上培养，每处理20个，重复3次，培养条件同B，20d后统计污染率、褐化率以及启动率。
[0026] 试验发现随着消毒时间的延长，污染率逐渐降低，褐化率逐渐升高，启动率逐渐下 降；其中处理2污染率较处理1显著大幅度下降，下降幅度大于30%，启动率仍能保持在 90%以上；处理3污染率较之处理2下降幅度小于10%，启动率却低至77. 8% ;综合考虑， 确定75%酒精60s+3% NaCIO lOmin为紫枝玫瑰冬季休眠芽组织培养最佳消毒处理方式。
[0027] 表1不同消毒方式对外植体的影响
[0029]b.最佳初代培养基的研宄
[0030] 植物生长调节剂是诱导紫枝玫瑰冬季休眠芽组织再生必不可少的物质，为确定最 佳的浓度组合，设置4个处理，每处理接种20个外植体，重复3次，20d后统计启动率，观察 并记录其生长情况。
[0031] 试验发现BA对诱导紫枝玫瑰冬季休眠芽组织再生起关键作用，BA浓度的提高有 利于休眠芽的萌发；在BA浓度相同的情况下，0. 05mg/LNAA比0. lmg/LNAA启动率高。处理3 与处理4休眠芽在萌发成不定芽的同时有愈伤生成，有利于进一步的增殖培养，且处理3启 动率最高，因此确定MS+lmg/LBA+0. 05mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂为最佳初代培养基。 [0032]表2不同浓度植物生长调节剂对外植体不定芽萌发的影响
[0034] c.最佳增殖培养基的研宄
[0035] 为实现紫枝玫瑰的快速繁殖，需对初代培养萌发的不定芽进行增殖培养，设置BA、 NAA和GA 3三种植物生长调节物质不同浓度组合的4个处理，将最佳初代培养基上萌发的休 眠芽外植体切下转接到其上，每处理20个，重复3次，观察记录生长状况，30d后统计增殖系 数。
[0036] 试验发现添加GA3有助于不定芽的增殖，增殖系数随GA 3&度升高而呈现上升趋 势；增加BA浓度，不定芽增殖系数显著上升，丛芽分蘖多，长势好，因此确定增殖系数最高 的处理 4 配方 MS+2mg/LBA+0. 05mg/LNAA+0. 6mg/L GA3+30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂为最佳增殖 培养基。
[0037] 表3不同浓度植物生长调节剂对外植体不定芽增殖的影响
[0039] d.最佳生根培养基的研宄
[0040] 以1/2MS培养基为基本培养基，添加不同浓度的NAA、IBA、活性炭，切取生长健壮、 茎高l-2cm的不定芽单芽接入生根培养基，共4个处理，每个处理20个不定芽，重复3次， 观察并记录生根状况，30d后统计生根率。
[0041] 试验发现除处理4外，其他3个处理生根率均达到90%以上，处理2生根率最高， 但观察不定芽生根状况及长势发现，处理1不定根短粗，植株部分长势快，处理2不定根细 长，植株部分长势慢，部分叶片变黄，处理3不定根短粗，地上部分生长缓慢，植株矮小。综 合以上，确定1/2MS+0. 2mg/LIBA+0. 2mg/LNAA+lg活性炭+30g/L蔗糖+7g/L琼脂为最佳生 根培养基。
[0042] 表4不同浓度植物生长调节剂对不定芽生根的影响
[0044] 本发明具有污染率低，繁殖系数高，培育周期短，打破秋冬季繁殖限制等优势，很 好的解决了玫瑰传统繁殖方法效率低、周期长的问题，可广泛应用于实际生产。
[0045] 本发明利用玫瑰秋冬季休眠芽为外植体，通过组织培养技术实现玫瑰的快速繁 殖。本发明对提高玫瑰的繁殖系数，缩短培育周期，打破秋冬季繁殖限制，实现玫瑰种苗规 模化生产具有重要意义。
【主权项】
