本发明涉及植物生物技术领域，特别涉及葡萄果实果肉愈伤组织的培养方法。
背景技术：
目前葡萄基因组的研究是葡萄科学研究中的热点，葡萄基因组研究的方向主要涉及植株抗性、果实品质果实生产特性等几个大的方面，其中葡萄重要经济性状尤其是与果实品质形成相关的分子机理研究也成为是葡萄基因组研究的重点问题之一。分子机理研究最终的落脚点还是在基因功能验证上，但是由于葡萄的转基因技术还不够成熟，基因转化效率极低，而且转基因周期长，耗时耗力。愈伤组织是一种良好的验证基因功能的材料，愈伤组织是指外植体在离体培养条件下，形成的一团无极性、能旺盛分裂的薄壁细胞团，在培养过程中，经过诱导分化可以发育成完整的再生植株。
目前对于愈伤组织的研究多集中研究叶片的愈伤组织，而对于葡萄而言，果实品质的研究是葡萄科研工作者的重点研究内容，生产优质高产的葡萄果实也是科研工作者的而终极目标。仅研究葡萄叶片愈伤组织是不能满足科研要求的，尤其是对于葡萄果实而言，必须研究果实本身才能够达到生产优质果实的目的。目前葡萄的研究中，对果实品质形成以及果实成熟发育的分子机理研究是一大热点，因此，培养葡萄果实果肉的愈伤组织是研究葡萄果实品质形成以及果实成熟发育分子机理的一条非常重要的途径。
本发明提供了一种葡萄果实愈伤组织的培养方法，为今后葡萄的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径，同时也为葡萄果实愈伤的培养提供了参考和借鉴。
技术实现要素：
发明目的：为解决现有技术中的问题，本发明提供了一种葡萄果实愈伤组织的诱导方法及其培养基，实现了以葡萄果实作为外植体的组织培养。
技术方案：本发明所述的葡萄果实愈伤组织的诱导培养基，含有tdz0.8～1.2mg/l+iba0.3～0.5mg/l。
具体的，所述的葡萄果实愈伤组织的诱导培养基的组成为：基础培养基+tdz+iba+糖18～22g/l+琼脂5～7g/l。
其中，所述的糖为葡萄糖。
所述诱导培养基的ph为5.35～5.45。
tdz的浓度进一步为1.0mg/l，iba的浓度为0.4mg/l。
所述的基础培养基为改良wpm培养基，其组成为：kno31450～1550mg/l、(nh4)2so4580～620mg/l、co(nh2)2140～160mg/l、mgso4.7h2o380～420mg/l、kh2po4170～190mg/l、ki1.0～1.2mg/l、mnso4.4h2o18～22mg/l、znso4.7h2o8～12mg/l、h3bo34～6mg/l、fe-eddha8～12mg/l、ca(no3)290～110mg/l、肌醇90～110mg/l、烟酸1.5～2.5mg/l、维生素b10.8～1.2mg/l、维生素b60.8～1.2mg/l、维生素c1.8～2.2mg/l。
进一步的，所述改良wpm培养基的组成为：kno3硝酸钾1500mg/l、(nh4)2so4硫酸铵600mg/l、co(nh2)2尿素150mg/l、mgso4.7h2o七水合硫酸镁400mg/l、kh2po4磷酸二氢钾180mg/l、ki碘化钾1.1mg/l、mnso4.4h2o四水合硫酸锰20mg/l、znso4.7h2o七水合硫酸锌10mg/l、h3bo3硼酸5mg/l、fe-eddha乙二胺邻二羟基乙酸铁10mg/l、ca(no3)2硝酸钙100mg/l、肌醇100mg/l、烟酸2mg/l、维生素b11mg/l、维生素b61mg/l、维生素c2mg/l。
