一种基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法与流程

本发明属于果树育种技术领域，具体地说，涉及一种基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法。

背景技术：

板栗原产中国，栽培历史悠久，是优良的干果树种。中国板栗三分之二以上的种植面积位于经济欠发达的边老穷山区，随着历史的发展逐渐形成了独具特色的山区板栗产业，成为山区农民贫致富的重要经济依赖。品种是一个产业得以健康发展的重要保证，也是永恒的基础支撑。目前，国内外均采用多种方式来培育新品种为生产服务，植物上获得新品种的主要方式包括：实生选种、芽变选种、杂交育种、辐射育种、转基因育种、多倍体育种等，其中多倍体育种一直是应用普遍、育种效果突出的新品种培育方式之一。多倍体是指具有三套或者三套以上完整染色体组的所有个体。染色体组加倍使植物体可用的遗传物质增加，重复的基因可能会发生功能分化，从而使多倍体物种在自然选择中具有更大环境适应优势，如更强的抗旱能力、抗病虫害能力、无融合生殖等，使植物可以适应更广泛的自然环境(rieseberg等，2003)。自然而生的多倍体数量是有限的，随着开发利用的深入，发掘难度不断增大，可利用资源也越来越少，因此，要想更加充分地利用多倍体优势，仅靠自然多倍体是远远不够的，必须进行人工诱导创制多倍体，这是果树多倍体获得的主要途径(洪陈洁，2014)。在人工多倍体的诱导中，最常用的方法是化学诱导，即采用诱变剂处理植物体内最旺盛、最活跃的组织器官，如对萌动状态或刚发芽的种子、幼苗或嫩枝的生长点、芽、花蕾或愈伤组织等进行处理，从而诱导产生多倍体(韦荣昌，2013)。这种方法最大的优点就是诱导作用的高度专一性，从而使诱导效果显著，较易获得多倍体种质。常用的诱变剂有秋水仙素、富民农、萘嵌戊烷、吲哚乙酸、氧化亚氮等，其中使用最多最有效的就是秋水仙素。秋水仙素通过破坏细胞分裂中期纺锤丝的形成，使已经复制的染色体停留在赤道板上不能向细胞两极移动，原来为两个细胞所有的染色体停留在一个细胞核中，形成染色体加倍的细胞并由这些细胞产生了多倍体植株(翟中和，2008)。

苹果、柑橘、梨、桃、葡萄等果树均已有利用秋水仙素诱导获得多倍体种质(品种)的报道。前期研究成果证实，在植物多倍化诱导过程中，由于各物种间遗传物质、器官构成、发育时期和细胞分化方式等因素千差万别，其达到好的多倍化诱导效果所需的药剂剂量、时间、材料等因素也各不相同(吴潇等，2016)。板栗的遗传背景复杂，保守性强，在目前的相关研究中，尚未发现有关通过化学诱导药剂处理胚芽获得多倍体板栗的报道。

技术实现要素：

为了填补目前人工诱导板栗多倍体技术领域的空白，本发明旨在提供一种基于板栗胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法，该方法可以获得大频率多倍化板栗植株。

为了实现本发明目的，本发明提供的基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法，包括以下步骤：1)胚芽前处理，2)配制诱导药剂，3)诱导药剂浸渍胚芽，4)培育成苗，5)多倍体植株筛选；

其中，步骤2)配制的诱导药剂为浓度0.1～1w/v％的秋水仙素水溶液，优选浓度0.5w/v％。

步骤1)胚芽前处理：选择健康充实的板栗种子，用湿沙层积催芽板栗种子，直至种子胚根萌发后取出，然后去除板栗种子内外种皮，横向切除子叶整体的一部分，露出子叶间隙，由此打开闭合的子叶，暴露出被子叶保护的胚芽，作为诱导处理材料。

