专利名称:一种木霉制剂与杀菌剂混用防治辣椒疫病的方法
技术领域：
本发明涉及植物病害的生物防治及化学防治技术领域：
，尤其涉及一种木霉制剂与杀菌剂混用防治辣椒疫病的方法。
背景技术：
辣椒疫病俗称“死秧病”,是由辣椒疫霉(Phytophthora capsici)引起的一种土传病害，是一种毁灭性病害，可造成严重产量损失。由于病原菌在病害流行期产生大量的游动孢子，短期内可迅速引起辣椒大面积死亡。辣椒疫病常规防控技术已难以有效控制，且易引起生态、环境问题。
公开号CN102415378A的发明专利申请公开了一种可促进生长并防治辣椒疫病的杀菌剂及其应用，该杀菌剂根据重量百分比包括肉桂醛O.1 10%，乳化剂10 30%，氮酮O.1 10%，酒精20 50%，其余为水。该杀菌剂可用于防治辣椒疫霉和促进作物生长，但其使用了化学制剂且植物提取物成本较高，不利于大规模应用。多年来，化学防治是生产实践中长期治理辣椒疫病的主要措施，但大量使用化学药剂对人类健康潜在的危害、对食品和环境的污染、对非靶标生物的影响以及导致病原菌抗药性的加速发展等问题已经引起社会的日益关注，减量使用化学农药是发展的必然趋势。
近年来，辣椒疫病的防治方面引入了生防制剂，尤其木霉生防制剂证明对辣椒疫病防治是有效的。我们在多年研究的基础上，筛选出了棘孢木霉株(Trichodermaasperellum)CGMCC 6422，对辣椒疫病防治效果达到70%左右。然而，虽然木霉菌具有腐生性、抗逆性和对病原菌具有持久拮抗作用，可长期存活在土壤中等特性，可减少土壤病原菌接种体数量，但对病害流行时期的病原菌作用显示了局限性。因此，从目前防治辣椒疫病的杀菌剂中筛选高效药剂，同时这些杀菌剂对木霉生防制剂的菌丝、孢子萌发和孢子产生都无抑制作用，这也是本发明的核心内容。在木霉制剂防治的基础上，在病害流行期适当施用少量杀菌剂和较少的次数，可有效防治辣椒疫病，从而达到化学农药减量使用。
木霉生防制剂与减量杀菌剂相结合防治辣椒疫病的技术迄今尚未报道，该技术在减少杀菌剂数量的基础上，有效控制辣椒疫病的流行，从而减少了损失；同时，减少了杀菌剂的污染和保护了生态环境。据此，本发明拟设计和创立了一种生物防治与农药相结合协同控制辣椒疫病的新方法。
发明内容
本发明提供了一种木霉制剂与杀菌剂混用防治辣椒疫病的方法，用以解决辣椒疫病单纯生物防治不能控制病害流行的问题，同时减量使用化学药剂。
一种在辣椒种植过程中木霉制剂与杀菌剂混用防治辣椒疫病的方法，辣椒的种植包括播种、育苗、移栽定植、栽培和采收；所述的方法包括
(1)播种时，将辣椒种子与木霉制剂混合后播种；或者，在辣椒苗移栽定植时，施用木霉制剂；[0009](2)辣椒栽培期间，在病害发生前或发生初期施用杀菌剂；
其中，所述木霉制剂中的活性菌株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ThzOl,棘孢木霉ThzOl的保藏号为CGMCC No. 6422 ；
所述的杀菌剂为丁子香酚和双炔酰菌胺中的一种或两种。
棘孢木霉ThzOl制备的木霉制剂在田间对辣椒疫病具有良好的防效，在病害发生期与杀菌剂联合使用，可有效防止病害的发生；同时能减量杀菌剂的使用。木霉制剂一般由活性菌株和相应的辅料组成，辅料不仅作为载体，而且给菌株生长提供养分，防疫的关键在于活性菌株的选择。
本发明中，所述的棘孢木霉ThzOl已保藏，保藏单位位于北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期2012年8月13号，保藏号CGMCCNo. 6422。依据形态学特征和分子数据分析，该菌株的分类命名为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。
