专利名称：一种固体培养获得针叶树种胚状体的方法及其培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物外植体的培养方法，特别是涉及一种固体培养获得针叶树种胚状体的方法及其培养基。
背景技术：
植物体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)是指二倍体或单倍体的体细胞在特定条件下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程；经体细胞胚胎发生形成类似合子胚的结构称为体细胞胚(somaticembryo)；体细胞胚胎发生是由一类称为胚性细胞(embryogenic cell)的组织发育而来，这是体细胞胚胎发生技术体系能否建立的关键。随着现代生物技术的飞速发展，体细胞胚胎发生已经成为针叶树细胞工程中植株再生的重要途径，可以用来研究无性系细胞起源、调控和发育，利于阐明植物有性胚与无性胚发生机理，还是植物细胞全能性、分化及其形态建成研究的理想实验体系，也是进行基因转导、种质保存、微体快繁、人工种子研制的重要手段。它还是基因工程的桥梁，可大幅度缩短林木育种与繁殖周期，尤其是用于针叶树育种与繁殖工程，理论价值与经济意义重大。
目前，植物体细胞胚胎发生的方式分直接发生、间接发生和混合发生三种直接发生即体细胞胚直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育而成，其来源细胞可以是外植体表皮、亚表皮、合子胚等，约20多种外植体可按直接方式产生体细胞胚；但有相当部分植物，尤其是木本植物的体细胞胚发生是间接方式，即体细胞胚是从愈伤组织，有时也从已形成体细胞胚的一组细胞中发育而成；此外，某些植物既可按直接方式又可按间接方式进行体细胞胚发生，叫混合发生方式，如取自鸭茅叶基的外植体，先形成愈伤组织，再进行体细胞胚发生；若取其叶尖则体细胞胚直接从外植体上产生。对于针叶树种来说，常用的离体培养基有MS、DCR、SH、LP、GD等，存在的问题主要有早期原胚形成的状态不好、胚性愈伤组织质量不高、早期原胚发育不完全与子叶发育不正常、玻璃化问题、下胚轴不伸长、体细胞胚不生根等。
发明内容
本发明的目的是提供一种固体培养获得针叶树种胚状体的方法及其培养基。本发明所提供的针叶树种胚状体固体培养基，包括诱导培养基、增殖培养基和成熟培养基，所述成熟培养基分为成熟培养基1或成熟培养基2；其中，所述诱导培养基含有下述组分，pH为5.4-6.2KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl201-0.035mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，6-苄氨基嘌呤 0.05-3.1mg/L，激动素0.05-2.6mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L；所述增殖培养基含有下述组分，pH为5.4-6.2KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，
CoCl20.01-0.035mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，6-苄氨基嘌呤 0.05-3.1mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L；所述成熟培养基1含有下述组分，pH为5.4-6.2KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，尼克酸 0.05-1.5mg/L，维生素B60.01-0.5mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG400015000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脱落酸 7-150mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L；
所述成熟培养基2含有下述组分，pH为5.6-5.9KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG400015000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脱落酸 7-150mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L；其中，诱导培养基组分优选为KNO32102mg/L，NH4NO3248mg/L，KH2PO477mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 155mg/L，H3BO33.1mg/L，ZnSO4.7H2O 3.9mg/L，MnSO4.H2O 7.6mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.113mg/L，KI 0.38mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，
Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，6-苄氨基嘌呤 0.05-3.1mg/L，激动素 0.05-2.6mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L；增殖培养基组分优选为KNO32803mg/L，NH4NO3331mg/L，KH2PO4103mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 206mg/L，H3BO39.5mg/L，ZnSO4.7H2O 5.2mg/L，MnSO4.H2O 10.2mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.15mg/L，KI0.51mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，6-苄氨基嘌呤 0.05-3.1mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L；成熟培养基1组分优选为KNO32336mg/L，NH4NO3276mg/L，
KH2PO486mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 172mg/L，H3BO33.5mg/L，ZnSO4.7H2O 4.3mg/L，MnSO4.H2O 8.45mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.125mg/L，KI 0.42mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，尼克酸 0.05-1.5mg/L，维生素B60.01-0.5mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG400015000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脱落酸 7-150mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L；成熟培养基2组分优选为KNO32453mg/L，NH4NO3290mg/L，KH2PO490mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 181mg/L，H3BO39.5mg/L，ZnSO4.7H2O 4.52mg/L，MnSO4.H2O 8.87mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.131mg/L，KI 0.44mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，
肌醇50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺400-700mg/L，蔗糖20,000-55,000mg/L，PEG4000 15000-190000mg/L，酸水解酪蛋白350-1050mg/L，脱落酸 7-150mg/L，琼脂2,500-7,000mg/L；应用上述固体培养基，固体培养获得针叶树种胚状体的方法，包括如下步骤1)诱导培养将针叶树种未成熟胚消毒后接种于诱导培养基中，在18-28℃、暗培养条件下进行培养，得到胚性愈伤组织；2)增殖培养将胚性愈伤组织接种于权利要求1所述固体培养基的增殖培养基中，在18-28℃、暗培养条件下进行培养；3)成熟培养将经过增殖培养的胚性愈伤组织接种于权利要求1所述固体培养基的成熟培养基1或成熟培养基2中，在18-28℃、暗培养条件下进行培养，得到所述胚状体。
经过上述暗培养的胚性愈伤组织出现可见小胚后，还在22-28℃、1600～2000lx的光照条件下进行光培养。
本发明通过对培养各阶段培养基组分的优化，提高了胚性愈伤组织质量，早期原胚质量大大改善，胚头与胚柄正常率达到95％以上，原胚的愈伤化和畸形胚减少35％，高质量子叶胚达90％以上，每克胚性愈伤组织上可发生210～360个子叶胚，畸形胚近于零，且可见的子叶胚基本为同步化、标准化，其生根、伸长率达到95％；与现有技术(子叶胚发生频率低，每克胚性愈伤组织上只发生5～25个子叶胚，畸形胚占到70％以上，且体细胞胚生根率0～7％等)相比，体细胞胚发生状况取得了重大突破。
图1为培养获得的胚状体照片。
具体实施例方式
实施例1、一、实验材料与方法1、实验材料华北落叶松、日本落叶松、长白落叶松、日本×华北杂种落叶松、日本×长白杂种落叶松等的未成熟合子胚。
日本落叶松选自辽宁省清源县大孤家林场30年生种子园中的日永8、日永85、日抚27、日草103等无性系；长白落叶松采自辽宁省抚顺市哈达林场30年生长白落叶松种子园中的长3、长14、长11、长4C、长33等无性系；华北落叶松采自山西省管埁林局秋千沟林场华北落叶松母树林中华3、华6、华7等无性系。日本、长白、华北落叶松各组合杂交技术采用开放式控制授粉方法进行。
2、实验方法1)接种、诱导培养用镊子从球果中取出种子，70％酒精浸泡1min，0.1％升汞溶液浸泡6min，无菌水冲洗5次后，接种备用，在超净台中剥取种胚，从侧部划开种壳，取出种仁，划破内种皮，挑开胚乳，将嫩胚同胚柄一起接种于诱导培养基上，每皿接种25个，重复4次，在温度21～27℃下暗培养，20～30天根据颜色、形态、结构等特征，初步确定胚性愈伤组织；2)增殖培养针叶树胚性愈伤组织在诱导培养基中继代培养两次后，转接于增殖培养基中进行增殖、继代培养，每20～35天继代一次，每次转接时均选取新分化的胚性愈伤组织，在23±5℃、暗培养条件下进行培养。
3)成熟培养针叶树胚性愈伤组织在增殖培养基中增殖培养到一定数量后，转接于成熟培养基中进行成熟培养。
将增殖后的接种于成熟培养基1中，在20-26℃、暗培养条件下进行培养。在成熟培养基上约20～65天时间段内，不同胚性细胞系的成熟时间差异较大，有可见的小胚发生后，移到25±3℃、1600～2000lx的光照条件下进行光培养，即可得到体细胞胚。
所用的培养基组分如表1所示。
表1培养基组分 (mg/L)
二、实验结果采用上述培养基、培养条件得到的体细胞胚照片如图1，体细胞胚发生数量如表表2. 落叶松不同胚性细胞系体细胞胚发生数量
结果表明，本方法提高了胚性愈伤组织质量，早期原胚质量大大改善，胚头与胚柄正常率达到95％以上，原胚的愈伤化和畸形胚减少35％，高质量子叶胚达90％以上，每克胚性愈伤组织上可发生210～360个子叶胚，畸形胚近于零，且可见的子叶胚基本为同步化、标准化，其生根、伸长率达到95％；与现有技术(子叶胚发生频率低，每克胚性愈伤组织上只发生5～25个子叶胚，畸形胚占到70％以上，且体细胞胚生根率0～7％等)相比，体细胞胚发生状况取得了重大突破。
实施例2、选择与实施例1相同的方法，所用的培养基如表3，进行针叶树种的体细胞胚培养，可得到与实施例1相同的结果。
表3培养基配方(mg/L)
权利要求
1.一种针叶树种胚状体固体培养基，包括诱导培养基、增殖培养基和成熟培养基，所述成熟培养基分为成熟培养基1或成熟培养基2；其中，所述诱导培养基含有下述组分，pH为5.4-6.2KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，6-苄氨基嘌呤 0.05-3.1mg/L，激动素0.05-2.6mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L；所述增殖培养基含有下述组分，pH为5.4-6.2KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，6-苄氨基嘌呤 0.05-3.1mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L；所述成熟培养基1含有下述组分，pH为5.4-6.2KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O0.11-0.21mg/L，KI 0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，尼克酸 0.05-1.5mg/L，维生素B60.01-0.5mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG400015000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脱落酸7-150mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L；所述成熟培养基2含有下述组分，pH为5.6-5.9KNO31836-2836mg/L，NH4NO3243-360mg/L，KH2PO470-130mg/L，CaCl2.2H2O 300-450mg/L，MgSO4.7H2O 130-250mg/L，H3BO32-11mg/L，ZnSO4.7H2O 3-7mg/L，MnSO4.H2O 6.5-10.5mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.11-0.21mg/L，KI0.28-0.63mg/L，CuSO4.5H2O 0.01-0.035mg/L，CoCl20.01-0.035mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG4000 15000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脱落酸7-150mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L。
2.根据权利要求1所述的固体培养基，其特征在于所述诱导培养基组分为KNO32102mg/L，NH4NO3248mg/L，KH2PO477mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 155mg/L，H3BO33.1mg/L，ZnSO4.7H2O 3.9mg/L，MnSO4.H2O 7.6mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.113mg/L，KI 0.38mg/L，CuSO4.5H2O0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，FeSO4.7H2O13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺400-700mg/L，蔗糖20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白350-1050mg/L，6-苄氨基嘌呤0.05-3.1mg/L，激动素 0.05-2.6mg/L，琼脂2,500-7,000mg/L。
3.根据权利要求1所述的固体培养基，其特征在于所述增殖培养基组分为KNO32803mg/L，NH4NO3331mg/L，KH2PO4103mg/L，CaCl2.2H2O326mg/L，MgSO4.7H2O206mg/L，H3BO39.5mg/L，ZnSO4.7H2O5.2mg/L，MnSO4.H2O 10.2mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.15mg/L，KI 0.51mg/L，CuSO4.5H2O0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，FeSO4.7H2O13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺400-700mg/L，蔗糖20,000-55,000mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸 0.3-2.7mg/L，酸水解酪蛋白350-1050mg/L，6-苄氨基嘌呤0.05-3.1mg/L，琼脂2,500-7,000mg/L。
4.根据权利要求1所述的固体培养基，其特征在于所述成熟培养基1组分为KNO32336mg/L，NH4NO3276mg/L，KH2PO486mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 172mg/L，H3BO33.5mg/L，ZnSO4.7H2O 4.3mg/L，MnSO4.H2O 8.45mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.125mg/L，KI 0.42mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，尼克酸0.05-1.5mg/L，维生素B60.01-0.5mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG4000 15000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脱落酸7-150mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L。
5.根据权利要求1所述的固体培养基，其特征在于所述成熟培养基2组分为KNO32453mg/L，NH4NO3290mg/L，KH2PO490mg/L，CaCl2.2H2O 326mg/L，MgSO4.7H2O 181mg/L，H3BO39.5mg/L，ZnSO4.7H2O 4.52mg/L，MnSO4.H2O 8.87mg/L，Na2MoO4.2H2O 0.131mg/L，KI 0.44mg/L，CuSO4.5H2O 0.0125mg/L，CoCl20.0125mg/L，FeSO4.7H2O 13-21mg/L，Na2.EDTA.H2O 15-27mg/L，肌醇 50-1500mg/L，维生素B10.4-0.6mg/L，谷氨酰胺 400-700mg/L，蔗糖 20,000-55,000mg/L，PEG4000 15000-190000mg/L，酸水解酪蛋白 350-1050mg/L，脱落酸7-150mg/L，琼脂 2,500-7,000mg/L。
6.一种固体培养获得针叶树种胚状体的方法，包括如下步骤1)诱导培养将针叶树种未成熟胚消毒后接种于权利要求1所述固体培养基的诱导培养基中，在18-28℃、暗培养条件下进行培养，得到胚性愈伤组织；2)增殖培养将胚性愈伤组织接种于权利要求1所述固体培养基的增殖培养基中，在18-28℃、暗培养条件下进行培养；3)成熟培养将经过增殖培养的胚性愈伤组织接种于权利要求1所述固体培养基的成熟培养基1或成熟培养基2中，在18-28℃、暗培养条件下进行培养，得到所述胚状体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于成熟培养还在22-28℃、1600～2000lx的光照条件下进行光培养。
全文摘要
本发明公开了一种固体培养获得针叶树种胚状体的方法及其培养基。本发明所提供的针叶树种胚状体固体培养基，包括诱导培养基、增殖培养基和成熟培养基，所述成熟培养基分为成熟培养基1或成熟培养基2。应用上述固体培养基，固体培养获得针叶树种胚状体的方法，包括如下步骤诱导培养、增殖培养和成熟培养，得到所述胚状体。本发明通过对培养各阶段培养基组分的优化，提高了胚性愈伤组织质量，早期原胚质量大大改善，与现有技术相比，体细胞胚培养发生状况取得了重大突破。
文档编号C12N5/04GK1733903SQ20051009028
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月12日 优先权日2005年8月12日
发明者韩素英, 齐力旺, 张守攻, 王建华 申请人:中国林业科学研究院林业研究所