入第二培养基中进行光照培 养，控制温度为25°C，控制光照强度为20001x，每天的光照时间为11小时，培养直至生根。 其中，所述第二培养基包括固态培养基和液态培养基，所述第二培养基放置于无菌培养盒 中，使固态培养基在所述液态培养基的上方。从无菌外植体的下端开始，将带有腋芽的无菌 外植体的1/8浸没于所述液态培养基，将带有腋芽的无菌外植体的3/8置于所述固态培养 基中。
[0066] 所述固态培养基包括white培养基、0?15mg/L的香蕉泥、0?3mg/L的激动素KT、 0. 75mg/L的吲哚丁酸、4g/L的琼脂和0. 4g/L的活性炭，调节所述固态培养基的pH为5. 7。
[0067] 所述液态培养基包括B5培养基、0. 7mg/L竹醋液和0. 3mg/L椰子提取液，调节所述 液态培养基的PH为5. 3。所述椰子提取液的制作方法为将所述椰衣纤维粉碎至150-200目， 向所述椰衣纤维中加入其5倍质量的淘米水，控制温度为70°C，温浸1小时；过滤，得第一 滤液和第一滤渣，向所述第一滤渣中加入其3倍质量的淘米水，控制温度为80°C，温浸1. 5 小时，过滤，得第二滤液，将所述第一滤液和第二滤液合并，并浓缩至I. 52mg/L，即得所述椰 子提取液。
[0068] 步骤四、将生根的大叶钩藤苗移栽至基质中培养，移栽后在所述基质表面铺设一 层聚乙烯缓释膜，所述聚乙烯缓释膜中注入有质量配比为10 : 1 : 10 : 2的硫酸亚铁、有 机螯合肽、硼砂和七水硫酸锌；
[0069] 所述基质从下到上由草灰层、细胞分裂剂层、鱼骨层和膨润土层按厚度比为 4 : 1 : 2 : 5构成。
[0070] 其中，所述培养盒包括：
[0071] 盒体，其为去顶倒置圆锥状；
[0072] 隔板，其为圆形，所述隔板可拆卸的固定于所述盒体内，使所述盒体形成上部空间 和下部空间，所述隔板平行于所述盒体的底部，所述隔板上间隔设置有2~4个使所述无菌 外植体通过的第一通孔；
[0073] 其中，所述盒体的底部设置有排水管，所述排水管上设有第一控制阀，所述盒体的 下部空间的侧壁设置有进水管，所述进水管上设有第二控制阀，所述固态培养基设置于所 述上部空间中，所述液态培养基置于所述下部空间中。
[0074] 实验对比
[0075] 对大叶钩藤的带节嫩茎段采用以下三种方法消毒后，利用本发明的栽培方法栽 培，栽培条件相同，每种消毒方法分别处理1〇〇株大叶钩藤的带节嫩茎段，其存活率见表1， 其中大蒜素消毒采用的是用质量比为1 : 100的大蒜素和乙醇的混合溶液浸泡所述外植体 5min;大蒜素和茶叶水的配合消毒采用的是用质量比为1 : 100的大蒜素和乙醇的混合溶 液浸泡所述外植体5min，之后用消毒后的茶叶水持续冲洗所述带节嫩茎段20s;洗洁精及 升汞消毒采用的是用质量分数为1 %洗洁精水溶液浸泡5min，自来水冲洗15min，无菌水润 洗两次，然后在超净工作台用体积分数为75%的酒精浸泡30s，再用添加了 2滴吐温-20的 150mL质量浓度为0. 1 %升汞消毒5min，无菌水冲洗3次。
[0076] 表1采用本发明对大叶钩藤的带节嫩茎段消毒对其存活率的影响
[0080] 其中，普通培养基的成分为0. 3mg/L的NAA，编号为1，第二培养基的成分与实施例 3中的成分相同，标号为2。分别用普通培养基和第二培养基对100株大叶钩藤外植体进行 组织培养。
[0081] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地 实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
【主权项】