前述的方法，所述种子胚根萌发后取出是指待胚根萌发至长度为2.1～4.0cm时取出。所述切除子叶整体的一部分，是指切除子叶整体的1/3～1/2。

步骤3)诱导药剂浸渍胚芽：选择规格为直径10cm，高2cm的培养皿，底部均匀覆盖脱脂棉，并用镊子压实保持最终厚度，将暴露出胚芽的板栗种子，摆放在脱脂棉层上。用脱脂棉层包裹住板栗种子暴露出的胚芽至根尖部位。将配制好的诱导药剂倒入培养皿中，直到培养皿底部和包裹胚芽、胚根的脱脂棉呈饱和状态。在如此状态下使诱导药剂水溶液浸渍板栗种子胚芽；浸渍过程中培养皿盖不封死，保持空气流通。

前述的方法，所述用镊子压实保持最终厚度是指用镊子压实保持最终厚度为2～3mm，然后将暴露出胚芽的板栗种子，使胚芽朝上摆放在脱脂棉层上。所述用脱脂棉层包裹住板栗种子暴露出的胚芽至根尖部位是指用2～3mm厚的脱脂棉层包裹住板栗种子暴露出的胚芽至根尖部位。

步骤3)使诱导药剂水溶液浸渍板栗种子胚芽是指使诱导药剂水溶液浸渍板栗种子胚芽48～84h，优选72h。

步骤4)培育成苗：诱导药剂浸渍胚芽处理过程结束后，去除包裹胚根和胚芽的脱脂棉，将种子在蒸馏水中浸洗3～4次，然后将洗净的种子胚芽向上种入规格为高15cm，直径10cm装好沙土的营养钵中，一钵一种，播种时覆盖厚度为2±0.5cm的沙土层；营养钵内定期浇灌灭菌后的培养基，保证胚芽萌发育成的幼苗正常生长。

其中，所述培养基为1/2ms液体培养基，每周1次，每次30ml。

本发明所述板栗包括但不限于以下品种：冀栗1号、燕山早丰、燕山短枝。

在本发明的一个具体实施方式中，所述方法具体为：

(1)胚芽前处理：以板栗种子的胚芽作为诱导处理材料。每年2月份，选择健康充实的板栗种子，用湿沙(湿度为60％左右的沙子，以用手捏成团，松手后又能散开为标准)层积催芽板栗种子，直至种子胚根萌发后长度为2.1～4.0cm时取出，然后去除板栗种子内外种皮，横向切除子叶整体的1/3～1/2(切除太多，胚芽成活率低；切除太少，药剂浸渍诱导效果差)，露出子叶间隙，由此打开闭合的子叶，暴露出被子叶保护的胚芽。

(2)配制诱导药剂：配制秋水仙素的水溶液为诱导药剂，处理胚芽前1～2天配制好浓度为0.5w/v％的秋水仙素水溶液，置于温度1～6℃条件下备用。

(3)诱导药剂浸渍胚芽：选择大小合适的培养皿(规格为直径10cm，高2cm)，底部均匀覆盖脱脂棉，并用镊子压实保持最终厚度为2～3mm，将暴露出胚芽的板栗种子，使胚芽朝上摆放在脱脂棉层上。用2～3mm厚的脱脂棉层包裹住板栗种子暴露出的胚芽至根尖部位。将配制好的诱导药剂缓缓倒入培养皿中，直到培养皿底部和包裹胚芽、胚根的脱脂棉呈饱和状态。如此状态使诱导药剂水溶液浸渍板栗种子胚芽72h。在此过程中培养皿盖不封死，保持空气流通，避免因氧气短缺引起的无氧呼吸对板栗种子、胚芽和胚根的毒害作用。

