一种曲茎石斛组培快繁培养基及组培快繁方法
【专利摘要】本发明公开了一种曲茎石斛组培快繁培养基及组培快繁方法，培养基由七水硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸铵、四水硝酸钙、硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、五水硫酸铜、三氧化钼、七水硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠、6-苄基腺嘌呤、a-萘乙酸、琼脂、蔗糖、白砂糖，香蕉泥构成，所述培养基的pH值为5.6～5.8；组培快繁的方法包括：培养基的灭菌、种子萌发培养、增殖、生根培养、炼苗和移栽，该培养基及组培快繁的方法是针对曲茎石斛的特点，简便易行，组培苗芽丛健壮，无畸形，叶色浓绿，繁殖系数提高，繁殖周期短，约50天，培养效果好，成活率高。
【专利说明】一种曲茎石斛组培快繁培养基及组培快繁方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物的组培快繁方法领域，特别涉及一种曲茎石斛组培快繁培养基及组培快繁方法。
【背景技术】
[0002]曲茎石斛，茎圆柱形，稍回折状弯曲，叶2~4枚，互生于茎的上部，近革质，长圆状披针形，长约3厘米，花序从落了叶的老茎上部发出，具I~2朵花，花苞片浅白色，卵状三角形，长约3毫米，先端急尖；花梗和子房黄绿色带淡紫，花开展，中萼片背面黄绿色，上端稍带淡紫色，长圆形，花瓣下部黄绿色，上部近淡紫色，椭圆形，长约25毫米，中部宽13毫米，先端钝，具5条脉，花期5月，产河南(伏牛山区)、湖北(神农架地区)、湖南东部(衡山南岳)、四川南部(甘洛)，生于海拔1200~2000米的山谷岩石上。
[0003]石斛为《中华人民共和国药典》收载品种。属常用紧缺的中药材和中成药配方药。其药用价值首载于《神农本草经》，列为上品。石斛以茎入药，具有益胃生津、滋阴清热、止痛、清嗓、明目、降血脂、血压等功效，是生产“石斛夜光丸”、“石斛鲜露”、“石斛饮料”、“石斛胶囊”等产品的主要原料。以石斛为主要原料开发的“脉络宁”系列产品，被国家指定为全国各医院心血管疾病必备良药，石斛还广泛用于食品、美容、保健等领域。国内以石斛为原料的制药企业有160多家，年需求鲜石斛I万多吨。目前，石斛产品供不应求，价格呈稳中逐年上涨的发展趋势。
[0004]据《本草纲目》记载。石斛功效“除痹下气，补五脏虚痨，强阴益精，壮筋骨，暖水脏，补肾益力，轻身延年。”现代医学研究证明，石斛具有增强免疫力，抑制肿瘤细胞，抗衰老，抗疲劳，降血糖，促进血液循环，增强心肺功能等作用。野生药用石斛多附生在大树干上或石壁石缝间。喜温暖湿润和半阴半阳的气候环境。其开花虽多，结果却少，种子细如粉尘，仅0.3~0.4微克，需与真菌共生才能发芽。这就成了其在野生环境中再生能力非常弱。由于人类生活范围不断的扩大。加上长期的过度采摘。其生资源已濒临枯竭。列入《濒危野生动植物国际贸易公约》中。
[0005]近年来作为药用的石斛属植物日益被广泛关注，河南石斛、曲茎石斛因药用价值高被列入《中国药用石斛图志》，列入《河南省重点保护植物名录》，曲茎石斛多年来完全靠野生供药，野生资源越来越枯竭，自然药源濒临灭绝。
[0006]河南省西峡县具有得天独厚的气候环境条件，是曲茎石斛的地道产地和原产区。在种植方法上，当地药农延用传统方式，用野外挖掘和分株栽培，大量消耗曲茎石斛野生资源，导致种质资源稀缺，繁殖系数低，发展速度缓慢，栽种规模无法有效扩大。而且由于栽培技术落后、管理粗放简单，导致曲茎石斛的成活率低，生长周期长，产量低，效益差。
【发明内容】
