技术领域：
本发明属于植物疫苗领域，具体涉及一种绿藻寡糖植物疫苗及其制备方法。
背景技术：
：植物疫苗是指能诱导植物产生抗性,从而抵抗病原菌入侵,抑制病原微生物生长,使植物免遭病害或减轻病害的一类生物或非生物的物质,主要有弱毒、无毒株系疫苗,活菌疫苗,蛋白类疫苗,寡糖疫苗,小分子及其它代谢产物疫苗,转基因植物疫苗。目前在生产上应用较多的有氨基寡糖素、激活蛋白、枯草芽孢杆菌、渝峰99植保等。目前世界几家农化公司已经相继开发出了商品化的植物抗病诱导剂。美国EdenBioscienes公司的Messenger有效成分源于火疫病菌（Erwiniaamylovory）中的harpin蛋白，用于防治柑桔、胡椒、番茄、黄瓜等白粉病。近年来瑞士先正达公司的植物抗病诱导剂Actigard可与杀菌剂混用防治西瓜霜霉病，能够显著提高杀菌剂的效果，大大降低化学农药的使用量。韩国旭成化学公司的Chitosan来源于虾蟹等生物的外壳，用于处理种子，具有防病增产作用。近年来，植物免疫诱抗药物在我国也获得了迅速发展。作为一类新型的多功能生物制品，寡糖、脱落酸等已在国内管理部门登记注册，并得到大面积的推广应用。然而以绿藻浒苔为原料，开发寡糖植物疫苗的产品还未见报道。CN103449892A公开了一种植物疫苗，其配方组合，粉剂：黄芪多糖1-2份，壳寡糖0.5-1份，芦荟甙1-2份，微硅粉5-20份，光合诱导素0.3-0.7份，茶皂素0.1-0.3份。水剂：是把以上配方组合起来，溶入纯度25％-50％的乙醇中，药物比例占2％-3％，瓶装即可得到植物疫苗。能使植物产生诱导抗体，抵抗病原菌的入侵，抑制病源微生物的生长，使植物免生病害或减轻病害。《利用植物疫苗及生长调节剂缩节胺控制棉花黄萎病》研究了植物疫苗渝峰99植保、激活蛋白、氨基寡糖素单独使用及与植物生长调节剂缩节胺混合使用对棉花黄萎病的防治效果,并选择激活蛋白和缩节胺混合施用研究了不同施药时间和施药次数对棉花黄萎病的防治效果。结果表明:渝峰99植保、激活蛋白、氨基寡糖素和缩节胺单独使用,以缩节胺防治效果最好(平均防效41.3%),其次是激活蛋白(平均防效36.7%)。3种植物疫苗和缩节胺混合使用均可不同程度地提高防治效果,渝峰99植保+缩节胺、激活蛋白+缩节胺、氨基寡糖素+缩节胺的平均防效分别为52.9%、52.2%、47.9%。技术实现要素：本发明提供一种绿藻寡糖植物疫苗及其制备方法，所述的植物疫苗是由天然绿藻浒苔为原料经精准提取制备的浒苔寡糖和昆布氨酸组成，通过控制反应条件，产生不同大小的寡糖，其能诱导植物的某些与抗病抗逆相关分子的基因的表达，从而提高植物的抗逆性。浒苔寡糖疫苗能够显著刺激植物的免疫系统反应，在抗小麦全锈病和抗小麦纹枯病中的应用中效果显著。本发明是通过以下技术方案实现的：一种绿藻寡糖植物疫苗，其活性组分是由浒苔寡糖和昆布氨酸组成，其中浒苔寡糖的制备方法具体包括以下步骤：1）预处理：干浒苔粉碎至20目以下，加入10倍重量的自来水，投入提取罐中进行提取；2）降解：向提取罐中加入浒苔重量比的2～10%氢氧化钾、0～2%高锰酸钾、0～2%EDTA-2Na,并逐渐升温至90～100℃提取0.5～4h；3）中和：将降解液用酸中和至6.0～7.0；4）纯化：将降解液过滤或离心，将得到的滤液或离心液依次通过截留分子量为2000-3500Da和300-500Da的纳滤膜，截取分子量300-2000Da的部分，得纳滤浓缩液；5）干燥：纳滤浓缩液进一步浓缩至固形物含量为25-35%，喷雾干燥，即可得到浒苔寡糖。优选地，所述的浒苔寡糖和昆布氨酸中重量份数比为3-5:1。进一步优选地，所述的浒苔寡糖和昆布氨酸中重量份数比为4:1。优选地，所述步骤2）中氢氧化钾加入量为5%，高锰酸钾加入量为1%、EDTA-2Na加入量为1%；所述降解最佳条件为降解温度95℃，降解时间3h。优选地，所述步骤3）中最适pH值为6.5。优选地，所述步骤4）中的过滤操作中滤布的目数为600-1000目；所述步骤4）中的离心操作中离心转速为3500转/分，离心时间为10min。申请人根据上述条件的组合对本发明的制备方法进行了深入研究，申请人发现，本发明最优选的一个实施方式中，所述的浒苔寡糖的制备方法具体步骤如下：1）预处理：将干浒苔粉碎至20目以下，加入10倍重量的自来水，投入提取罐中进行提取；2）降解：向提取罐中加入浒苔重量比的5%氢氧化钾、1%高锰酸钾、1%EDTA-2Na,并逐渐升温至95℃提取3h；3）中和：将降解液用酸中和至6.5；4）纯化：将降解液过滤或离心，将得到的滤液或离心液依次通过截留分子量为2000-3500Da和300-500Da的纳滤膜，截取分子量300-2000Da的部分，得纳滤浓缩液；5）干燥：纳滤浓缩液进一步浓缩至固形物含量为25-35%，喷雾干燥，即可得到浒苔寡糖。