步，根据一些 实施方案，小规模生物反应器是4L反应器。根据进一步的实施方案，小规模生物反应器是 3-5L反应器。根据进一步的实施方案，小规模生物反应器是3-10L反应器。根据进一步的 实施方案，小规模生物反应器是4-8L反应器。
[0180] 小规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类型 聚合物。根据一些实施方案，小规模生物反应器是一次性的。如果小规模生物反应器不是 一次性的，根据一些实施方案，在两次使用期间通过任何合适方式清洁和灭菌。
[0181] 如上所述，已知当较大数量的果实细胞在生物反应器中生长时，次生代谢物包括 多酚如白藜芦醇的产生与在小规模生产如使用玻璃瓶如Erlenmeyers中相同代谢物相比 显著降低。然而，本文详细描述的大规模方法提供果实细胞，当在生物反应器中生长时其中 的次生代谢物的量不降低。进一步地，某些次生代谢物的产生甚至是扩大的。
[0182]因此，根据本发明的实施方案，在小规模生物反应器中生长的果实细胞的次生代 谢物的相对量与其在第一步中的相对量相比不显著降低。根据一些实施方案，上述用于第 一步中生长培养基中的成分也可用于第二步。根据一些实施方案，小规模生物反应器中使 用的生长培养基与大规模生产方法的第一步中使用的培养基相同。根据一些实施方案，在 第二步生长培养基中发现的不同成分的相对量与第一步相同。根据其它的实施方案，在第 二步生长培养基中发现的不同成分的相对量与在第一步中使用的相对量不同。根据一些实 施方案，在第二步将另外的物质加入生长培养基中。
[0183] 根据一些实施方案，小规模生物反应器包括一个入口，果实细胞（来自第一步）、 空气、培养基及任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案，小规模生 物反应器包括一个出口，由此排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括一个气体 出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工操作的。 根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预定压力， 则气体从生物反应器中释出。根据一些实施方案，预定压力是8PSI。
[0184] 根据一些实施方案，果实细胞和培养基在第二步是持续混合的。根据进一步的实 施方案，果实细胞和培养基在第二步是间歇混合的。根据一些实施方案，第二步的温度是 20-30摄氏度。根据一些实施方案，果实细胞在第二步生长多于一周但少于两周。在本发明 的一些实施方案中果实细胞在接种于下一个生物反应器中之前生长9-16天。
[0185] 对于大规模方法的第三步，将收获的果实细胞置于大规模生物反应器中。根据一 些实施方案，大规模生物反应器是30-50L反应器。根据进一步的实施方案，大规模生物反 应器是40-60L反应器。根据进一步的实施方案，大规模生物反应器是30-70L反应器。根 据进一步的实施方案，大规模生物反应器是20-100L反应器。
[0186] 大规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类型 聚合物。根据一些实施方案，大的生物反应器是一次性的。如果大规模生物反应器不是一 次性的，根据一些实施方案，在两次使用期间通过任何合适方式清洁和灭菌。
[0187]与小规模生物反应器相似，根据本发明的实施方案，在大规模生物反应器中生长 的果实细胞的次生代谢物与其在该方法的任何先前步骤中的相对量相比不显著降低。根据 一些实施方案，上述任何先前步骤中用于生长培养基中的成分也可以用于第三步。根据一 些实施方案，大规模生物反应器中使用的生长培养基与该方法的任何先前步骤中使用的培 养基相同。根据一些实施方案，第三步生长培养基中发现的不同成分的相对量与该方法任 何先前步骤中的量相同。根据其它的实施方案，第三步生长培养基中发现的不同成分的相 对量与该方法任何先前步骤中使用的相对量不同。根据一些实施方案，在第三步将另外的 物质加入生长培养基中。
[0188] 根据一些实施方案，大规模生物反应器包括一个入口，果实细胞（来自第二步）、 培养基、空气和任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案，大规模生 物反应器包括一个出口，以排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括一个气体出 口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工操作的。根 据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预定压力，则 气体从生物反应器中释出。根据一些实施方案，预定的压力为直至8PSI。
[0189] 根据一些举例的实施方案，果实细胞和培养基在第三步持续混合。根据进一步 的实施方案，果实细胞和培养基在第三步间歇混合。根据一些实施方案，第三步的温度是 20-30°C。根据一些实施方案，果实细胞在第三步生长大约2-3周。根据一些实施方案，果 实细胞在第三步生长大约3-5周。根据一些实施方案，果实细胞在第三步生长大约12-30 天。
[0190] 第三步果实细胞生长结束后，通常通过任何适当方式将果实细胞从中等规模生物 反应器接种。对于大规模生产方法的第四步，将收获的果实细胞置于更大规模生物反应器 中。根据一些实施方案，更大规模生物反应器是1000L反应器。根据进一步的实施方案，更 大规模生物反应器是200-500L反应器。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是 500-1000L反应器。根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是1000-1500L反应器。 根据进一步的实施方案，更大规模生物反应器是500-1100L反应器。