该菌株是从临安高山蔬菜园发病的辣椒根围土土壤中采集得到的，该菌株的生物学特性为菌落在PDA固体培养基上25°C下培养，3-4天扩展为9cm，初期白色稀疏，菌丝沿培养基表面匍匐生长，后形成绿色产孢区，反面白色，菌丝具隔；分生孢子球形，近球形，单个近无色，聚集时呈淡黄绿色，壁光滑。瓶梗直、安瓶形，宽度3. 0-5. 6 μ m。CMD上分生孢子球形至亚球形，3. 8-5. 9X2. 8-4. 8 μ m。形态学特征符合棘孢木霉菌特征。依据ITS rDNA (SEQ ID NO.1)和转录因子 la(tef1-a)序列(SEQ ID NO. 2)分析，与 GenBank中的模式和证实的棘孢木霉菌序列最一致。这些证实该菌株为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)。
由于木霉制剂施用后需要定植一段时间才能发挥作用，为此，将所述的木霉制剂于种植的前期(播种时或辣椒苗移栽定植时)施用，能使其中的微生物较好地定植于土壤中，以便防止病害发生。
为了进一步增强木霉菌剂的作用效果，在辣椒栽培期间，根据当地辣椒疫病病情测报信息，可以在病害发生前O. 5-1个月在辣椒根际周围施用木霉制剂。这样，可以起到加强防效的作用。
每次施用时，所述的木霉制剂的用量优选为1. 5_2g/株，微生物定植效果较好，且不会造成制剂浪费。当在辣椒栽培期间施用时，施用量也可根据当地病害发生情况酌量调
難
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所述的木霉制剂可以通过如下方法制备将棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液接种到煮熟灭菌的麦粒中，于12小时光照和12小时黑暗交替培养15-20天，制得木霉制剂。
其中，所述的棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液通过如下方法制备将棘孢木霉ThzOl接种到PDA培养基中，于23-28°C下培养5_6天；培养完成后，将孢子刮入灭菌水中，配制得到棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液。
所述的棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液的活菌浓度优选为107-108个/mL。
所述的麦粒是适合棘孢木霉ThzOl生长的基质。
以每千克麦粒计，所述的棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液的用量优选为2_4mL。
棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液接入麦粒后的培养时间优选为18天，便于基质上产生大量的孢子。[0024]培养期间可以及时翻动麦粒，以便麦粒上充分长上棘孢木霉ThzOl孢子。
所述的杀菌剂的施用可以按照使用说明进行，一般在病害发生初期进行第一次施药，进一步施药视辣椒生长季节病害发展情况和药剂的持效期来决定。
辣椒栽培期间，根据当地辣椒疫病病情测报信息，在病害发生前或发生初期施用所述的杀菌剂，能有效防治病害。优选地，可以在病害发生前1-2天或发生初期田间出现零星病斑植株时施用所述的杀菌剂。
所述的杀菌剂可以为丁子香酚；以每亩地计，丁子香酚有效成分的用量可以为O. 078-0. 084g ;优选为O. 081g。丁子香酚可以采用保定市亚达化工有限公司生产的产品(有效成分含量为O. 3% )，以每亩地计，取26-28g，兑水60L，得到有效成分浓度为1. 3-1. 4μ g/mL的药剂，然后进行喷施。丁子香酚用量过少，起不到防治效果；用量过大，会影响棘孢木霉ThzOl活性，甚至会杀灭木霉菌株。该用量条件下，丁子香酚与木霉制剂联用效果最好。
