一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养方法

一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养方法，从田间或盆钵中剪取的用玉米花粉授粉24小时后的麦穗，用100mg/L2,4-D溶液喷穗后，插入盛有穗培养液的容器中置于人工气候箱进行昼夜连续培养，培养3天后进行第一次穗培养液更换，再培养3天后进行第二次更换，接着培养4天后进行第三次更换，直到培养结束，从开始培养到培养结束的13-14天中，每次更换穗培养液时，用量为培养液淹没麦穗茎秆2-3cm，每次更换穗培养液时需对麦穗茎秆和叶片进行处理，先用剪刀将麦穗基部茎秆至少剪去2-3cm，剪成平口，再剔除茎秆基部未着生在茎节上的叶片。采用本发明方法单倍体胚诱导率可达到70％以上，且胚发育好。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业【技术领域】，涉及一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养 方法。 一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗罔体培养方法

【背景技术】
[0002] 通过小麦X玉米杂交及杂交后玉米染色体的消失获得小麦单倍体，是目前国内 外产生小麦单倍体效率最高的途径之一。小麦单倍体及其染色体加倍后的加倍单倍体（也 称"双单倍体"），在相关基础研究和育种中具有重要应用价值，尤其可加速小麦育种进程、 缩短小麦新品种的培育时间。
[0003] 获得较高而且稳定的小麦单倍体胚诱导率，是小麦X玉米杂交单倍体诱导技术 应用的第一个关键环节。单倍体胚诱导率，也称成胚率、得胚率，是指用玉米花粉每授粉 100个去雄的小麦小花能得到的小麦单倍体胚个数，它是判断小麦X玉米杂交单倍体胚 诱导效率的主要技术指标。最初，小麦X玉米杂交后的麦穗是留在田间或温室植株上生 长，一直到单倍体胚生长到0.4-1. 5cm大小时再取穗、剥胚、进行胚培养。但在田间生长 时，单倍体胚的诱导、发育、生长易受复杂多变的自然温、光、雨（水）等条件的影响，导致 小麦单倍体胚诱导率极不稳定，在温室植株上生长也较占空间，后来经进一步研究证实，对 小麦X玉米杂交后的麦穗进行离体培养是稳定单倍体胚诱导率最有效的技术措施。最 初Laurie (1986)采用的是小穗培养，即把每个穗子上的15-20个小穗剥下来在人工控制 条件下于培养基中培养，但具体操作较费工、时且成本较高，很难处理成百上千的大批量麦 穗；后来 Riera-Lizarazu (1992)、Suenaga (1997)、Najia Saidi (1997)、Inagaki (1998)、 Mujeeb-Kazi (2006)、Muhammad Ahsan Khan (2011)、Makhdoom Hussain (2012)在普通小麦 与玉米杂交诱导普通小麦产生单倍体中均采用了剪穗（或称"割穗"）离体培养，方法是： 在小麦抽穗后去雄前把穗子（主穗和分蘖穗）分批从植株上剪下来，剪取长度为35-50cm， 保留剑叶、去除多余叶片，然后放在自来水中培养、去雄，1-2天后用玉米花粉授粉，再放到 