本发明还提供了一种葡萄果实愈伤组织的诱导方法，采用所述的诱导培养基诱导愈伤。
具体的，所述的葡萄果实愈伤组织的诱导方法，包括：将葡萄果实消毒后去皮，取果肉块接种于诱导培养基上进行诱导培养直至愈伤形成。
其中，所述的消毒方法包括：葡萄果实用流水冲洗干净后，无菌条件下，用70～75％的乙醇消毒30～40秒后用无菌去离子水冲洗2～3次，然后用8～10％的次氯酸钠消毒6～8分钟，再用无菌去离子水冲洗4～6次。
所述的诱导培养为暗培养。
所述诱导培养的温度为24～27℃。
所述葡萄果实的生长阶段为花后10～25天，进一步优选为10～18天。
所述葡萄的品种为“夏黑”。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
以往的愈伤组织培养通常用叶片来实现，而叶片通常有两个来源，第一个来源是来自于田间植株，而田间植株叶片容易受植株基因型、年龄、生理状态的影响较大，如果取的叶片年龄或者生理状态不一样，形成愈伤组织的能力也不一样，甚至于无法形成愈伤组织，愈伤组织性状上也会有会有差异，因此愈伤组织的表现会不均一，性状表现不一致的愈伤组织会影响后期愈伤组织的增殖效果，进一步会影响使用愈伤组织的其他试验的实验结果，会对试验结果造成很大差异；其次，田间叶片需要进行消毒后培养，消毒剂对叶片的伤害也会造成叶片成活率极大下降，愈伤培养的成功率也会很低；一般田间叶片也上组织培养成功率不到20％。叶片的第二个来源一般来源于组培苗，而葡萄组培苗的培养方法是通过茎段培养的，葡萄的茎段一年只能够培养一次，周期长而且容易携带病毒，而植物病毒通过常规消毒灭菌是不能去除的，其会随着芽的萌发传递到叶片中，使叶片的生理机能受到干扰或破坏，从而导致愈伤组织的活力降低，试验后期愈伤组织的繁殖能力会极大降低，随之会逐渐死亡，不能够保证实验的延续性。
本发明所用果肉来直接来自果实，而果实取材时只需要根据开花后的天数取，实验材料的年龄和生理状态能够保持高度的一致性。从一个果实上取全部果肉就能够培养出大量的愈伤组织，而来自于同一果实的愈伤组织无论是生理状态还是基因型还是年龄都是完全一致的，无论后期将愈伤组织用于任何试验，都能够保证实验基础高度一致，不会对试验造成误差。这一优点是叶片完全不能够做到的。其次果实果肉本身无菌无病毒，不需要对果肉进行消毒处理，仅仅需要对果皮进行简单的消毒处理，而这个处理不会对果肉造成任何的伤害。果肉培养时不受消毒剂的影响，同时也能够消除病毒病害对愈伤组织的影响。而且相同生理状态的果实培养的果肉愈伤组织性状稳定，增殖能力强，材料能够保持高度的一致性，对于需要使用愈伤组织的试验来说，果肉愈伤组织是最稳定，最一致，增值系数最高的材料。
本发明成功建立了‘夏黑’葡萄果实愈伤组织的培养方法，果实愈伤组织诱导率达到100％，为‘夏黑’葡萄的分子生物学以及基因工程研究提供了一条新的途径，为葡萄基因工程研究和基因转化提供一种新的试验材料，同时也为葡萄果实愈伤的培养提供了参考和借鉴。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1
1、试验材料
所用植物材料是‘夏黑’葡萄花后10-18天、20-25天、35-40天的果实。
2、试验方法
2.1、外植体处理