[0007]为解决现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种曲茎石斛组培快繁
培养基。[0008]本发明的另一目的在于提供一种曲茎石斛组培快繁方法，该方法针对曲茎石斛的特点而设计，增殖速度快，成苗周期短，组培快繁效果好，成活率高。
[0009]本发明采用的技术方案如下:
一种曲茎石斛组培快繁培养基，其特征在于按每升蒸馏水中含有以下物质配制而成:七水硫酸镁300~350毫克、磷酸二氢钾250~300毫克、硫酸铵500~550毫克、四水硝酸钙800~1000毫克、硼酸0.05-0.15毫克、四水硫酸锰7.0-8.0毫克，七水硫酸锌0.25-0.45毫克、五水硫酸铜0.04-0.10毫克、三氧化钥0.01-0.03毫克、七水硫酸亚铁28~56毫克、乙二胺四乙酸二钠36-52毫克、6-苄基腺嘌呤0.2~3.0毫克、a_萘乙酸0.1~2.0毫克、琼脂5.0~5.2克、蔗糖15.0~15.5克、白砂糖15.0~15.5克，香蕉泥100~110克，所述培养基的PH值为5.6~5.8。
[0010]一种曲茎石斛组培快繁培养基，其特征在于按每升蒸馏水中含有以下物质配制而成:七水硫酸镁300毫克、磷酸二氢钾300毫克、硫酸铵550毫克、四水硝酸钙1000毫克、硼酸0.10毫克、四水硫酸锰7.5毫克、七水硫酸锌0.33毫克、五水硫酸铜0.04毫克、三氧化钥0.016毫克、七水硫酸亚铁28毫克、乙二胺四乙酸二钠37.3毫克、6-苄基腺嘌呤3.0毫克、a-萘乙酸2.0毫克、琼脂5.2克、蔗糖15.0克、白砂糖15.0克、香蕉泥100克，所述培养基的pH值为5.6。[0011]一种曲茎石斛的组培快繁方法，其特征在于按如下步骤操作:
(1)培养基的灭菌
将权利要求1所述的培养基在120~125°C，1.06~1.08kg/cm2的压力下进行灭菌20min ；
(2)种子萌发、茎段诱导与启动培养
将新鲜成熟未裂开的曲茎石斛果实，采取体积浓度为75%的酒精灭菌处理13秒钟，质量浓度为10%次氯酸钙处理20-30分钟，播入利用权利要求1所述曲茎石斛组培快繁培养基中，进行种子萌发培养和茎段启动培养，培养温度22-24°C，每日光照10-12小时，光照强度1800-2500LX，15-20天种胚开始萌动，25-30天种胚膨大，茎段基部膨大，形成绿色丛生芽；
(3)增殖、生根培养
萌发形成的绿色丛生芽分切后转入培养基，每隔25~30天，分割丛生芽，重复接种步骤进行增殖培养，分割丛生芽不可过小，需有3-4个芽为一丛；增殖培养期间进行暗处理，所述暗处理于接种后第I天进行，暗处理时间为7~10天；增殖一定量后将生长健壮的组培苗接种于培养基中进行生根培养，所述增殖、生根培养的条件为温度22±2°C，光照强度2000Lx，光照时间为12小时/天；
(4)炼苗和移栽
将生根的组培苗在温室中经过I~2天的半开玻璃瓶盖炼苗和3~5天的全开玻璃瓶盖炼苗；取出其中的组培苗，用清水洗净根系粘附的培养基，栽入穴盘，移栽基质为小树皮、苔藓和小石子体积比为2:3: 2的混合物；移栽初期的10~15天，保持温度24~27°C，相对湿度保持在90%以上。
[0012]本发明提供的曲茎石斛组培快繁培养基及组培快繁方法，针对曲茎石斛的特点，简便易行，组培苗芽丛健壮，无畸形，叶色浓绿，繁殖系数提高，繁殖周期短，约50天，培养效果好，成活率高。本发明采用独特的曲茎石斛组培苗生产技术和栽培方法，从一颗当地野生曲茎石斛蒴果培养出10万株以上的种苗，有效地解决了种苗的紧缺和来源问题；组培苗练苗、移栽成活率达到97%以上、产量提高40%以上的巨大成功，其先进性位居国内外同行研究及应用的前列，对濒危紧缺药用植物资源再生和持续利用具有重要意义，弥补了国内外这一领域的空白。成功解决了曲茎石斛种苗繁育技术，并按照曲茎石斛产地适宜性优化原则与其生态环境要求，在西峡县二郎坪镇选建曲茎石斛规范化种植与GAP试验示范基地，野外管理养护成活率极高。本发明方法对药材资源进行保护抚育与仿野生栽培，促进药材资源的可持续利用，可以为药材生产企业提供完备的曲茎石斛快速繁殖与养护管理技术规范，对促进生物多样性保护具有重要的现实意义。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