(4)培育成苗：诱导药剂浸渍胚芽处理过程结束后，去除包裹胚根和胚芽的脱脂棉，将种子在蒸馏水中浸洗3～4次，浸洗过程轻缓，避免幼嫩的胚根和胚芽受到伤害。在组培培养室内，将清洗干净的种子种入装好沙土的营养钵中(规格为高15cm,直径10cm)，一钵一种，播种时要保持板栗种子胚芽朝上，且覆盖种子的沙土厚度为2±0.5cm，太薄不利于保持水分，太厚不利于胚芽的萌发生长。营养钵内定期浇灌灭菌后的1/2ms液体培养基，每周1次，每次30ml，保证胚芽萌发成的幼苗正常生长。

(5)多倍体植株筛选：以通过诱导药剂浸渍胚芽处理后培育成的幼苗为材料，借助普遍公认的植株多倍体鉴定方法(比如流式细胞仪倍性鉴定或体细胞染色体计数等方法以及叶片大小、叶片厚度、节间长短、节间粗度等形态指标鉴定)，筛选获得板栗多倍体植株或多倍化嵌合体植株。

本发明还提供上述方法在板栗多倍体育种中的应用。

本发明以板栗胚芽为对象，筛选其适宜的倍性诱导时期、药剂剂量、部位等因素，创建了一套基于胚芽浸渍的板栗多倍体诱导技术，可获得大频率多倍体板栗植株，为今后提供一种切实可行的板栗多倍体诱导方法，从而为板栗倍性育种提供技术支撑。

本发明基于板栗胚芽生长点浸渍诱导板栗多倍体的方法：第一选择板栗种子的胚芽为处理材料；第二选用秋水仙素的特定浓度(优选0.5w/v％)为板栗多倍化诱导药剂；第三确定板栗种子根部萌发2.1～4.0cm时为胚芽生长点处理最佳时期；第四采用脱脂棉包裹胚芽生长点并使其在药剂浸渍状态下保持特定时长(优选72h)。以上4个优选的技术措施来共同达到诱导板栗体细胞多倍化，并获得大比率板栗多倍体植株或多倍化嵌合体植株。

采用本发明提出的方法处理板栗种子胚芽后，可以获得大比率板栗多倍体植株，试验证实处理后的板栗种子所产生的多倍化植株或多倍化嵌合体比率高达12.0％。

附图说明

图1为本发明实施例1诱导产生的板栗多倍体植株及正常植株(左：多倍体植株；右：正常植株)。

图2为本发明实施例1诱导产生的板栗多倍体植株。

图3为本发明实施例1诱导产生的板栗多倍化植株细胞染色体dna含量(倍性)图。

图4为本发明实施例1中板栗‘冀栗1号’(二倍体)细胞染色体dna含量(倍性)图。

图3和图4中，大写字母c代表二倍体细胞峰，d代表四倍体细胞峰，e代表六倍体细胞峰；d和e峰面积越大，代表多倍化细胞比例越高。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例及对比例中所用药剂、脱脂棉、培养皿、营养钵等材料均为市购。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。

实施例1基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体的方法

以下实施例及对比例所用试验材料由河北省昌黎果树研究所板栗育种基地提供。按下述方法进行基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体试验。

以板栗品种‘冀栗1号’(河北省审定板栗良种)开放授粉所得种子为对象，50粒种子为一组，3次重复。该试验以药剂浓度(3个水平)、胚根萌发长度(5个水平)和药剂浸渍胚芽时长(4个水平)为因素，进行完全试验设计，共60个处理(表1)，其中以依照本发明方法的优选条件(诱导药剂0.5％秋水仙素胚根长度2.1～4.0cm和药剂浸渍胚芽时长72h)进行的处理为实施例1，其余59个处理为对比例1～59。实施例1及对比例1～59均按照下述步骤进行板栗种子胚芽诱导操作：

