一种拟南芥/盐芥的无菌嫁接方法与流程

本发明涉及小体型植物试管苗的嫁接技术领域，特别是涉及一种模式植物拟南芥和耐盐模式植物盐芥之间的无菌嫁接方法。

背景技术：

嫁接，是无性繁殖中的营养生殖的一种，是利用植物受伤后具有愈伤的机能来进行的。其作为一项农业生产技术，已被广泛应用于农业、林业以及园艺植物生产及科研开发中。自上世纪初开始至今，特别是70、80年代，人们对嫁接基础理论进行了大量研究。但有些机理问题目前仍不十分明晰。

拟南芥是一种十字花科的小型野草，由于其具有生育期短、个体小、基因组小等特点，长期以来被作为遗传学、分子生物学、发育生物学研究的模式植物。因此，对于拟南芥的研究已引起各国科学家的高度重视，其嫁接方法也日益成熟，关于拟南芥自嫁接以及拟南芥与突变体之间嫁接的相关研究报道不断涌现。例如，专利“一种拟南芥的嫁接方法”(CN104604539A)公开了一种拟南芥野生苗与拟南芥突变体的嫁接方法，该嫁接方法具有方法易行、操作简单、伤害小等优点；但对于种子的消毒方法、嫁接苗的选择、嫁接培养条件等尚需进一步的改进。

盐芥属于十字花科盐芥属植物，以盐芥作为耐盐模式植物来研究耐盐机理，越来越受到科学家们的重视，但有关盐芥嫁接方法的研究至今未见报道。

众所周知，影响嫁接成活的因素主要取决于砧木与接穗的亲和力。所谓亲和力是指砧木与接穗在组织结构、遗传和生理特性上的相似性，通过嫁接成活后能够相互适应的能力。同种植物的嫁接，其亲和力为最强，亲缘关系越远，其亲和力就越弱。不同属之间的植物嫁接难度就更大。此外，除接穗和砧木的亲和力外，砧木与接穗的质量同样也是影响嫁接成活的重要因素，另外，温度、湿度及光照等方面的差异也会影响嫁接的成活率。而且，不同物种的不同时期的嫁接成活率也不同，即使是同一物种在不同时期，其嫁接体的成活率也相差很大。

综上，影响嫁接成活的因素有很多，拟南芥和盐芥作为同科不同属的两种植物，其嫁接难度更是显著增加，而目前还未有关于拟南芥和盐芥嫁接方法的报道，尚属技术上的空白。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种拟南芥/盐芥的无菌嫁接方法。实现了不同属间植物的嫁接，具有方法简便易行、嫁接成活率高等优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种拟南芥/盐芥的无菌嫁接方法，步骤如下：

(1)砧木准备：将盐芥种子经消毒处理后，播种于含有琼脂粉的1/2MS培养基上，层积1周后转入长日照光照条件下培养，萌发后7-10天作为砧木苗；

(2)接穗准备：待盐芥萌发时，将拟南芥种子进行消毒处理，并播种于含有琼脂粉的1/2MS培养基上，层积或直接置于长日照条件下培养，萌发后3-5天作为接穗；

(3)无菌条件下进行拟南芥和盐芥之间的嫁接；

(4)嫁接体培养：将嫁接好的拟南芥/盐芥复合体置于短日照条件下培养6-8天；

(5)嫁接苗的移栽：将嫁接成功的嫁接苗移栽至水培营养液或营养土中继续培养。

优选的，步骤(1)和步骤(2)中，采用相同的方法对种子进行消毒处理，具体的消毒方法为：用浓度为0.5％的NaClO消毒6-8分钟，然后用无菌水清洗4-6次。

优选的，步骤(1)和步骤(2)中，所述1/2MS培养基中琼脂的含量为1-1.5％；进一步优选为1.2％。

优选的，步骤(1)和步骤(2)中，1/2MS培养基中的琼脂为Sigma琼脂。

优选的，步骤(1)和步骤(2)中，长日照培养的条件为：16h光照/8h黑暗，光照条件下的温度为21-23℃，黑暗条件下的温度为18-20℃，光强为8000lux，相对湿度大于70％。