1. 一种利用秋冬休眠芽为外植体进行玫瑰组培快繁的方法，其特征在于包含以下步 骤： (A) 外植体的消毒处理：于秋冬季落叶后晴朗天气剪取一年生生长健壮、无病虫害的 枝条，用软毛刷轻刷干净，剪成包含3-4个休眠腋芽的小段，用干净纱布包裹后流水冲洗 后，移入无菌工作台进行消毒处理； 先用75%酒精浸泡并匀速搅动60s，无菌水冲洗3-5遍，再用3%NaC10浸泡并匀速搅动 5-10min，无菌水冲洗3-5遍，取出后用无菌滤纸吸干表面水分，用手术刀将其切成的单腋 芽茎段备用； (B) 初代培养：初代培养基配方为MS+lmg/LBA+0.0 5mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂， pH值为5. 8 ;培养条件为光照强度2000-3000LX，光照时长14h/d，温度25±2°C ;将消毒后 的单腋芽茎段用手术刀剥去腋芽鳞片后横向接入初代培养基上，暗培养1周，20d后休眠芽 萌发，30d后切取萌发且长势良好的休眠芽接入增殖培养基上继续培养； (C) 增殖培养：增殖培养基配方为 MS+2mg/LBA+0. 05mg/LNAA+0. 6mg/L GA3+30g/L 蔗糖 +7g/L琼脂，pH值为5. 8 ;培养条件为光照强度2000-3000Lx，光照时长14h/d，温度25±2°C; 由初代培养基转接到增殖培养基上的休眠芽30d后可分化出大量丛生芽； (D) 生根培养：生根培养基配方为1/2MS+0. 2mg/LIBA+0. 2mg/LNAA+l-l. 5g活性炭 +30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH值为5.8 ;切取丛生芽中生长健壮、茎高l-2cm的不定芽单芽， 接入生根培养基；培养条件为光照强度2000-3000LX，光照时长14h/d，温度25±2°C ;培养 2-3周后开始萌发不定根。2. 根据权利要求1所述的利用秋冬休眠芽为外植体进行玫瑰组培快繁的方法，其特征 在于所述步骤（A)中玫瑰秋冬季休眠芽的消毒方法为：75%酒精60s+3%NaC10 lOmin。3. 根据权利要求1所述的一种利用秋冬季休眠芽为外植体进行玫瑰组培快繁的方 法，其特征在于所述步骤（B)中玫瑰秋冬季休眠芽初代培养基配方为MS+lmg/LBA+0.0 5mg/ LNAA+30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂，pH 值为 5. 8。4. 根据权利要求1所述的利用秋冬休眠芽为外植体进行玫瑰组培快繁的方法，其特征 在于所述步骤（B)中玫瑰秋冬季休眠芽剥去腋芽鳞片(注意避免伤及腋芽)后接种于初代培 养基上。5. 根据权利要求1所述的利用秋冬休眠芽为外植体进行玫瑰组培快繁的方法，其 特征在于所述步骤（C)中玫瑰秋冬季休眠芽增殖培养基配方为MS+2mg/LBA+0. 05mg/ LNAA+0. 6mg/L GA3+30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂，pH 值为 5. 8。6. 根据权利要求1所述的一种利用秋冬季休眠芽为外植体进行玫瑰组培快繁的 方法，其特征在于所述步骤（D)中玫瑰秋冬季休眠芽生根培养基配方为l/2MS+0.2mg/ LIBA+0. 2mg/LNAA+lg 活性炭 +30g/L 蔗糖 +7g/L 琼脂，pH 值为 5. 8。
【专利摘要】本发明公开了一种利用秋冬休眠芽为外植体进行玫瑰组培快繁的方法，属于观赏植物种苗无性繁殖技术领域。本发明旨在建立起以秋冬季休眠芽为外植体的玫瑰组织快繁体系，包括外植体的消毒处理、初代培养、增殖培养、生根培养等四个阶段。本发明优势：污染率低，繁殖系数高，培育周期短，打破秋冬季繁殖限制，很好的解决了玫瑰传统繁殖方法效率低、周期长的问题，可广泛应用于实际生产。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN104938340
【申请号】CN201510430553
【发明人】冯立国, 生利霞, 王佳, 臧姝
【申请人】扬州大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月21日