首先果实表面用流水冲洗干净，在无菌条件下，用75％的乙醇消毒30秒后用无菌去离子水冲洗3次，然后用10％(质量分数)的次氯酸钠消毒8分钟，再用无菌去离子水冲洗6次，然后用无菌滤纸吸干果皮表面水分。消毒完成后用无菌的手术刀片小心削去果皮，将种子去掉，果肉切成0.5毫米的薄片后用直径0.5厘米的打孔器将果肉打成圆片后接种于已经准备好的愈伤组织诱导培养基中。
2.2、外植体培养
在没有光照的黑暗培养箱中25℃培养8天后果实圆片周围会有不规则形状的愈伤组织长出，这时在无菌条件下切下果肉边缘的愈伤接种于愈伤组织增殖培养基(改良wpm培养基)中，培养30-35天以后，愈伤体积变为原来体积的2-4倍大小，增殖后的愈伤组织一部分可以用来做分子生物学以及基因工程相关试验，剩余的一部分可以再次接种于增殖培养基中继续增殖培养，供后续试验所用。
3、培养基配方筛选试验过程
3.1、将葡萄‘夏黑’的花后果肉分别接种于附加不同浓度tdz(0.5mg/l、1mg/l、1.5mg/l)、iba(0.2mg/l、0.4mg/l、0.6mg/l)的改良wpm培养基上研究不同配比的植物生长调节剂对葡萄‘夏黑’果肉愈伤组织诱导培养的影响。培养基中附加葡萄糖(20g/l)、琼脂粉(6g/l)，ph为5.4。
3.2、将葡萄‘夏黑’的三个不同生长时期(花后10-18天、20-25天、35-40)的果肉分别接种于改良wpm+tdz(1mg/l)+iba(0.2mg/l)+葡萄糖(20g/l)+琼脂粉(6g/l)，ph为5.4的培养基上研究不同的果实生长时期对葡萄‘夏黑’果实愈伤组织诱导的影响。
3.3、将葡萄‘夏黑’花后10-18天的果肉接种于改良wpm+tdz(1mg/l)+iba(0.2mg/l)+葡萄糖(20g/l)+琼脂粉(6g/l)，ph为5.4的培养基上，一部分在光照环境下培养，一部分在完全遮光的黑暗条件下培养，研究光照和暗培养对葡萄‘夏黑’果实愈伤组织诱导的影响。
4、果肉愈伤组织质量评价指标
果肉愈伤组织的质量好坏，有几个评价指标：
4.1、愈伤组织的颗粒大小
以培养20天的果肉愈伤组织为准，测量不同培养基和不同培养条件下诱导果肉愈伤组织的大小，愈伤组织的直径小于3毫米为不合格愈伤组织，愈伤组织直径大于3毫米为合格。
4.2、愈伤组织的颗粒散碎度
步骤4.1筛选完成后，筛选出大小合适的愈伤组织。颗粒散碎表示:愈伤组织容易松散，不紧密，愈伤组织表面毛刺状不平滑。颗粒致密表示:愈伤组织颗粒致密硬度高，愈伤组织表面光滑状，细胞致密，胞质密度高，愈伤组织边缘清晰。
4.3、愈伤组织的色泽
愈伤组织合格颜色应该为深黄或黄白色，深黄或黄白色愈伤组织没有水渍化现象，组织颗粒致密，硬度高，愈伤组织表层细胞层清晰，有明显的表层致密层结构，是合格质量好的愈伤组织。
4.4、愈伤组织的再分化能力
愈伤组织分化能力好坏取决于前面三个步骤(4.1-4.3)，大小适中、组织颗粒致密、硬度较高、颜色黄白色的愈伤组织具有很强的分化能力，分化出的愈伤组织也有很高的质量。否则愈伤组织分化能力弱，分化出来的愈伤组织质量也不好。
5、试验结果
表1不同的激素配比对‘夏黑’果实愈伤组织的诱导的影响
从试验结果可以得知，培养基中添加tdz和iba的浓度分别是1mg/l和0.4mg/l时，产生的愈伤组织大小适中，组织紧密。颜色黄白色，组织分化能力强，愈伤组织诱导率达到100％，是最合适的果实愈伤组织诱导激素配比。
表2葡萄果实的不同生长时期对‘夏黑’果实愈伤组织的诱导的影响