1. 一种大叶钩藤的快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一、制作大叶钩藤的无菌外植体； 步骤二、将所述无菌外植体转入第一培养基中进行光照培养，控制温度为24tC~ 26°C，诱导腋芽形成；所述第一培养基包括B5培养基、1~I. 3mg/L的竹醋液、35g/L的罗汉 果渣和4g/L的琼脂； 步骤三、将步骤二培养的带有腋芽的无菌外植体转入第二培养基中进行光照培养，控 制温度为24°C~26°C，培养直至生根；其中，所述第二培养基包括固态培养基和液态培养 基，所述第二培养基放置于培养盒中，使固态培养基在所述液态培养基的上方； 所述固态培养基包括white培养基、0. 1~0. 2mg/L的香蕉泥、0. 1~0. 5mg/L的激动 素KT、0. 7~0? 8mg/L的吲哚丁酸、4g/L的琼脂和0? 1~0? 5g/L的活性炭； 所述液态培养基包括B5培养基、0. 6~0. 9mg/L竹醋液和0. 2~0. 4mg/L椰子提取液； 所述椰子提取液的制作方法为将所述椰衣纤维粉碎至150-200目，向所述椰衣纤维中加入 其5倍质量的淘米水，控制温度为70°C，温浸1小时；过滤，得第一滤液和第一滤渣，向所述 第一滤渣中加入其3倍质量的淘米水，控制温度为80°C，温浸1. 5小时，过滤，得第二滤液， 将所述第一滤液和第二滤液合并，并浓缩至I. 52mg/L，即得所述椰子提取液。2. 如权利要求1所述的大叶钩藤的快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤三中，从无菌 外植体的下端开始，将带有腋芽的无菌外植体的1/8浸没于所述液态培养基，将带有腋芽 的无菌外植体的3/8置于所述固态培养基中。3. 如权利要求2所述的大叶钩藤的快速繁殖方法，其特征在于，所述培养盒包括： 盒体，其为去顶倒置圆锥状； 隔板，其为圆形，所述隔板可拆卸的固定于所述盒体内，使所述盒体形成上部空间和下 部空间，所述隔板平行于所述盒体的底部，所述隔板上间隔设置有2~4个使所述无菌外植 体通过的第一通孔； 其中，所述盒体的底部设置有排水管，所述排水管上设有第一控制阀，所述盒体的下部 空间的侧壁设置有进水管，所述进水管上设有第二控制阀，所述固态培养基设置于所述上 部空间中，所述液态培养基置于所述下部空间中。4. 如权利要求1所述的大叶钩藤的快速繁殖方法，其特征在于，还包括：步骤四、将生 根的大叶钩藤苗移栽至基质中培养，移栽后在所述基质表面铺设一层聚乙烯缓释膜，所述 聚乙烯缓释膜中注入有质量配比为10 : 1 : 10 : 2的硫酸亚铁、有机螯合肽、硼砂和七水 硫酸锌； 所述基质从下到上由草灰层、细胞分裂剂层、鱼骨层和膨润土层按厚度比为 4 : 1 : 2 : 5构成。5. 如权利要求1所述的大叶钩藤的快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤一中，选取大 叶钩藤靠近顶芽的带节嫩茎段，摘除多余叶片，用细毛刷在流水下轻轻刷洗外植体表面，然 后剪成2-4cm长的带腋芽的嫩茎段作为大叶钩藤的无菌外植体。6. 如权利要求1所述的大叶钩藤的快速繁殖方法，其特征在于，所述步骤一中，对大叶 钩藤的外植体进行消毒，具体消毒的过程为：用质量比为1 : 100的大蒜素和乙醇的混合溶 液浸泡所述外植体5min，再用无菌水润洗所述外植体三遍，之后将所述外植体下方的1/3 处及以下部分浸泡于质量分数为1%的竹醋液中25-30min，之后用消毒后的茶叶水持续冲 洗所述外植体20-30s。7.如权利要求1所述的大叶钩藤的快速繁殖方法，其特征在于，大叶钩藤的无菌外植 体在第一培养基中培养时，调节pH为5. 7,控制光照强度为16001x，每天的光照时间为8小 时；大叶钩藤的无菌外植体在第二培养基中培养时，调节所述固态培养基的PH为5. 7,调节 所述液态培养基的pH为5. 3,控制光照强度为20001x，每天的光照时间为11小时。
【专利摘要】本发明公开了一种大叶钩藤的快速繁殖方法，包括以下步骤：步骤一、制作大叶钩藤的无菌外植体；步骤二、将所述无菌外植体转入第一培养基中进行光照培养；步骤三、将步骤二培养的带有腋芽的无菌外植体转入第二培养基中进行光照培养，培养直至生根；步骤四、将生根的大叶钩藤苗移栽至基质中培养。本发明通过建立大叶钩藤的快速繁殖方法，具有繁殖率高、繁殖速率快等优点，便于在生产上大面积推广种植，满足了中药资源开发的迫切需要。
【IPC分类】A01H4/00
【公开号】CN105028202
【申请号】CN201510454644
【发明人】韦树根, 马小军, 潘丽梅, 付金娥, 白隆华
【申请人】广西壮族自治区药用植物园
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月30日