所述的杀菌剂可以为双炔酰菌胺；以每亩地计，双炔酰菌胺有效成分的用量可以为1. 8-2.1g ;优选为1. 95g。双炔酰菌胺可以采用瑞士先正达作物保护有限公司生产的产品(有效成分含量为250g/L)，以每亩地计，取7. 2-8. 4g (约相当于7. 2-8. 4mL)，兑水30L，得到有效成分浓度为60-70 μ g/mL的药剂，然后进行喷施。同样地，该用量条件下，双炔酰菌胺与木霉制剂联用效果最好。
病害发生后，可以根据辣椒病害发展情况进一步施用杀菌剂，增强防效。每次施用量为丁子香酚为有效成分达到O. 078-0. 084g/亩，优选为O. 08Ig/亩；或者，双炔酰菌胺为有效成分达到1. 8-2.1g/亩；优选为1. 95g/亩。
试验证实，木霉制剂和杀菌剂混合使用有效减少了杀菌剂的用量，达到与化学防治相同的防治效果，同时也对木霉制剂是安全的。生产中，杀菌剂丁子香酚(保定市亚达化工有限公司)推荐使用量为 30g/亩；而木霉制剂和丁子香酚混合使用，27g/亩丁子香酚使用量与单独使用量相同，相当于减少3g/亩，即减量使用杀菌剂10% ;抑制试验显示，木霉制剂在使用该杀菌剂30g/亩条件下是安全的。同样地,生产中，杀菌剂双炔酰菌胺(瑞士先正达作物保护有限公司)推荐使用量为12g/亩；而木霉制剂和双炔酰菌胺混合使用，7. Sg/亩双炔酰菌胺施用量与单独使用量相同，相当于减少4. 2g/亩，即减量使用杀菌剂35% ；抑制试验显示，木霉制剂在使用该杀菌剂9. 6g/亩条件下是安全的。
本发明中，病害发生时间主要根据当地气象资料或病情测报信息判断。辣椒疫病流行病害的发病时间与季节、气候等有关，但每年发生时期略有变化。如辣椒疫病在杭州大棚温室中发生的时间在3月底左右，而露地发生在4月中旬。不同地区由于气候条件不同，病害发生时间略有不同，如杭州地区露地一般为4月中旬月，而宁波地区一般要提早10天左右。
本发明在辣椒种植期间，在合适的时期，按照一定的顺序，采用合适剂量的木霉制剂和杀菌剂混合使用来防治辣椒疫病。
采用本发明方法，具有如下有益效果
(I)棘孢木霉ThzOl制备的木霉制剂在田间对辣椒疫病具有良好的防效，单独木霉制剂可有效降低初侵染源。
(2)在病害发生期增加杀菌剂的使用，可有效控制病害流行。该技术使用可减量杀菌剂的施用，杀菌剂的施用量对木霉菌的生长没有抑制作用，而且丁子香酚减量施用了10%,双炔酰菌胺减量施用了 35%，既有效地控制了辣椒疫病的流行，又减少了农药在土壤和辣椒产品中的残留，确保了环境和产品的安全。
(3)本发明方法设计合理，操作简便，投入和运行成本较低，适合大规模操作。该方法的推广应用，对于辣椒健康、安全生产以及可持续农业发展都有促进作用。
图1为木霉制剂与不同剂量的双炔酰菌胺混合使用后田间辣椒疫病发病率、病情指数和防治效果；其中，图A-C分别为施药15天后病害发病率、病情指数和防治效果测定结
果O
图2为木霉制剂与不同剂量的丁子香酚混合使用后田间辣椒疫病发病率、病情指数和防治效果；其中，图A-C分别为施药15天后病害发病率、病情指数和防治效果测定结
果O
图3为两种杀菌剂分别对辣椒疫霉菌PC004和棘孢木霉ThzOl的抑制效果；其中，图A和图C分别为辣椒疫霉菌PC004在含有65 μ g/ml双炔酰菌胺或1. 35 μ g/ml 丁子香酚原药的PDA平板上培养7天；图B和图D分别为棘孢木霉ThzOl在含有65 μ g/ml双炔酰菌胺或1. 35 μ g/ml 丁子香酚原药的PDA平板上培养3天。
具体实施方式
棘孢木霉ThzOl菌株
棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ThzOl菌株是从临安高山蔬菜园发病的辣椒根围土土壤中采集得到的，该菌株的生物学特性为菌落在PDA固体培养基上25°C下培养，3-4天扩展为9cm，初期白色稀疏，菌丝沿培养基表面匍匐生长，后形成绿色产孢区，反面白色，菌丝具隔；分生孢子球形，近球形，单个近无色，聚集时呈淡黄绿色，壁光滑。瓶梗直、安瓶形，宽度3. 0-5. 6 μ m。CMD上分生孢子球形至亚球形，3. 8-5. 9X2. 8-4. 8 μ m。形态学特征符合棘孢木霉菌特征。依据ITS rDNA (SEQ ID NO.1)和转录因子la(tef1-a)序列分析，与GenBank中的模式和证实的棘孢木霉菌序列最一致。这些证实该菌株为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。
棘孢木霉ThzOl菌株已保藏，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2012年8月13号，保藏号CGMCCNo. 6422。
实施例1木霉制剂的制备
(I)制备棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液将棘孢木霉ThzOl接种到PDA培养基中，于25°C下培养5-6天；培养完成后，将孢子刮入灭菌水中，配制得到棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液(活菌浓度为IO8个/mL)。
(2)制备木霉制剂将棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液接种到煮熟灭菌的麦粒(饲料麦粒)中，培养期间及时翻动，在12小时光照和12小时黑暗交替培养18天后，诱导培养基上产生大量的孢子，孢子连同孢子一起制备成木霉制剂。
以每千克麦粒计，棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液的用量为3mL。
实施例2杀菌剂的筛选[0048]选择生产中常用于防治辣椒疫病的13种杀菌剂用于筛选试验，包括80%三乙膦酸铝(浙江嘉华化工有限公司)；250g/L双炔酰菌胺(瑞士先正达作物保护有限公司)；250g/L阿米西达(英国先正达有限公司)；72%霜脲锰锌(美国杜邦公司)；50%烯酰吗啉(石家庄伊诺生化有限公司);69%烯酰锰锌(科利隆生化有限责任公司);72%瑞毒霉(江苏凯利尔生化公司);50%乙铝锰锌(利民化工有限公司);46%氢氧化铜(美国杜邦公司)；75%百菌清(利民化工有限公司)；0.3%丁子香酚(保定市亚达化工有限公司)；20%氟吗啉(沈阳科创化学品有限责任公司)；66.8%丙森缬霉威(德国拜尔作物科学公司)。
药剂的筛选分为以下三个过程
(I)不同杀菌剂对棘孢木霉ThzOl菌丝生长的抑制作用
采用菌丝生长速率测定法测定不同杀菌剂对棘孢木霉ThzOl菌丝生长的抑制作用，筛选出杀菌剂对棘孢木霉ThzOl菌丝不抑制的药剂。
方法首先测定各药剂对木霉菌丝生长开始抑制率的浓度范围，然后围绕这个浓度上下设置5个系列浓度。将供试药剂分别用配成一定浓度的母液，根据已设定的浓度吸取所需要的体积，加入到三角瓶中。三角瓶含有融化了的PDA培养基，通常在45°C左右的加入为宜，混匀后分别倒入灭菌的培养皿(Φ =90_)中，以加入等体积无菌水的PDA平板为对照。用打孔器(Φ = 5mm)切取在PDA培养基上培养2天的木霉菌菌饼，接种于含药的PDA培养基中央，置于25°C恒温培养箱内黑暗培养，每个浓度处理重复3次。3天后测量供试菌株在不同浓度含药培养基上的菌落直径，与对照比较计算各药剂处理对菌落扩展的生长抑制率，分析比较不同杀菌剂对供试病菌菌丝生长的影响，计算药剂的毒力回归方程。根据毒力回归方程计算抑制率为I %时药剂浓度的理论值，在此理论值的基础上设置药剂浓度梯度，在相同的培养方式和条件下，确定完全不抑制菌丝生长的实测值，每个浓度处理重复3次。
结果表明，13种杀菌剂中，对棘孢木霉ThzOl菌丝生长的抑制效果较差的杀菌剂有三乙膦酸铝、双炔酰菌胺、霜脲锰锌、烯酰吗啉、烯酰锰锌、氢氧化铜和丙森缬霉威，其毒力接近或超过1000 μ g/ml。对棘孢木霉ThzOl菌丝生长的抑制效果较好的杀菌剂有百菌清和丁子香酚，其EC50值分别为4. 15 μ g/ml和2. 62 μ g/ml (表I)。