1、胚芽前处理：以板栗品种冀栗1号(c.‘jili1’)开放授粉所得种子的胚芽作为诱导处理材料。2015年2月份，选择健康充实的板栗种子，用湿沙(湿度为60％左右的沙子，以用手捏成团，松手后又能散开为标准)层积催芽板栗种子，直至种子胚根萌发后长度为各实施例及对比例设计长度(表1)时取出，然后去除板栗种子内外种皮，横向切除子叶整体的1/3～1/2，露出子叶间隙，由此打开闭合的子叶，暴露出被子叶保护的胚芽。

2、配制诱导药剂：于采用诱导药剂处理种子胚芽前2天，配制好各实施例及对比例所需诱导药剂的水溶液(成分、浓度和配比见表1)，置于4℃冰箱中备用。

3、诱导药剂浸渍胚芽：选择大小合适的培养皿(规格为直径10cm，高2cm)，底部均匀覆盖脱脂棉，并用镊子压实保持最终厚度为2～3mm，将处理好胚芽的种子，使胚芽朝上摆放在脱脂棉层上。用2～3mm厚的脱脂棉层包裹住板栗种子暴露出的胚芽至根尖部位。将诱导药剂缓缓倒入培养皿中，直到培养皿底部和包裹胚芽、胚根的脱脂棉呈饱和状态。如此状态使秋水仙素水溶液浸渍板栗种子胚芽达到各实施例及对比例试验设计时长(表1)。在此过程中培养皿盖不封死，保持空气流通，避免因氧气短缺引起的无氧呼吸对板栗种子、胚芽和胚根的毒害作用。

4、培育成苗：诱导药剂浸渍胚芽处理过程结束后，去除包裹胚根和胚芽的脱脂棉，将种子在蒸馏水中浸洗3～4次，浸洗过程轻缓，避免幼嫩的胚根和胚芽受到伤害。在组培培养室内，将清洗干净的种子种入装好沙土的营养钵中(规格为高15cm，直径10cm)，一钵一种，播种时要保持板栗种子胚芽朝上，且覆盖种子的沙土厚度为2±0.5cm，太薄不利于保持水分，太厚不利于胚芽的萌发生长。营养钵内定期浇灌灭菌后的1/2ms液体培养基，每周1次，每次30ml，保证胚芽萌发成的幼苗正常生长。

5、多倍体植株筛选：以通过诱导药剂浸渍胚芽处理后培育成的幼苗为材料，按照下述方法(流式细胞仪倍性鉴定法)进行多倍体植株筛选。

a)核悬浮液制备：采集板栗幼苗上部叶片，蒸馏水洗净，编号。然后称取1.0g，放入置于冰面上的滴有1ml提取缓冲液的培养皿中，使用剃须刀轻轻剁碎，260目(60μm)尼龙网筛过滤，300×g离心10min，取缓冲液漂洗沉淀，然后离心，重复2次，收集沉积细胞，以备染色。

b)dna特异性染色：制备的核悬液离心后弃去上层清液，加入2ml染色缓冲液，暗处常温下染色30min。500目(30μm)尼龙网筛过滤，滤液用标准试管收集，随即上机测定。

提取缓冲液成分：15mol/ltris-hcl(ph7.5)，80mol/lkcl，20mol/lnacl，20mol/ledta-na2，15mol/lβ–me，0.05％的tritonx–100。染色缓冲液为提取缓冲液内加入20mg/l的rnasea和20mg/lpi(碘化丙啶)。

c)流式细胞术检测：所用机型为美国beckmancoulter公司生产的epicaltraⅱ流式细胞仪，光源为15mw488nm氩离子空冷激光。激发染色的dna分子促发荧光，与测定装置相连的计算机数据采集软件(expo32foraltra)即可对荧光强度进行采集，数据积分处理软件expo32v1.28banalysis。本实施例以二倍体品种‘冀栗1号’为对照，以对照样品具正常染色体dna含量的细胞核的c峰为标准，d峰为四倍体细胞峰，e峰为六倍体细胞峰。每个样品重复测定3次，每次检测时至少收集10000个细胞核。植株叶片染色体dna细胞峰，仅有c峰时即为二倍体，具有d峰或e峰时，说明植株叶片部分细胞为四倍体或者六倍体，也就是植株细胞发生多倍化(为多倍体或多倍化嵌合体)，最后整体统计多倍化植株比率。

表1不同对比(实施)例的相关因素(水平)变量及诱导多倍体效果

注:表中数据后不同小写字母表示差异显著(α＝0.05)

6、实施效果

形态鉴定法是初步鉴定植株是否为多倍体的方法，也是最简单、最直观粗放的方法。如巨大性是多倍体最为显著的外部形态特征，多倍体一般茎粗壮且短，生长缓慢，发育迟缓，叶变厚，叶色变深，叶形指数变小，花果都较二倍体大(常月梅.果树多倍体鉴定进展.山西林业科技，2000，3(1):1-4.)。在实施例1中，诱导后产生的部分植株叶片变厚、叶色变深，茎变粗壮且节间短，符合多倍体的形态学特征，初步判断为多倍化植株(图1，图2)

流式细胞仪法是目前最快速且有效的倍性鉴别方法，它可以直接测定不同倍性细胞的dna含量，从而快速鉴别植株的染色体倍性水平。本实施例中，通过利用流式细胞仪对诱导后植株叶片染色体dna含量的检测，鉴别出植株中有12.00％的多倍化植株(多倍体或多倍化嵌合体)存在(图3，图4)。

表1中，不同诱导药剂、胚根萌发长度和药剂浸渍胚芽时长因素(水平)条件的对比例和实施例，其诱导产生的多倍化植株比例不尽相同。41个对比例实施后其处理材料中未检测到多倍化植株，说明这41个对比例的方法条件难以诱导产生板栗多倍体植株。18个对比例中诱导产生了多倍化植株，其多倍化植株比例介于0.67％～8.00％之间，但均低于实施例1中诱导产生的多倍化植株比例(实施例1中诱导产生多倍化植株比例为12.00％)。

由此可见，以诱导产生的多倍化植株比率为评价指标，实施例1中各因素组合为最佳，诱导产生的多倍化植株比率是所有试验方法中最高的(可获得高达12.0％的板栗多倍化植株)。换言之，在以获得大频率板栗多倍体植株为目的的前提下，选用诱导药剂0.5％(w/v)秋水仙素在板栗种子胚根萌发长度为2.1～4.0cm时，保持药剂浸渍板栗胚芽生长点至根部位置72h的处理，可以取得理想的试验结果。

实施例2和实施例3

以下实施例所用试验材料由河北省昌黎果树研究所板栗育种基地提供。按下述方法进行基于胚芽浸渍诱导板栗多倍体试验。

分别以板栗品种‘燕山早丰’(c.yanshanzaofeng)、‘燕山短枝’(c.yanshanduanzhi)(均为国审良种)开放授粉所得种子为对象，50粒种子为一组，3次重复。实施例2及实施例3均按照本发明方法下述步骤进行板栗种子胚芽诱导操作：

1、胚芽前处理：以板栗‘燕山早丰’和‘燕山短枝’的种子胚芽作为诱导处理材料。2015年2月份，选择健康充实的板栗种子，用湿沙(湿度为60％左右的沙子，以用手捏成团，松手后又能散开为标准)层积催芽板栗种子，直至种子胚根萌发后长度为2.1～4.0cm时取出，然后去除板栗种子内外种皮，横向切除子叶整体的1/3～1/2，露出子叶间隙，由此打开闭合的子叶，暴露出被子叶保护的胚芽。

2、配制诱导药剂：配制秋水仙素的水溶液为诱导药剂，处理胚芽前2天配制好浓度为0.5％(w/v)的秋水仙素水溶液，置于温度4℃冰箱中备用。

3、诱导药剂浸渍胚芽：选择大小合适的培养皿(规格为直径10cm，高2cm)，底部均匀覆盖脱脂棉，并用镊子压实保持最终厚度为2～3mm，将暴露出胚芽的板栗种子，使胚芽朝上摆放在脱脂棉层上。用2～3mm厚的脱脂棉层包裹住板栗种子暴露出的胚芽至根尖部位。将诱导药剂缓缓倒入培养皿中，直到培养皿底部和包裹胚芽、胚根的脱脂棉至饱和状态。如此状态使秋水仙素水溶液浸渍板栗种子胚芽72h。在此过程中培养皿盖不封死，保持空气流通，避免因氧气短缺引起的无氧呼吸对板栗种子、胚芽和胚根的毒害作用。

4、培育成苗：诱导药剂浸渍胚芽处理过程结束后，去除包裹胚根和胚芽的脱脂棉，将种子在蒸馏水中浸洗3～4次，浸洗过程轻缓，避免幼嫩的胚根和胚芽受到伤害。在组培培养室内，将清洗干净的种子种入装好沙土的营养钵中(规格为高15cm，直径10cm)，一钵一种，播种时要保持板栗种子胚芽朝上，且覆盖种子的沙土厚度为2±0.5cm，太薄不利于保持水分，太厚不利于胚芽的萌发生长。营养钵内定期浇灌灭菌后的1/2ms液体培养基，每周1次，每次30ml，保证胚芽萌发成的幼苗正常生长。

5、多倍体植株筛选：以通过诱导药剂浸渍胚芽处理后培育成的幼苗为材料，按照下述方法(流式细胞仪倍性鉴定法)进行多倍体植株筛选。

a)核悬浮液制备：采集板栗幼苗上部叶片，蒸馏水洗净，编号。然后称取1.0g，放入置于冰面上的滴有1ml提取缓冲液的培养皿中，使用剃须刀轻轻剁碎，260目(60μm)尼龙网筛过滤，300×g离心10min，取缓冲液漂洗沉淀，然后离心，重复2次，收集沉积细胞，以备染色。

b)dna特异性染色：制备的核悬液离心后弃去上层清液，加入2ml染色缓冲液，暗处常温下染色30min。500目(30μm)尼龙网筛过滤，滤液用标准试管收集，随即上机测定。

提取缓冲液成分：15mol/ltris-hcl(ph7.5)，80mol/lkcl，20mol/lnacl，20mol/ledta-na2，15mol/lβ–me，0.05％的tritonx–100。染色缓冲液为提取缓冲液内加入20mg/l的rnasea和20mg/lpi(碘化丙啶)。

c)流式细胞术检测：所用机型为美国beckmancoulter公司生产的epicaltraⅱ流式细胞仪，光源为15mw488nm氩离子空冷激光。激发染色的dna分子促发荧光，与测定装置相连的计算机数据采集软件(expo32foraltra)即可对荧光强度进行采集，数据积分处理软件expo32v1.28banalysis。本实施例分别以二倍体品种‘燕山早丰’、‘燕山短枝’为对照，以对照样品具正常染色体dna含量的细胞核的c峰为标准，d峰为四倍体细胞峰，e峰为六倍体细胞峰。每个样品重复测定3次，每次检测时至少收集10000个细胞核。植株叶片染色体dna细胞峰，仅有c峰时即为二倍体，具有d峰或e峰时，即为植株叶片部分细胞产生多倍化四倍体或者六倍体(或多倍化嵌合体)，最后整体统计多倍化植株比率。

6、实施效果

由表2可见，依照本发明方法实施，以3个不同板栗品种的种子胚芽为诱导材料，产生的多倍化植株比例均在10.00％以上，并且3个品种间诱导产生的多倍化植株比率差异不显著，说明本发明方法在不同板栗品种的种子胚芽上实施，均能诱导产生大比率多倍化植株。

表2不同实施例多倍化植株比率

注:表中数据后不同字母表示差异显著(α＝0.05)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。