盛有穗培养液（2, 4-D100mg/L+蔗糖40-50g/L+亚硫酸6-8ml/L)的容器中培养3天，然 后移到不含2, 4-D的穗培养液（40-50g/L蔗糖+6-8ml亚硫酸）中继续培养10-12天，每 2-3天把容器中的培养液补充、加满，培养温度为20-22°C、光照长度为14-16小时、相对湿 度为60-65 %，光照强度除Muhammad Ahsan Khan报道为lOOOOLux外其它研究均未报道； Cherkaoui (2000)在硬粒小麦X玉米杂交诱导硬粒小麦产生单倍体时，去雄、授粉前不 剪穗，授粉后才将麦穗沿基部从植株上剪下来，放在穗培养液（2, 4-D100mg/L+40g/L蔗糖 +10ml/L乙醇）中培养10-18天；Najia Saidi (1997)则在授粉4天后才将麦穗从第三个 节间处（自顶部往下数）剪回，先用70%的酒精擦洗，再插入盛有培养液（霍格兰氏营养 液+2, 4-D100mg/L+40g/L蔗糖+10ml/L乙醇）的容器中培养，每2天更换一次培养液，培养 条件是：光照16小时，昼/夜的温度为22°C /18°C，相对湿度为80%，培养期15天；蔡华等 (2005)将授粉后的麦穗连同茎杆一起剪下，插入含2, 4-D100mg/L+蔗糖40-50g/L+亚硫酸 8ml/L营养液的大烧杯中进行离体培养，培养温度20°C，光照时间12小时、强度3000LUX， 相对湿度70%，离体培养14天。
[0004] 上述麦穗离体培养研究报道的单倍体胚诱导率，除SUenaga(1997)报道的为 24. 1-35. 8%和 Mujeeb-Kazi (2006)的平均为 25%、蔡华等（2005)为 26. 3-34. 0%较高外， 其余变幅为0-29%，绝大多数均低于20% ;Najia Saidi (1997)虽然用了最复杂、营养最丰 富的营养液，但其单倍体胚诱导率平均仅为0-11. 7%。分析其原因，除了小麦玉米基因型差 异外，去雄前就将麦穗剪回虽然方便了去雄和套袋处理，但麦穗在营养较缺乏的自来水中 生长1-2天会影响植株的功能；更重要的是，所有的研究报道在第一次从母体植株上剪穗 后都是一直培养到取穗剥胚，中间没有再进行第二次、第三次剪麦穗茎杆的报道，根据我们 的多年观察，由于离体培养的麦穗没有根，吸收营养全靠莖杆，在培养液中培养3-4天，莖 杆基部都会不同程度地被培养液腐蚀，如不及时剪去被腐蚀的基部茎杆，随着时间的延长， 基部茎杆腐蚀越来越严重，麦穗越来越难以从营养液中吸收养分和水分，从而导致叶片在 培养中期即开始变黄，随后很快枯死，叶片光合作用、呼吸作用受损或中止，培养液中的水 分和养分难以运输到穗部，使颖果（是小麦与玉米杂交后形成的类似小麦籽粒的器官，小 麦单倍体胚生长发育所需的全部营养来自于颖果）瘦小、干瘪枯黄，直接影响单倍体胚的 发育和活力，有的胚甚至夭亡，最终导致单倍体诱导率低。此外，除Najia Saidi (1997)的 研究外，其余研究都没有在麦穗培养期间更换培养液，只是不断添加，这对培养液的质量、 渗透压等都带来负面影响，同时还增强了培养液对茎杆的腐蚀性或毒害。因此，小麦X玉 米杂交后的麦穗离体培养方法细节，看似简单，实际上对小麦单倍体胚诱导率的高低和效 率影响极大。