一种曲茎石斛组培快繁培养基，其特征在于按每升蒸馏水中含有以下物质配制而成:七水硫酸镁300毫克、磷酸二氢钾300毫克、硫酸铵550毫克、四水硝酸钙1000毫克、硼酸0.10毫克、四水硫酸猛7.5毫克、七水硫酸锌0.33毫克、五水硫酸铜0.04毫克、三氧化钥0.016毫克、七水硫酸亚铁28毫克、乙二胺四乙酸二钠37.3毫克、6-苄基腺嘌呤3.0毫克、a-萘乙酸2.0毫克、琼脂5.2克、蔗糖15.0克、白砂糖15.0克、香蕉泥100克，所述培养基的pH值为5.6。
[0014]利用该曲茎石斛组培快繁培养基对曲茎石斛的组培快繁方法，按下述步骤进行: 将配制好的培养基放入高为8.5厘米，口径为5.5厘米的玻璃瓶，每瓶50毫升，盖紧瓶
盖，在120~125。。,1.06 ~ 1.08kg/cm2的压力下进行灭菌20min,待用；
曲茎石斛苗5月中旬进行人工授粉，11月底取成熟发黄尚未开裂的果实，先用自来水冲洗，再用洗洁精刷洗每个缝隙，最后用流水冲洗30分钟，拿到超净工作台上进行灭菌，体积浓度为75%的酒精灭菌13秒，用质量浓度为10%次氯酸钙处理10-20分钟，无菌水冲洗3~4遍。
[0015]于超净工作台上将消毒后的果实切开，种子撒播于无菌培养基中，将其放入培养室进行增殖以及生根培养，培养条件为温度25±2°C，培养光源为28W直管型节能荧光灯，光照强度2000LX，光照时间为12小时/天，15-20天种胚开始萌动，25-30天种胚膨大，培养基上原球茎萌发出无菌丛生芽，切取丛生芽3-5个芽为一丛，接种于培养基中，不断继代增殖，增殖培养期间进行暗处理，所述暗处理于接种后第I天进行，暗处理时间为7~10天；增殖一定量后将生长健壮的组培苗接种于培养基中进行生根培养，所述增殖、生根培养的条件为温度22±2°C，光照强度2000LX，光照时间为12小时/天。
[0016]每年3月起出苗，生根的组培苗在温室中经过I~2天的半开玻璃瓶盖炼苗和3~5天的全开玻璃瓶盖炼苗，取出其中的组培苗，用清水洗净根系粘附的培养基，按照适宜性优化原则与其生态环境要求，栽入穴床，露地荫棚，移栽基质为小树皮、苔藓和小石子体积比为2:3: 2的混合物，移栽初期的10~15天，保持温度25~28°C，相对湿度保持在90%以上。移栽成活 率为92%，炼苗I年。一年后大苗转移到蛇绿岩+苔藓上用线卡固定，在适宜的温湿度和光照条件下按GAP质量规范管理。
[0017]采用本发明提供培养基以及组培快繁方法，培养出的曲茎石斛组培苗新生叶片叶形正常，叶色浓绿，姿态伸展。组培苗经炼苗移栽后，生长健壮，茎杆充实，新生苗曲茎石斛特征明显，在原产地仿野生栽培生长旺盛，人工授粉后结实繁多。
[0018]实施例2
一种曲茎石斛组培快繁培养基，其特征在于按每升蒸馏水中含有以下物质配制而成:七水硫酸镁350毫克、磷酸二氢钾250毫克、硫酸铵500毫克、四水硝酸钙800毫克、硼酸0.15毫克、四水硫酸猛7.0毫克,七水硫酸锌0.45毫克、五水硫酸铜0.10毫克、三氧化钥0.03毫克、七水硫酸亚铁56毫克、乙二胺四乙酸二钠52毫克、6-苄基腺嘌呤0.2毫克、a_萘乙酸0.1毫克、琼脂5.0克、蔗糖15.5克、白砂糖15.5克，香蕉泥105克，所述培养基的pH值为5.8。
[0019]利用曲茎石斛组培快繁培养基对曲茎石斛的组培快繁方法按实施例1中的方法进行快繁。