果实的不同生长时期对愈伤组织的诱导有很大的影响，从试验结果可以看出，花后10-18天的果实比较容易诱导愈伤组织，诱导率达到100％。葡萄在花后10-18天果实发育非常小，但是因为葡萄果实整个发育期只有40-65天，因此，只能选择非常幼小的果实来培养愈伤组织，果实发育18天以后，果实逐渐趋于成熟，在这个状态下的果肉愈伤组织培养出来都会呈现水渍状，长得非常疏松，不利于后期实验，有部分果肉也不能够培养出愈伤组织来。
表3光照条件对‘夏黑’果实愈伤组织的诱导的影响
葡萄果实的愈伤组织培养不同于叶片或者其他外植体愈伤组织，需要在完全黑暗的条件下培养，在试验中，如果按照通用的叶片愈伤组织培养的条件培养果实愈伤组织，得到的愈伤组织不仅质量差，而且愈伤组织诱导率非常低。而在完全黑暗条件下培养的愈伤组织，诱导率可以达到100％，愈伤组织质量也很好，因此，葡萄果实愈伤组织培养不需要光照。
综上，最终筛选出最适合‘夏黑’葡萄果肉愈伤组织的培养基配方：
改良的wpm+tdz(1mg/l)+iba(0.4mg/l)+葡萄糖(20g/l)+琼脂粉(6g/l)
培养基ph值＝5.4，最适合的果实生长时期是花后10-18天。培养条件为完全暗培养，温度25℃。在这个培养基配方和培养条件下‘夏黑’果实愈伤诱导率达到100％。其中，
改良wpm培养基：改良的wpm培养基是在wpm培养基的基础上，根据葡萄果肉生长的特点，对wpm培养基的一些无机盐元素的含量进行了调整，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量适中，其养分的数量和比例合适，能满足葡萄果实果肉细胞的营养和生理需要，本实验中由于葡萄果实愈伤组织的特殊性，因此需要对愈伤组织的生长特点细化改良wpm培养基的组成成分。培养基成分如下：每一升wpm培养基含有：kno3硝酸钾1500mg/l、(nh4)2so4硫酸铵600mg/l、co(nh2)2尿素150mg/l、mgso4.7h2o七水合硫酸镁400mg/l、kh2po4磷酸二氢钾180mg/l、ki碘化钾1.1mg/l、mnso4.4h2o四水合硫酸锰20mg/l、znso4.7h2o七水合硫酸锌10mg/l、h3bo3硼酸5mg/l、fe-eddha乙二胺邻二羟基乙酸铁10mg/l、ca(no3)2硝酸钙100mg/l、肌醇100mg/l、烟酸2mg/l、维生素b11mg/l、维生素b61mg/l、维生素c2mg/l。
iba：吲哚丁酸，是组织培养中常用的植物生长调节剂，对于愈伤组织的诱导和生长非常有效，配制成1mg/ml的母液供配制培养基使用。
tdz：tdz是一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，且可以对植物激素和生理活性物质的作用来调节植物的生长发育过程，是一个作用力很强的植物生长调节剂。在农业上有广泛的应用和推广价值。
葡萄糖：葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。植物可通过光合作用产生葡萄糖。葡萄糖在植物组织培养基中起到能源物质和渗透调节剂的作用，除供能之外，还能诱导愈伤组织的再分化，本发明成功之处还在于用葡萄糖代替蔗糖，而使得愈伤组织诱导效率更高(表4)。本试验中所用葡萄糖浓度为20g/l。
琼脂粉：琼脂粉在培养基中主要的作用是固定支撑的作用。一般使用纯度较高，没有杂质的琼脂粉。
表4
培养基ph值：‘夏黑’葡萄果肉愈伤组织的培养对ph值的要求比较严格，过高或者过低都会造成植株生长不好，或者死亡，因此一定要精准调节ph值到5.4。