【发明内容】

[0005] 为了克服现有技术中存在的缺陷，稳定和提高小麦X玉米杂交单倍体胚的诱导 率，借助云南昆明夏季自然条件下小麦玉米可同季大量种植的自然优势，通过多年的试验 研究与实践验证，本发明提供一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养方法。其技 术方案如下：
[0006] -种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养方法，从田间或盆钵中剪取的用 玉米花粉授粉24小时后的麦穗，用100mg/L2, 4-D溶液喷穗后，插入盛有穗培养液的容器中 置于人工气候箱进行昼夜连续培养，培养3天后进行第一次穗培养液更换，再培养3天后进 行第二次更换，接着培养4天后进行第三次更换，直到培养结束，从开始培养到培养结束的 13-14天中，每次更换穗培养液时，用量为培养液淹没麦穗茎杆2-3cm，每次更换穗培养液 时需对麦穗茎杆和叶片进行处理，先用剪刀将麦穗基部茎杆至少剪去2-3cm，剪成平口，再 剔除茎杆基部未着生在茎节上的叶片。
[0007] 进一步优选，在更换穗培养液时，包括以下步骤：
[0008] (1)从人工气候箱中把麦穗连同装培养液的容器一起取出来放于室内，再从容器 中取出麦穗插于盛有少量自来水的塑料桶内；防止麦穗脱水。
[0009] (2)把容器中的穗培养液全部倒入废旧培养液回收桶中，用自来水将容器冲洗一 次，再把新穗培养液装入容器中，培养液在容器中的深度为l-2cm ;
[0010] (3)用剪刀将麦穗基部茎杆至少剪去2-3cm，剪成平口，同时剔除茎杆基部未着生 在茎节上的叶片，然后将麦穗插回盛有新穗培养液的容器中；
[0011] (4)补充容器中的穗培养液至淹没麦穗茎杆2-3cm的深度，把装有麦穗的容器重 新放回人工气候箱中继续培养。
[0012] 优选地，所述13-14天中，昼和夜的时间长度均为12小时，昼和夜培养的温度、相 对湿度、光照参数分别为 23°C、80% ±5%、4000Lux 和 23°C、80% ±5%、0Lux。
[0013] 本发明小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养方法中，所述小麦为普通小 麦，麦穗包括小麦穗子连同其整个地上部莖杆。
[0014] 本发明的有益效果：2008年夏季以来，累计用该方法培养小麦X玉米杂交麦穗 5000余穗，到培养结束（第13-14天）时，剑叶基本仍为绿色，仍具有较好的功能，颖果结实 率高达95% -100%，且新鲜、饱满的颖果占98%以上，5000余穗的单倍体胚诱导率平均稳 定在30%左右，最高的可达到70%以上，且胚发育好，大、中胚比例占80%以上，为下一步 胚培养、萌发奠定了良好基础。

