂片置于异丙醇中浸泡，再放入相应的装置内，安装固定在基因枪内室的顶部；
[0082](6)阻拦网、微弹载体放入对应的装置内，安装固定好；
[0083](7)把培养皿放在托盘上，使幼胚愈伤组织集中对应于托盘中间的圆圈内，将托盘插入到数第一档，打开皿盖，管好仓门；
[0084](8)打开基因枪电源，打开真空泵，按下真空键(Vac)，当真空表读数达到28mm Hg时，将按键置于Hold档，按下射击按钮(Fire)直到射击结束为止；
[0085](9)按下放气键，待真空表读数回零后，打开仓门，盖上皿盖，取出皿，旋开装载易裂片的装置，取出易裂片，旋开装载微弹载体的装置，取出微弹载体与阻拦网；
[0086](10)重复上述步骤((5)- (9))轰击其它幼胚愈伤组织，直至完成所有材料。关闭基因枪、真空泵、氦气瓶阀门，整理好仪器和材料，得到轰击过的小麦胚愈伤组织。
[0087]3)转基因后愈伤的再分化及再生苗的结实
[0088](I)、基因枪转化后的恢复处理
[0089]基因枪轰击结束之后，将轰击过的小麦胚愈伤组织转接到MS含6%的蔗糖的低渗培养基上，25°C光照16h，22°C黑暗8h恢复培养一周(见图3C)。
[0090](2)、再分化和再生苗的结实[0091]a) —周后小麦胚愈伤组织转接到MSNa5Ka5G25促进愈伤组织再分化，筛选阳性转化体(见图3-D)；
[0092]b) 一至两周后，将长出绿色芽的愈伤组织，转移到MSNa3G25培养基上25°C光照16h，22°C黑暗8h培养，促进外植体生根(见图3E)；
[0093]c)当小苗长高后，转移到含1/2MS培养基的培养瓶中生长，继续促进生根壮苗(见图 3F)；
[0094]d)小苗在培养瓶中根长得较长，苗长得较壮时，可将小苗移至含有灭菌的细沙与灭菌土 1:1混合的小花盆中生长，移苗前注意洗净培养基和未分化的愈伤块，移苗后注意保持高湿度，控制温度在25°c以下(见图3G)；
[0095]当小苗在小花盆中生长良好，可将小苗移至大的花盆或大田中生长(图3H)，注意水肥管理，防治蚜虫、小麦条锈、小麦叶锈等有害生物；小麦抽穗、开花，收获种子，得到4株TO代转P2小麦。
[0096]4、转P2小麦的分子检测
[0097]1) PCR 鉴定
[0098]CTAB法提取TO代转P2小麦的叶片的基因组DNA为模板(50ng/μ 1)，以WY-50/WY-50为引物进行PCR检测。
[0099]WY-50:5/ -TGACCACTGGATTACAAGCAGG-3'，与 Ρ2 蛋白基因片段的 63_84nt (RNA2的 966-987nt)对应，
[0100]WY-51:5 ' -ATCAGCAGTAGCGTTTCTGGCT-3 '，与 P2 蛋白基因片段的489-5IOnt (RNA2 的 1413_1392nt)互补。
[0101]结果如图4所示，泳道2-8为TO代转P2小麦，可以看到，得到448bp的PCR产物为阳性TO代转P2小麦。
[0102]将该PCR产物经Pst I酶切，得到预期长度相符的长为408bp和40bp的两条带。
[0103]经过上述PCR和酶切鉴定，得到的4株TO代转P2小麦均为PCR鉴定阳性TO代转P2小麦。
[0104]将PCR鉴定阳性TO代转P2小麦播种、培育，传代，分别得到Tl-Tll代转P2小麦。
[0105]从Tl代-11代，均按照上述方法进行PCR鉴定，结果得到448bp的PCR产物的均为阳性。Tll代转P2小麦的PCR鉴定结果如图5所示，I和2为空白对照，3_17为Tll代转P2小麦，可以看到，得到 448bp的PCR产物为PCR鉴定阳性Tll代转P2小麦。
[0106]2)、Southern blotting
[0107]1)转印方法及装置
[0108]本实验使用真空转印的方法，使用785真空转印装置(BIO-RAD，USA)完成。真空转移是利用真空作用造成的经过凝胶的液流，凝胶中的DNA片段跟随液流沉积在膜上。785真空转印装置能够在低压真空状态下迅速的将DNA从琼脂糖凝胶上转印到尼龙膜上。
[0109]2)真空转印
[0110]在装有0.25N HCl的托盘中使胶脱嘌呤15min。使溶液没过胶面并轻摇；去除盐酸溶液，用去离子水冲洗两次；0.5N NaOH溶液中使胶变性30min，使溶液没过胶面并轻摇；通过碱转法将胶转移至碱性溶液中(0.5N NaOH, 1.5M NaCl),裁减好合适尺寸的转移用膜和滤纸，按照真空转印装置说明装置凝胶和XL膜(GE，USA)，保持5英寸汞柱的压力，处理胶90min，结束后，尼龙膜晾干保存，继而进入杂交步骤。
[0111]3)制备杂交用探针
[0112]以WY50/51为引物，用p34为模板，进行PCR扩增，得到448bp的片段为探针。取适量PCR鉴定阳性的Tll代转P2小麦叶片的基因组DNA作为模板(25_50ng)，加入一定量的ddH20，混匀，于95-100°C加热5-10min，冰上迅速冷却；然后按下表2依次加入:
[0113]表2为杂交用探针所需体系
【权利要求】
1.如下1)-3)中任一种物质在调控植物抗病性中的应用: O蛋白P2 ； 2)编码蛋白P2的DNA分子； 3)含有编码蛋白P2的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌； 所述蛋白P2的氨基酸序列为序列表中的序列2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述编码蛋白P2的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列I ; 所述含有编码蛋白P2的DNA分子的重组载体为将所述编码蛋白P2的DNA分子插入表达载体中，得到表达蛋白P2的重组载体。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述调控植物抗病性为提高植物抗病性。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于:所述病为小麦黄花叶病，所述小麦黄花叶病的病原菌为小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus)； 所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。
5.一种培育转基因植物的方法，为将编码蛋白P2的DNA分子导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物抗病性高于所述目的植物； 所述蛋白P2的氨基酸序列为`序列表中的序列2。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于:所述病为小麦黄花叶病,所述小麦黄花叶病的病原菌为小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus)； 所述编码蛋白P2的DNA分子通过重组载体导入所述目的植物中； 所述编码蛋白P2的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列I。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于: 所述重组载体为将所述编码蛋白P2的DNA分子插入表达载体中，得到表达蛋白P2的重组载体； 所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体为小麦。
8.一种重组载体，为将编码蛋白P2的DNA分子插入表达载体中，得到表达蛋白P2的重组载体； 所述蛋白P2的氨基酸序列为序列表中的序列2。
9.根据权利要求8所述的重组载体，其特征在于:所述编码蛋白P2的DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列I。
【文档编号】A01H5/00GK103725708SQ201410014455
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月13日 优先权日:2014年1月13日
【发明者】于嘉林, 陈秀兰, 何震天, 韩成贵, 李大伟, 张宗英, 董槿, 安家爽, 邓新, 孙倩, 张容, 王建华, 王锦荣, 张永亮, 王颖, 王献兵 申请人:中国农业大学