一种制备上述绿藻寡糖植物疫苗的方法，其具体包括如下步骤：将浒苔寡糖和昆布氨酸混合后溶于35-45%的乙醇水溶液，摇匀即得。本发明还请求保护上述绿藻寡糖植物疫苗在抗小麦全锈病和抗小麦纹枯病中的应用。本发明与现有技术相比具有如下技术优势：1）浒苔寡糖能诱导植物的某些与抗病抗逆相关分子的基因的表达，从而提高植物的抗逆性，其可以大幅度降低禾顶囊壳菌和禾谷丝核菌的感染几率。而当其与昆布氨酸组合后，禾顶囊壳菌和禾谷丝核菌的感染几率相对于单独使用浒苔寡糖更是大幅度降低，而单独使用昆布氨酸则无此效果，这表明两种活性组分在诱导植物产生抗禾顶囊壳菌和禾谷丝核菌方面具有协同作用。因此，本发明所述的植物疫苗具有显著的抗小麦全锈病和小麦纹枯病的作用。2）浒苔寡糖的收率高，从而大幅度降低生产成本。本发明效果实施例显示，按照本发明制备的浒苔寡糖的收率高，其收率在38%-43%之间，远高于现有技术所制备的浒苔寡糖，且本发明制备得到的浒苔寡糖的纯度高，不低于现有技术所获得的浒苔寡糖。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明作进一步阐述：实施例1：干浒苔用粉碎机粉碎，过20目筛，取10kg投入提取罐中，加入100kg自来水，投入提取罐中进行提取；然后加入0.5kg氢氧化钾、0.1kg高锰酸钾、0.1KgEDTA-2Na,并逐渐升温至95℃提取3h；用酸中和至6.5；降解液板框过滤（750目滤布），得到100L滤液，并通过截留分子量3500Da的纳滤膜，流出液73.5L通过截留分子量500DA的纳滤膜，至浓缩液体积浓缩至5L，浓缩液再用三效浓缩器进一步浓缩至固形物30%，喷雾干燥，得到4.37Kg浒苔寡糖。实施例2：干浒苔用粉碎机粉碎，过20目筛，取15kg投入提取罐中，加入150kg自来水，投入提取罐中进行提取；向提取罐中加入0.3Kg氢氧化钾，并逐渐升温至90℃提取4h；用酸中和至7.0；降解液板框过滤（750目滤布），得到150L滤液并通过截留分子量3500Da的纳滤膜，流出液137L通过截留分子量500DA的纳滤膜，至浓缩液体积浓缩至60L，浓缩液再用三效浓缩器进一步浓缩至固形物30%，喷雾干燥，得到6.1kg浒苔寡糖。实施例3-实施例8按照如表1所述参数制备浒苔寡糖，除下述参数不同外，实施例3-实施例5制备方法同实施例1，实施例6-实施例8同实施例2。表1实施例3-实施例8中主要参数分别测定按照本发明实施例1-实施例8所制备得到的浒苔寡糖的收率，浒苔寡糖中多糖残余率，其测定结果如表2所示。浒苔寡糖的收率=浒苔寡糖/干浒苔×100%。多糖的测定方法按照现有技术中所公开的方法测定，其残余率为浒苔寡糖中多糖含量除以提取前干浒苔中多糖含量。测定结果如表2所示。表2不同制备方法得到的浒苔寡糖和杂质含量浒苔寡糖收率（%）寡糖中杂质含量（%）实施例143.720.45实施例240.670.59实施例343.620.24实施例442.610.43实施例540.180.51实施例641.920.49实施例743.100.43实施例839.950.43由表2可以看出，按照本发明制备的浒苔寡糖的收率高，且浒苔寡糖中多糖残余量少，产品的纯度高。其中以实施例5所述的方法的制备的产品的收率最高，为本发明的最佳实施例。实施例9使用本发明制备得到的浒苔寡糖疫苗对纹枯病和全锈病致病菌的感染率的影响。以上述实施例5制备的浒苔寡糖作为研究对象，研究其与昆布氨酸配伍对致病菌感染率的影响。体外实验中浒苔寡糖和昆布氨酸均未体现出对禾顶囊壳菌和禾谷丝核菌的直接抑制效果。免疫方法：自小麦拔节期开始每隔5天喷施本发明所述的植物疫苗，连续喷施6次后，使用禾顶囊壳菌和禾谷丝核菌去感染实验小麦，观测患病率。其中浒苔寡糖在植物疫苗中的浓度为0.5%。表3使用植物疫苗后的致病菌的感染率疫苗中浒苔寡糖与昆布氨酸重量比禾顶囊壳菌感染率（%）禾谷丝核菌感染率（%）疫苗1浒苔寡糖0.5%25.631.2疫苗23:114.69.6疫苗34:12.11.2疫苗45:15.63.9疫苗5昆布氨酸0.5%98.899.2对照组未使用疫苗100100由表3可以看出，浒苔寡糖能诱导植物的某些与抗病抗逆相关分子的基因的表达，从而提高植物的抗逆性，其可以大幅度降低禾顶囊壳菌和禾谷丝核菌的感染几率。而当其与昆布氨酸组合后，禾顶囊壳菌和禾谷丝核菌的感染几率相对于单独使用浒苔寡糖更是大幅度降低，而单独使用昆布氨酸则无此效果，这表明两种活性组分在诱导植物产生抗禾顶囊壳菌和禾谷丝核菌方面具有协同作用。因此，本发明所述的植物疫苗具有显著的抗小麦全锈病和小麦纹枯病的作用。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。当前第1页1 2 3