【专利附图】

【附图说明】
[0015] 图1是本发明方法中麦穗离体培养期间穗培养液的更换间隔期流程示意图。

【具体实施方式】
[0016] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0017] 实施例1
[0018] 配制穗培养液：培养液配方详见《麦类作物学报》2008年第1期第1-5页。称取 100mg的2, 4-二氯苯氧乙酸（别名：2, 4-D，分析纯）于烧杯，加入50-60ml浓度为0· 1N的 氢氧化钠（用分析纯的氢氧化钠预先配制），用玻棒或搅拌器搅拌，使2, 4-二氯苯氧乙酸完 全溶解；用容量为l〇〇〇ml的容器量取600ml自来水，依次加入蔗糖（食用级）40g、磷酸二 氢钾（化学纯）3g、亚硫酸（分析纯）8ml、硝酸银（分析纯）10mg和已溶解的2, 4-二氯苯 氧乙酸；加自来水定容到1000ml，摇勻，倒入深色容器常温保存备用。
[0019] 2008年8月5日云南省农业科学院昆明试验基地，上午11 : 00对2天前去雄 的15个小麦材料的92个麦穗用新鲜玉米花粉授粉，8月6日上午11 : 00 (授粉24小时 后）将麦穗全部沿地表从田间剪回室内，去除杂交袋后用l〇〇mg/L2,4-D集中喷穗子，然后 将麦穗插入盛有穗培养液的容器，置于人工气候箱（宁波江南仪器厂，RXZ智能型）中昼 夜连续培养，对应的昼/夜光照、温度、湿度培养条件是：昼（8 : 00-20 : 00) 12小时/夜 (20 : 00-8 : 00) 12小时，昼/夜光照强度、温度、湿度参数分别为40001^?、231：、80% ±5%和0Lux、23°C、80% ±5%;8月9日（三天后）上午第一次更换穗培养液：将麦穗从容 器中取出，用剪刀将麦穗茎杆基部剪去约3cm，同时剔除基部未着生在茎节上的叶片，用过 的培养液倒入专门的收集桶，用清水冲洗容器1-2次，将清理好的麦穗重新插入容器，向容 器中加入此前配制的备用穗培养液，以淹没麦穗茎杆2-3cm为宜，然后放回人工气候箱中 继续培养，昼/夜光照强度、温度、湿度不变；8月12日第二次更换穗培养液，所有操作同第 一次更换；8月16日第三次更换穗培养液，所有操作同第一次更换；8月20日培养结束，取 出麦穗，剥下颖果，经消毒灭菌后在超净工作台上用解剖镜剥单倍体胚，得到的单倍体胚接 种于大量元素减半的1/2MS培养基培养，使单倍体胚萌发成单倍体苗；92个麦穗共有2999 个小花，得到2954个颖果，颖果结实率达98. 5%，从中剥得983个单倍体胚，平均单倍体胚 诱导率为32. 8%。
[0020] 实施例2
[0021] 湖北省农业科学院植保土肥研究所喻大昭教授提供2个小麦杂交组合匕代种子， 2009年6月播种于云南省农业科学院昆明试验基地，目的是用小麦X玉米杂交单倍体诱导 技术构建2个加倍单倍体群体，用于小麦抗白粉病基因的遗传与基因定位研究，要求每个 群体至少获得300个加倍单倍体植株。
[0022] 2009年8月11日对第一批去雄的154个麦穗进行授粉，穗培养液配方及其配制方 法、室内离体培养方法与实施实例1完全相同。8月26日培养结束，154个麦穗共有4781个 小花，得到4613个颖果，在解剖镜下剥得1587个单倍体胚，平均单倍体胚诱导率为33. 2 %; 通过两批去雄、授粉、穗培养和胚培养，一次单倍体瓶苗移栽及单倍体苗的染色体加倍，力口 倍处理后的苗带到武汉直接移栽到湖北省农业科学院植保土肥研究所武汉科研试验基地， 2010年5月，两个群体分别得到822个和755个加倍单倍体植株。
[0023] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，本发明的保护范围不限于此，任何熟 悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简 单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1. 一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养方法，其特征在于，从田间或盆钵 中剪取的用玉米花粉授粉24小时后的麦穗，用100mg/L2, 4-D溶液喷穗后，插入盛有穗培养 液的容器中置于人工气候箱进行昼夜连续培养，培养3天后进行第一次穗培养液更换，再 培养3天后进行第二次更换，接着培养4天后进行第三次更换，直到培养结束，从开始培养 到培养结束的13-14天中，每次更换穗培养液时，用量为培养液淹没麦穗茎杆2-3cm，每次 更换穗培养液时需对麦穗茎杆和叶片进行处理，先用剪刀将麦穗基部茎杆至少剪去2-3cm， 剪成平口，再剔除茎杆基部未着生在茎节上的叶片。
2. 根据权利要求1所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养方法，其特征在 于，在更换穗培养液时，包括以下步骤： (1) 从人工气候箱中把麦穗连同装培养液的容器一起取出来放于室内，再从容器中取 出麦穗插于盛有少量自来水的塑料桶内； (2) 把容器中的穗培养液全部倒入废旧培养液回收桶中，用自来水将容器冲洗一次，再 把新穗培养液装入容器中，培养液在容器中的深度为l-2cm ; (3) 用剪刀将麦穗基部茎杆至少剪去2-3cm，剪成平口，同时剔除茎杆基部未着生在茎 节上的叶片，然后将麦穗插回盛有新穗培养液的容器中； (4) 补充容器中的穗培养液至淹没麦穗茎杆2-3cm的深度，把装有麦穗的容器重新放 回人工气候箱中继续培养。
3. 根据权利要求1所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养方法，其特征在 于，所述13-14天中，昼和夜的时间长度均为12小时，昼和夜培养的温度、相对湿度、光照参 数分别为 23°C、80% ±5%、4000Lux 和 23°C、80% ±5%、0Lux。
4. 根据权利要求1所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养方法，其特征在 于，所述小麦为普通小麦，麦穗包括小麦穗子连同其整个地上部莖杆。
【文档编号】A01H4/00GK104082144SQ201410314779
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月3日 优先权日:2014年7月3日
【发明者】顾坚, 李绍祥, 刘琨, 杨木军, 李宏生, 田玉仙, 丁明亮, 赵红 申请人:云南省农业科学院粮食作物研究所