[0020]实施例3
一种曲茎石斛组培快繁培养基，其特征在于按每升蒸馏水中含有以下物质配制而成:七水硫酸镁330毫克、磷酸二氢钾270毫克、硫酸铵520毫克、四水硝酸钙900毫克、硼酸0.05毫克、四水硫酸锰8.0毫克，七水硫酸锌0.25毫克、五水硫酸铜0.07毫克、三氧化钥
0.01毫克、七水硫酸亚 铁46毫克、乙二胺四乙酸二钠36毫克、6-苄基腺嘌呤2.0毫克、a-萘乙酸0.6毫克、琼脂5.1克、蔗糖15.3克、白砂糖15.3克，香蕉泥110克，所述培养基的pH值为5.7。
[0021]利用曲茎石斛组培快繁培养基对曲茎石斛的组培快繁方法按实施例1中的方法进行快繁。
【权利要求】
1.一种曲茎石斛组培快繁培养基，其特征在于按每升蒸馏水中含有以下物质配制而成:七水硫酸镁300~350毫克、磷酸二氢钾250~300毫克、硫酸铵500~550毫克、四水硝酸钙800~1000毫克、硼酸0.05-0.15毫克、四水硫酸锰7.0-8.0毫克，七水硫酸锌0.25-0.45毫克、五水硫酸铜0.04-0.10毫克、三氧化钥0.01-0.03毫克、七水硫酸亚铁28~56毫克、乙二胺四乙酸二钠36-52毫克、6-苄基腺嘌呤0.2~3.0毫克、a-萘乙酸0.1~2.0毫克、琼脂5.0~5.2克、蔗糖15.0~15.5克、白砂糖15.0~15.5克，香蕉泥100~110克，所述培养基的pH值为5.6~5.8。
2.根据权利要求1所述的一种曲茎石斛组培快繁培养基，其特征在于按每升蒸馏水中含有以下物质配制而成:七水硫酸镁300毫克、磷酸二氢钾300毫克、硫酸铵550毫克、四水硝酸钙1000毫克、硼酸0.10毫克、四水硫酸锰7.5毫克、七水硫酸锌0.33毫克、五水硫酸铜0.04毫克、三氧化钥0.016毫克、七水硫酸亚铁28毫克、乙二胺四乙酸二钠37.3毫克、6-苄基腺嘌呤3.0毫克、a-萘乙酸2.0毫克、琼脂52克、蔗糖150克、白砂糖150克、香蕉泥100克，所述培养基的pH值为5.6。
3.一种曲茎石斛的组培快繁方法，其特征在于按如下步骤操作: (1)培养基的灭菌 将权利要求1所述的培养基在120~125°C，1.06~1.08kg/cm2的压力下进行灭菌20min ； (2)种子萌发、茎段诱导与启动培养 将新鲜成熟未裂开的曲茎石斛果实，采取体积浓度为75%的酒精灭菌处理13秒钟，质量浓度为10%次氯酸钙处理20-30分钟，播入利用权利要求1所述曲茎石斛组培快繁培养基中，进行种子萌发培养和茎段启动培养，培养温度22-24°C，每日光照10-12小时，光照强度1800-2500LX，15-20天种胚开始萌动，25-30天种胚膨大，茎段基部膨大，形成绿色丛生芽； (3)增殖、生根培养 萌发形成的绿色丛生芽分切后转入培养基，每隔25~30天，分割丛生芽，重复接种步骤进行增殖培养，分割丛生芽不可过小，需有3-4个芽为一丛；增殖培养期间进行暗处理，所述暗处理于接种后第I天进行，暗处理时间为7~10天；增殖一定量后将生长健壮的组培苗接种于培养基中进行生根培养，所述增殖、生根培养的条件为温度22±2°C，光照强度2000Lx，光照时间为12小时/天； (4)炼苗和移栽 将生根的组培苗在温室中经过I~2天的半开玻璃瓶盖炼苗和3~5天的全开玻璃瓶盖炼苗；取出其中的组培苗，用清水洗净根系粘附的培养基，栽入穴盘，移栽基质为小树皮、苔藓和小石子体积比为2:3: 2的混合物；移栽初期的10~15天，保持温度24~27°C，相对湿度保持在90%以上。
【文档编号】A01H4/00GK103931496SQ201410129938
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】胡如善, 杨玉珍, 孙廷 , 申琳 申请人:河南省南阳农业学校