通过比较抑制率为I %时药剂的理论值与完全不抑制菌丝生长的药剂浓度实测值发现理论值与实测值基本保持一致，如果 能够筛选出合适的混用杀菌剂，则实测值可以作为田试验中药剂施用浓度的参考值(表2)。
表1.药剂对棘孢木霉ThzOl菌丝生长的抑制效果
权利要求
1.一种在辣椒种植过程中木霉制剂与杀菌剂混用防治辣椒疫病的方法，辣椒的种植包括播种、育苗、移栽定植、栽培和采收，其特征在于，所述的方法包括 (1)播种时，将辣椒种子与木霉制剂混合后播种；或者，在辣椒苗移栽定植时，施用木霉制剂； (2)辣椒栽培期间，在病害发生前或发生初期施用杀菌剂； 其中，所述木霉制剂中的活性菌株为棘孢木霉(Trichodermaasperel lum) ThzOl,棘孢木霉ThzOl的保藏号为CGMCC No. 6422 ； 所述的杀菌剂为丁子香酚和双炔酰菌胺中的一种或两种。
2.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于，在辣椒栽培期间，在病害发生前O.5-1个月在辣椒根际周围施用木霉制剂。
3.根据权利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述的木霉制剂的用量为1.5-2g/株。
4.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的木霉制剂通过如下方法制备将棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液接种到煮熟灭菌的麦粒中，于12小时光照和12小时黑暗交替培养15-20天，制得木霉制剂。
5.根据权利要求
4所述的方法，其特征在于，所述的棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液的活菌浓度为IO7-1O8个/mL。
6.根据权利要求
4所述的方法，其特征在于，以每千克麦粒计，所述的棘孢木霉ThzOl孢子悬浮液的用量为2-4mL。
7.根据权利要求
4所述的方法，其特征在于，培养期间及时翻动麦粒。
8.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的杀菌剂为丁子香酚；以每亩地计，丁子香酚有效成分的用量为O. 078-0. 084g。
9.根据权利要求
1所述的方法，其特征在于，所述的杀菌剂为双炔酰菌胺；以每亩地计，双炔酰菌胺有效成分的用量为1. 8-2. lg。
专利摘要
本发明公开了一种木霉制剂与杀菌剂混用防治辣椒疫病的方法，包括播种时，将辣椒种子与木霉制剂混合后播种；或者，在辣椒苗移栽定植时，施用木霉制剂；辣椒栽培期间，在病害发生前或发生初期施用杀菌剂；其中，所述木霉制剂中的活性菌株为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)Thz01，棘孢木霉Thz01的保藏号为CGMCC No.6422；所述的杀菌剂为丁子香酚和双炔酰菌胺中的一种或两种。本发明方法所用的木霉制剂在田间对辣椒疫病具有良好的防效，单独使用可有效降低初侵染源；在病害发生期增加杀菌剂的使用，可有效控制病害流行，同时减量杀菌剂的施用，减少了农药在土壤和辣椒产品中的残留，确保了环境和产品的安全。
文档编号A01N63/04GKCN103053624SQ201210578583
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月27日
发明者张敬泽, 张艳丽, 蒋恒 申请人:浙江大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan