4‑乙烯基苯酚在制备线虫杀虫剂中的应用的制作方法

本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及4-乙烯基苯酚在制备线虫杀虫剂中的应用。

背景技术：

植物病原线虫作为一种常见的寄生线虫，具有多寄主，防治难度大，抗药性强等特点，对于农业生产造成了严重的危害,其中植物根结线虫和植物孢囊线虫对农作物庄稼危害最大，分布范围也最广(curtis2007)。根结线虫(meloidogynespp.)是一种定植在植物根系的内寄生线虫，属于垫刃目(tylenchida)，异皮科(heteroderidae)，根结亚科(meloidogyninae)，根结线虫属(meloidogyne)。在我国，分布最广、危害最严重的是南方根结线虫。目前国内外线虫防治技术主要有以下几种方法：

(1)农业防治

苗床是线虫传播的非常重要的途径，可以通过对苗床进行消毒或者无土育苗、种植抗线虫品种等方法，保证种苗的健康成长，避免早期受到根结线虫的侵染。清除带虫残体，压低虫口密度，带虫根晒干后应烧毁。深翻土壤。将表土翻至25厘米以下，可减轻虫害发生。高(低)温抑虫。利用夏季高温休闲季节，起垄灌水覆地膜，密闭棚室两周。利用冬季低温冻垡等可抑制线虫发生。有些地区可采用轮作，特别是水旱轮作的方法防治根结线虫具有较好的效果(曹坳程等2002)。但是这些主要是起辅助性作用，通常使用的防治手段是使用化学农药防治。

(2)化学防治

长期以来，我国对作物病原线虫的防治主要依靠化学农药，其在保障农作物高产稳产中发挥了重要作用。溴甲烷是最早用于植物病原线虫防治的一类化学药剂，随后，克线丹(cadusafos)、灭线磷(ethoprphos)等杀线虫剂在黄瓜等农作物线虫病害防治过程中显示出巨大的潜力，因此得到了广泛的应用(孔祥义等2006)。

但是，高毒性的化学农药在使用过程中造成了非常严重的农产品和环境污染问题。据卫生部和农业部统计，全国每年因农药中毒人数已超过5万，农药残留对人体造成的不良影响更是难以估量。同时，我国的农副产品由于农药残留量超标，出口受阻，每年造成的外贸经济损失高达70亿美元。与此同时相当部分的化学杀线虫药剂进入土壤和地下水中，造成严重的环境污染，特别是地下水污染，直接威胁到生态安全。目前我国主要化学杀线虫剂灭线磷、溴甲烷、涕灭威等已被禁用或限制使用，导致可选用的化学杀线虫剂种类更少，加剧了线虫防治的困难。所以，杀线虫剂的应用应该向低毒、高效、低残留方向发展(王新荣等2010)。

捻转血矛线虫(haemonchuscontortus)是一种寄生在反刍动物的主要病原寄生虫，偶尔也见于人和鼠等非适宜宿主。捻转血矛线虫属直接发育型的寄生虫,不需要中间宿主,成虫排卵量大,严重污染草地和水源。该病的发生呈现出气候、地理、牧场条件和宿主生理状态依赖性。因引起感染动物贫血、消瘦甚至死亡而给畜牧业造成极大的经济损失。由于没有商业化的疫苗,捻转血矛线虫病的防控仍然以抗蠕虫药治疗为主。但是耐药性的产生和有效疫苗的缺乏给防治工作带来困难，新的药物亟待开发。

4-乙烯基苯酚是白酒和啤酒中发现的酚类化合物，溶于水，部分溶于酒精，稍溶于油脂，具有苯酚、药味和辛香风味，2000年，食品添加剂联合专家委员会jecfa(thejointfao/whoexpertcommitteeonfoodadditives)评估4-乙烯基苯酚用作调味剂在当前摄入水平没有安全问题；同时4-乙烯基苯酚是一种重要的有机化工原料及医药中间体，广泛应用于合成树脂、合成橡胶、石油化工、食品香料、医药等行业。在中草药中提取到的4-乙烯基苯酚发现具有抗肿瘤细胞血管生成的作用(gracegar-leeyue等2015)，在chavicolandrelatedcompoundsasnematocides，biosci.biotech.biochem,57(9)，1572-1574,1993中报道了4-乙烯基苯酚的杀秀丽隐杆线虫活性，本申请首次发现4-乙烯基苯酚具有杀根结线虫和羊捻转血矛线虫活性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了4-乙烯基苯酚在制备线虫杀虫剂中的应用，所述的4-乙烯基苯酚(4-vinylphenol)的分子量为120.15，分子式为c8h8o，化学式如下：

为了达到以上目的，本发明采用以下技术措施：

4-乙烯基苯酚在制备线虫杀虫剂中的应用，其应用过程包括以4-乙烯基苯酚为主效成分或为有效成分之一制备成线虫杀虫剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次报道了4-乙烯基苯酚的杀线虫活性，为新型的动植物线虫防治制剂的制备提供了新的选择性。

4-乙烯基苯酚制备的杀线剂具有高效、低毒、持续性好的优点。

附图说明

图1为4-乙烯基苯酚杀南方根结线虫的效果图；

图1中a代表0h的杀虫效果；图1中b代表24h的杀虫效果；图1中c代表48h的杀虫效果。

图2为4-乙烯基苯酚杀羊捻转血矛线虫的效果图；

图2中a：对照组线虫；图2中b：处理组线虫。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法。所述试剂或材料，如未特别说明，来源于商业渠道。

实验例1：

4-乙烯基苯酚(4-vinylphenol)在制备根结线虫杀虫剂中的应用，应用过程如下：

从番茄根部挑取线虫感染根结，将卵块置于96孔板20℃孵育，观察根结线虫孵化情况。用无菌水冲洗线虫，在96孔板中加入200μl浓度依次为10,11,12,13,14,15μg/ml的4-乙烯基苯酚溶液，加入2μl氯霉素(30mg/ml)和30头线虫，纯净水做对照，每组3个重复。置于20℃培养箱中培养，观察实验结果(图1)。

线虫死亡率＝线虫死亡数/供试线虫数*100％

校正死亡率＝(处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率)/(1-对照组线虫死亡率)*100％

表1.4-乙烯基苯酚杀根结线虫活性

对照组线虫生长正常，4-乙烯基苯酚杀根结线虫半数致死浓度lc50为14.96ug/ml(48h)和13.32ug/ml(72h)。

所述的线虫为南方根结线虫。

实验例2：

4-乙烯基苯酚(4-vinylphenol)在制备秀丽隐杆线虫杀虫剂中的应用，应用过程如下：

在96孔板中加入200μl浓度依次为50,75,100,125,150,175μg/ml的4-乙烯基苯酚溶液，加入2μl氯霉素(30mg/ml)和约30头j2期秀丽隐杆线虫线虫，纯净水做对照，每组3个重复。置于20℃培养箱中培养，观察实验结果。

线虫死亡率＝线虫死亡数/供试线虫数*100％

校正死亡率＝(处理组线虫死亡率-对照组线虫死亡率)/(1-对照组线虫死亡率)*100％

表2.4-乙烯基苯酚杀秀丽隐杆线虫活性

对照组线虫生长正常，4-乙烯基苯酚对秀丽隐杆线虫半数致死浓度为103.33ug/ml(48h)和70.30ug/ml(72h)。4-乙烯基苯酚对植物病原南方根结线虫杀虫活性强于模式线虫秀丽隐杆线虫。

实验例3：

4-乙烯基苯酚(4-vinylphenol)在制备羊捻转血矛线虫杀虫剂中的应用，应用过程如下：

从感染羊粪便中获得并孵育捻转血矛线虫三期幼虫，用生理盐水洗涤线虫，38℃处理25-30分钟进行脱鞘处理，然后用lb培养液洗涤线虫，在96孔板中加入98μl含有100条左右幼虫的lb溶液，加入2μl4-乙烯基苯酚溶液使其终浓度达到1mg/ml，lb溶液做对照，每组3个重复。置于38℃培养箱中培养，72h后观察实验结果。

对照组线虫生长正常，1mg/ml4-乙烯基苯酚处理下，羊捻转血矛线虫3期幼虫全部死亡。4-乙烯基苯酚对动物病原线虫羊捻转血矛线虫具有强烈杀虫活性(图2)。

实验例4：

4-vinylphenol对南方根结线虫卵孵化抑制实验

1)挑取番茄根上的卵块，收集在一起，放入1％次氯酸钠溶液消毒3min，用无菌水洗掉次氯酸钠残留，在水里摇晃使卵从卵块中脱落，获得含卵悬浮液；

2)用无菌水冲洗，将含卵的悬浮液分别通过筛孔尺寸依次为200目、325目、500目的筛子，最后卵保留在500目的筛子上，再次用无菌水小心冲洗筛子上的卵，并收集；

3)在96孔板中加入线虫卵150个/孔，每孔中加入4-vp溶液，使终浓度分别为5，10,40,100μg/ml，每组处理3个重复，水为对照，观察结果。

卵孵化率(％)＝孵化线虫数/卵总数*100％

卵孵化抑制率(％)＝(对照组卵孵化率-处理组卵孵化率)/对照组卵孵化率*100％

表3.根结线虫10d卵孵化抑制率

4-vp浓度的提升对卵孵化抑制率升高，而且4-vp浓度达到40ug/ml之后孵化出来的线虫存在80％-100％的死亡率。

实验例5：

病原细菌拮抗实验

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、青枯假单胞菌和丁香假单胞菌划线活化得到单菌落，挑取单菌落接种到lb液体培养基中活化。采用琼脂平板扩散法，将1％病原细菌加入培养基中倒入培养皿，在培养皿中放置牛津杯，在牛津杯中加入100μl浓度500μg/ml的4-vinylphenol，以水作为阴性对照，3个重复，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌置于37℃培养，青枯假单胞菌和丁香假单胞菌置于28℃培养，观察结果。

表4

+：表示有效果，-：表示无效果。

实验例6：

病原真菌拮抗实验

小麦立枯丝核菌，水稻立枯丝核菌，棉花立枯丝核菌，黑曲霉，油菜灰霉，小麦赤霉，辣椒灰霉，意大利青霉，油菜核盘菌，香蕉尖胞镰刀菌，棉花尖胞镰刀菌，稻瘟菌挑取菌丝接种到pda培养基上活化。采用琼脂平板扩散法，挑取菌块于pda培养基平板中心，用打孔器等距离打6个孔，加入100μl浓度500μg/ml的4-vinylphenol，以水作为阴性对照，3个重复，置于28℃培养(稻瘟菌和油菜核盘菌置于20℃)，观察结果。

表5

+：表示有效果，-：表示无效果。