优选的，步骤(3)中，所述嫁接的方法为：将萌发后7-10天的盐芥的真叶及生长点切去，只保留两片子叶作为砧木；将萌发后3-5天的拟南芥下胚轴距上端1/4处切下作为接穗，嫁接到盐芥砧木上。

优选的，步骤(4)中，短日照培养的条件为：8h光照/16h黑暗，光照条件下的温度为21-23℃，黑暗条件下的温度为18-20℃，光强为8000lux，相对湿度大于70％。

优选的，步骤(4)中，所述水培营养液为1/2Hogland营养液；所述营养土是由土、蛭石和珍珠岩按质量比3:2:1制成。

上述嫁接方法中，所述的种子消毒、播种和嫁接过程均是在无菌超净台中操作。

上述嫁接方法中，步骤(3)中，采用双面刀片切去盐芥的真叶及生长点。

本发明的有益效果：

本发明系首次提供了一种拟南芥/盐芥的无菌嫁接方法，本发明以萌发生长到特定时期，即萌发后7-10天的盐芥为砧木，以萌发后3-5天的拟南芥为接穗的无菌嫁接方法。本发明通过直接用NaClO单一灭菌减少污染，有利于种子正常萌发；通过选用1.2％的琼脂和双面刀片的使用，有利于得到切口平整，光滑且伤害最小的切面；通过在解剖镜下操作嫁接，有利于砧木与接穗形成层的更好的吻合，提高嫁接成功率。

采用本发明的嫁接方法可以解决由于拟南芥、盐芥植株小带来的操作困难、切口不平整、嫁接成活率低及成本高等等问题。本发明的方法简便易行，成本低，效率高，为小型植株嫁接提供了新思路，新方法及新途径，同时为植物嫁接在农艺性状、分子机理等现在分子及生理方面的相关理论研究提供了基础。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：嫁接成功的拟南芥/盐芥嫁接苗；图中，B为A的嫁接部位放大图。

图2：拟南芥/盐芥嫁接过程模拟图。

图3：自制的持刀器。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

术语说明：

1/2MS培养基：指将MS培养基中的大量元素成分减半后的MS培养基。MS培养基为现有技术中常规的培养基，该培养基的配方组成是现有技术中已知的(如专利CN104604539A中公开的MS培养基)，该培养基可以购买得到，也可以自行配制。

正如背景技术所介绍的，现有技术中还未有关于拟南芥和盐芥嫁接方法的报道，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种拟南芥/盐芥的无菌嫁接方法，具体如下：

(1)砧木和接穗材料的准备：首先是将籽粒饱满的小盐芥种子用0.5％的次氯酸钠消毒，然后播种在琼脂粉浓度为1.2％的1/2MS培养基上，4℃层积1周后置于长日照光照培养箱内竖直培养，萌发7-10天后作为砧木苗备用。待盐芥萌发时，用同样的消毒方法将拟南芥种子进行消毒并种于琼脂粉浓度为1.2％的1/2MS培养基上，4℃层积或直接置于长日照光照培养箱中竖直培养，待拟南芥种子萌发后3-5天进行拟南芥和盐芥之间的嫁接。

(2)无菌条件下嫁接：将长势一致的无菌苗盐芥用镊子移至新的琼脂浓度1.2％的1/2MS培养基上，用刀片将盐芥的的真叶及生长点切去，只保留两片子叶作为砧木备用。将长势一致的在解剖镜下能看到有真叶刚萌发的拟南芥下胚轴距上端1/4左右处切下作为接穗嫁接到事先准备好的盐芥砧木上(嫁接过程的模拟图如图2所示)。

(3)嫁接体的培养：将嫁接好的拟南芥/盐芥复合体置于短日照光照培养箱中竖直培养6-8天。

(4)嫁接苗的移栽：将嫁接后培养6-8天的嫁接复合体在解剖镜下观察嫁接口是否连接好，将嫁接成功的嫁接苗根据实验需要移栽至水培或营养土中继续培养。在此期间嫁接苗接穗下胚轴若有侧根出现，及时剪去。

上述嫁接方法中，对于种子的消毒方法为：直接用浓度为0.5％的NaClO消毒6-8分钟，然后用无菌水清洗4-6次。此种方法避免了先用酒精消毒，再用NaClO进行二次消毒，操作步骤简化从而减少了二次污染而且种子不会灭过而影响种子萌发及后期实验。

上述嫁接方法中，采用琼脂粉浓度为1.2％的1/2MS培养基，既保证足够的水分利于种子正常萌发生长，又有利于后续的取材嫁接。

上述嫁接方法中，选用萌发7-10天的略大的盐芥幼苗，其侧根已长出，这样可以满足其接穗——拟南芥生长速度快的特点，能大大提高嫁接成活率及保证嫁接苗后期生长旺盛。由于拟南芥生长周期短，用较大苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易导致拟南芥提前开花，嫁接苗长势较差，选用萌发3-5天的较嫩幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，还能进一步保证嫁接苗后期生长的旺盛强壮。

上述嫁接方法中，用于嫁接的培养基和琼脂粉的种类也影响着嫁接苗的成活率，采用本发明的培养基和琼脂粉的嫁接苗的成活率可达95％以上。

上述嫁接方法中，所用的刀片为双面刀片。刀口锋利且薄，有利于切面平整，尽可能少的伤害形成层细胞以提高嫁接苗的成活率，为了减少污染，本发明用竹签自制了简易持刀器(见图3)，而且本发明用的1.2％的琼脂浓度硬度不仅能保证足够的水分同时也足以满足切割面的平整光滑。

上述嫁接方法中，嫁接后的嫁接体置于短日照下培养，不仅有利于提高嫁接体的成活率，而且还有利于嫁接苗后期生长强壮。这是因为拟南芥生长周期短，在其受到伤害后，其生长周期就更进一步大大缩短，如果在长日照条件下，就会导致嫁接苗弱小而过早的开花结果完成其生活史。而短日照可以延长其营养生长，从而弥补长日照下的不足。

上述嫁接方法中，种子消毒接种均在无菌超净台中操作，嫁接过程也在无菌超净台中操作，而且嫁接伤口的对接是在解剖镜下操作，更有利于接穗和砧木形成层的对接，可以提高嫁接苗的成功率。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：拟南芥/盐芥的无菌嫁接方法

具体步骤如下：

(1)砧木和接穗材料的准备：首先是将籽粒饱满的中国山东东营小盐芥(Thellungiella halophila)种子用0.5％(质量浓度)的次氯酸钠消毒并播种在琼脂粉(Sigma琼脂)浓度(此处的“浓度”即培养基中琼脂的质量分数，下同)为1.2％的1/2MS培养基(国产培养基)上，此过程在无菌超净台上操作。4℃层积1周后置于长日照光照培养箱内竖直培养萌发备用。用与盐芥同样的消毒方法将哥伦比亚型拟南芥(Arabidopsis thaliana)种子进行消毒并播种于琼脂粉(Sigma琼脂)浓度为1.2％的1/2MS培养基(国产培养基)上，此过程在无菌超净台上操作。4℃层积或直接置于长日照光照培养箱中竖直培养，待拟南芥种子萌发后3-5天进行拟南芥和盐芥之间的嫁接。用于种子消毒的方法是直接用浓度为0.5％的NaClO消毒6-8分钟，然后用无菌水清洗4-6次。此种方法避免了先用酒精消毒，再用NaClO进行二次消毒，操作步骤简化从而减少了二次污染而且种子不会灭过而影响种子萌发及后期实验。同时选用琼脂粉浓度为1.2％的1/2MS培养基，既保证足够的水分利于种子正常萌发生长，又有利于后续的取材嫁接。其次选用萌发7-10天的略大的盐芥幼苗，其侧根已长出，这样可以满足其接穗——拟南芥生长速度快的特点，能大大提高嫁接成活率及保证嫁接苗后期生长旺盛。由于拟南芥生长周期短，用较大苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易导致拟南芥提前开花，嫁接苗长势较差，选用萌发3-5天的较嫩幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，还能进一步保证嫁接苗后期生长的旺盛强壮。

(2)切割及无菌条件下嫁接：将萌发后7-10天长势一致的无菌苗盐芥用镊子移至新的琼脂(Sigma琼脂)浓度1.2％的1/2MS培养基(国产培养基)上，用双面刀片将盐芥的真叶及生长点切去，只保留两片子叶作为砧木备用。将长势一致的在解剖镜下能看到有真叶刚萌发的拟南芥下胚轴距上端1/4左右处切下作为接穗嫁接到事先准备好的盐芥砧木上，并在解剖镜下将二者切口对接好，并及时将培养皿封口以保湿。此过程在无菌超净台上操作。

