本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备荔枝菌母种的组织分离方法。
背景技术：
荔枝菌(Litchi chinensis Bacterium)是生长在广东地区荔枝林潮湿白蚁窝上，经过高温多雨、骤出太阳骤降大雨催谷，迅速生长起来的食用菌，素称为“菌中之王”。能冠宇如此称号，是因为荔枝菌兼具肉质细嫩、口感清香、味道鲜甜等独特风味，加之其对生长环境要求十分苛刻，只生长在荔枝林内潮湿的白蚁窝上，无法人工培植，每年生长周期只有短短20来天，愈加显得荔枝菌的弥足珍贵。目前有关荔枝菌的研究集中在其菌丝体培养条件的筛选，尚无其母种分离技术的报道，而母种培育制种是实现荔枝菌人工培植的关键。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种制备荔枝菌母种的组织分离方法，以期在最大限度保持野生荔枝菌菌株特性的同时获得高产、优质、抗逆性强、适应性强的荔枝菌菌种，为实现荔枝菌的人工高产栽培奠定基础。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种制备荔枝菌母种的组织分离方法，所述方法为选取荔枝菌成熟度为40～45％的幼嫩子实体，去杂，无菌水洗净后用75～90％乙醇浸泡50～90s，无菌水冲洗3遍，再用3％NaClO、0.1％HgCl2或0.1％2，4－己二烯酸钾浸泡1.5min，无菌水冲洗3遍，无菌解剖刀轻轻切开子实体，挑取其中大小为0.25～0.35cm3的中间组织接种即得纯培养。
在其中一个实施例中，所述子实体为菌柄与菌盖衔接处、菌盖、菌褶、菌柄或担孢子。
在其中一个实施例中，所述中间组织的接种培养基按重量份包括荔枝壳粉50～60份、琼脂粉20～25份、葡萄糖5～8份、马铃薯10～20份、白蚁巢浸提液25～35份。
在其中一个实施例中，所述荔枝壳粉的粒度为60～100目。
在其中一个实施例中，所述培养基还含有浓度为60～90U/ml的盐酸四环素。
在其中一个实施例中，所述白蚁巢浸提液的提取方法为收集白蚁蚁巢，风干，以1:1.2～1.5g/ml的比例加入冷水浸泡6～10min，煮沸12～15min后冷却至室温，过滤即得白蚁巢浸提液。
组织分离是利用菌体幼嫩的活组织在适宜的培养基和生长条件下由子实体发育阶段回复到菌丝生长阶段，是获得纯菌种的一种方法，它比孢子培养法简便，培养时间短，不易污染杂菌，成活率高，能保持原菌株的特性，遗传稳定变异小，不仅适于孢子不易收集或萌发的食用菌，也适于稳定优良品种的遗传性。
与现有技术相比，本发明采用组织分离的方法制备荔枝菌母种，分离全过程均保持无菌操作，结合野生荔枝菌的生长习性同时在培养基中添加适量抗生素，抑制杂菌生长，能最大限度保持野生荔枝菌菌株特性，所获得的母种菌丝健壮、颜色洁白、生长迅速，为实现荔枝菌的人工高产栽培奠定了产业技术基础，经济价值大。
具体实施方式
为使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明技术方案进行详细说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1.白蚁巢浸提液的提取
实施例1
收集白蚁蚁巢，风干，以1:1.2g/ml的比例加入冷水浸泡6min，煮沸12min后冷却至室温，过滤即得白蚁巢浸提液。
实施例2
收集白蚁蚁巢，风干，以1:1.35g/ml的比例加入冷水浸泡8min，煮沸13.5min后冷却至室温，过滤即得白蚁巢浸提液。
实施例3
收集白蚁蚁巢，风干，以1:1.5g/ml的比例加入冷水浸泡10min，煮沸15min后冷却至室温，过滤即得白蚁巢浸提液。
2.接种培养基配方
实施例4
60目荔枝壳粉50份、琼脂粉20份、葡萄糖5份、马铃薯10份、白蚁巢浸提液25份，盐酸四环素的浓度为60U/ml。
实施例5
80目荔枝壳粉55份、琼脂粉22.5份、葡萄糖6.5份、马铃薯15份、白蚁巢浸提液30份，盐酸四环素的浓度为75U/ml。
实施例6
100目荔枝壳粉60份、琼脂粉25份、葡萄糖8份、马铃薯20份、白蚁巢浸提液35份，盐酸四环素的浓度为90U/ml。
3.组织分离法制备荔枝菌母种
实施例7
一种制备荔枝菌母种的组织分离方法，所述方法为选取荔枝菌成熟度为40％的幼嫩菌柄与菌盖衔接处子实体，去杂，无菌水洗净后用75％乙醇浸泡50s，无菌水冲洗3遍，再用3％NaClO浸泡1.5min，无菌水冲洗3遍，无菌解剖刀轻轻切开子实体，挑取其中大小为0.25cm3的中间组织接种至实施例4培养基中25℃培养4～6d，直至菌丝长满，菌丝浓密，粗壮，洁白状态即得纯培养物。
所得纯培养物在1～4℃条件下保存备用，或者即可用于繁殖原种。
实施例8
一种制备荔枝菌母种的组织分离方法，所述方法为选取荔枝菌成熟度为42.5％的幼嫩菌盖子实体，去杂，无菌水洗净后用82.5％乙醇浸泡70s，无菌水冲洗3遍，再用0.1％HgCl2浸泡1.5min，无菌水冲洗3遍，无菌解剖刀轻轻切开子实体，挑取其中大小为0.30cm3的中间组织接种至实施例5培养基中25℃培养4～6d，直至菌丝长满，菌丝浓密，粗壮，洁白状态即得纯培养物。
所得纯培养物在1～4℃条件下保存备用，或者即可用于繁殖原种。
实施例9
一种制备荔枝菌母种的组织分离方法，所述方法为选取荔枝菌成熟度为45％的幼嫩菌柄与菌盖衔接处、菌盖、菌褶、菌柄或担孢子子实体，去杂，无菌水洗净后用90％乙醇浸泡90s，无菌水冲洗3遍，再用0.1％2，4－己二烯酸钾浸泡1.5min，无菌水冲洗3遍，无菌解剖刀轻轻切开子实体，挑取其中大小为0.35cm3的中间组织接种至实施例6培养基中25℃培养4～6d，直至菌丝长满，菌丝浓密，粗壮，洁白状态即得纯培养物。
所得纯培养物在1～4℃条件下保存备用，或者即可用于繁殖原种。
显然，上述9个实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的启示，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本方面所保护的范围。