所用双面刀片刀口锋利且薄，有利于切面平整，尽可能少的伤害形成层细胞以提高嫁接苗的成活率，为了减少污染，我们用竹签自制了简易持刀器(见附图2)，而且我们用的1.2％的琼脂浓度硬度不仅能保证足够的水分同时也足以满足切割面的平整光滑。由于砧木和接穗均为无菌苗，比较娇嫩，打开培养皿很快就会萎蔫，且切口也易失水萎蔫，因此嫁接过程中技术人员动作要快，超净台的风速开到最小，嫁接完毕迅速封口，但动作要轻，防止嫁接体错位。

(3)嫁接体的培养：将嫁接好的拟南芥/盐芥复合体置于短日照光照培养箱中竖直培养6-8天。

(4)嫁接苗的移栽：将嫁接后培养6-8天的嫁接复合体在解剖镜下观察嫁接口是否连接好，将嫁接成功的嫁接苗根据实验需要移栽至水培或营养土中继续培养。用于水培的营养液为1/2Hogland营养液，营养土为土：蛭石：珍珠岩的比例为3:2:1。在此期间嫁接苗接穗下胚轴若有侧根出现，及时剪去。

上述嫁接方法中，长日照条件为16h光照/8h黑暗，光照条件下的温度为21-23℃，黑暗条件下的温度为18-20℃，光强为8000lux，相对湿度大于70％。而上述步骤3和4中的短日照条件为8h光照/16h黑暗，温度、光强及湿度同长日照条件。嫁接后的嫁接体置于短日照下培养，不仅有利于提高嫁接体的成活率，而且还有利于嫁接苗后期生长强壮。这是因为拟南芥生长周期短，在其受到伤害后，其生长周期就更进一步大大缩短，如果在长日照条件下，就会导致嫁接苗弱小而过早的开花结果完成其生活史。而短日照可以延长其营养生长，从而弥补长日照下的不足。

对比例1：

将实施例1中对于砧木苗的选择分别调整为：萌发后3-5天的盐芥苗和萌发后11-15天的盐芥苗，其他操作同实施例1。

对比例2：

将实施例1中对于接穗苗的选择调整为：萌发后6-8天的拟南芥苗；将砧木苗的选择分别调整为：萌发后3-5天的盐芥苗、萌发后7-10天的盐芥苗和萌发后11-15天的盐芥苗，其他操作同实施例1。

考察实施例1、对比例1和对比例2嫁接后嫁接苗的成活率以及后期长势，结果如表1所示。

表1：萌发时间长短对嫁接苗的影响

由表1可以看出，作为砧木和接穗的盐芥和拟南芥幼苗，其萌发时间的选择会影响嫁接的成活率以及嫁接苗后期的长势。与对比例1和对比例2相比，本发明实施例1选用萌发7-10天的略大的盐芥幼苗，其侧根已长出，这样可以满足其接穗拟南芥生长速度快的特点，能大大提高嫁接成活率及保证嫁接苗后期生长旺盛。由于拟南芥生长周期短，用较大苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易导致拟南芥提前开花，嫁接苗长势较差，选用萌发3-5天的较嫩幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，还能进一步保证嫁接苗后期生长的旺盛强壮。

对比例3：

将实施例1中含有琼脂的1/2MS培养基进行调整，将琼脂替换为国产琼脂，将培养基替换为自配培养基、国产培养基和Sigma培养基(均为1/2MS培养基，区别在于培养基的来源不同)，并进行组合使用，其余操作同实施例1。

考察实施例1和对比例3嫁接后嫁接苗的成活率，结果如表2所示。

表2：不同琼脂粉(1.2％)及1/2MS培养基对嫁接成功率的影响

由表2可以看出，用于嫁接的培养基和琼脂粉的种类也影响着嫁接苗的成活率，相同浓度下的不同琼脂粉对嫁接苗的成活率影响存在较大差异，其中Sigma琼脂粉更有利于嫁接苗的成活。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。