[0191] 更大规模生物反应器可以由任何合适材料制成，如玻璃、金属、塑料和/或任何类 型聚合物。根据一些实施方案，大规模生物反应器是一次性的。如果大规模生物反应器不 是一次性的，根据一些实施方案，在两次使用之间通过任何合适方式清洁和灭菌。
[0192]与小规模生物反应器相似，根据本发明的实施方案，在更大规模生物反应器中生 长的果实细胞的次生代谢物的量与其在该方法的先前步骤中的相对量相比不显著降低。根 据一些实施方案，上述在任何先前步骤中用于生长培养基中的成分也可用于该方法的第四 步。根据一些实施方案，在更大规模生物反应器中使用的生长培养基与在任何先前步骤中 使用的培养基相同。根据一些实施方案，在第四步中生长培养基中发现的不同成分的相对 量与先前任何步骤中的量相同。根据其它的实施方案，在第四步中生长培养基中发现的不 同成分的相对量与在任何先前步骤中使用的相对量不同。根据一些实施方案，在该方法的 第四步将其它物质加入生长培养基中。
[0193] 根据一些实施方案，更大规模生物反应器包括一个入口，果实细胞（来自第三或 第二步）、培养基、空气和任何其它物质通过其置于生物反应器中。根据进一步的实施方案， 更大规模生物反应器包括一个出口，以排出任何希望的物质。根据一些实施方案，出口包括 一个气体出口，设计为释放生物反应器中过量的气体。根据一些实施方案，气体出口是人工 操作的。根据其它的实施方案，气体出口是自动操作的，其中一旦生物反应器中气压达到预 定压力，则气体从生物反应器中释出。
[0194] 根据一些实施方案，果实细胞和培养基在第四步持续混合。根据进一步的实施方 案，果实细胞和培养基在第四步间歇混合。根据一些实施方案，第四步的温度是20-30°C。 根据一些实施方案，果实细胞在第三步或第四步生长直至达到细胞生物量为10% -70%。
[0195] 根据一些实施方案，在果实细胞在更大规模生物反应器中生长之后终止该大规模 生产方法。根据这种实施方案，果实细胞在更大规模生物反应器中生长直至达到细胞生物 量为10% -70%。细胞生物量达到10% -70 %后，通过任何合适方式从该大规模生物反应 器中收获果实细胞并进一步加工。根据一些实施方案，将果实细胞通过干燥、冻干、冷冻干 燥和喷雾干燥等进一步加工。根据一些实施方案，果实细胞的加工不包括从中提取活性成 分。
[0196] 根据一些实施方案，大规模方法可包括将细胞从培养瓶中接种于可以是任何大小 的生物反应器并收获细胞的一个步骤。根据其它的实施方案，果实细胞可以接种于一系列 生物反应器中，其中每个生物反应器通常大于前一个使用的生物反应器。根据本发明大规 模方法进行任何数目的额外的步骤。额外的步骤包括可能的中间步骤，其中收获细胞或接 种及置于更大的生物反应器中及生长直至收获或接种并转移至更大的生物反应器。根据进 一步的实施方案，该方法包括使从大规模生物反应器中收获的果实细胞生长的额外步骤。
[0197] 本发明的各个方面在如下实施例中更详细描述，这些代表本发明的实施方案，不 限制本发明的范围。 实施例
[0198] 实施例1:生产-工业化水平规模
[0199] 1 ?材料和方法
[0200]生产方法涵盖在具有五个阶段的逐步方法中增殖葡萄细胞。从在Erlenmeyer摇 瓶中增殖葡萄细胞开始，在小和大规模生物反应器中进一步增殖。关键因素是在不同的生 物反应器规模中的增殖期间维持细胞中次生代谢物白藜芦醇的高水平。在最后的大规模增 殖阶段结束时，在要求的生物量，收获细胞并干燥以产生精细的粉-紫色粉末，产生干燥细 胞（RGC)生物量，用于不同的医学应用。
[0201]形成葡萄细胞系
[0202] 来自葡萄横切片的愈伤组织：从田间生长在开花后20-50天的葡萄植物中收 获4-8cm长的幼葡萄串，在流动的自来水中彻底冲洗。将无种子葡萄Vitis vinifera cv. 〃AVNIR 825〃(Agraman与Gamay red的杂交种）的绿色未成熟衆果在含有1.3%w/ V次氯酸钠和（0.l%v/v)Tween 20(作为增湿剂）的溶液中灭菌10分钟，。使用外科 手术刀将外植体切成2-3mm长度横切片，在补加过滤灭菌的1.7mM抗坏血酸和0.8mM柠 檬酸、l〇〇mg/l DTT(二硫苏糖醇）和50mg/l乙酰半胱氨酸的半强度MS(Murashige and Skoog，1962, Physiol Plant 15:473-497)液态基本培养基中进行。将如下抗氧化剂加入 切割培养基中：PVP(0. 5和lg/l)、L-半胱氨酸（150mg/l)、五倍子酸（1.5mg/l)、DTT(70mg/ 1)、生物喋呤（15mg/l)，抗坏血酸（150mg/l)和柠檬酸（150mg/l)，以抑制细胞坏死 (necrogenesis)及使得可以回收绿色健康衆果片。
[0203] 将衆果片置于100个含有25ml高压灭菌的用0? 25% Gelrite固化Murashige and Skoog，MS培养基的15mm培养平板中。在102kpa高压灭菌15分钟之前将pH调节为pH 5.9。将每个均含有25个浆果片的30个平板用Parafilm密封及在26°C避光温育3天。将 培养物在25°C由冷白光荧光管提供15-30 y molm 2sh辐照度的16小时光照期下温育。MS 盐和维生素培养基也补加250mg/l酪蛋白水解物、2%蔗糖和100mg/l肌醇。对于愈伤组织 诱导，还补加0. 2mg/l激动素和0. lmg/1 NAA(a -萘基乙酸），培养基称作RD1。
[0204] 在培养开始3-4周后，沿着浆果片可见绿色和红色愈伤组织混合物。该愈伤组织 由易碎的延长的细胞组成，其中一些呈现出花青素深色着色。选择富集花青素的愈伤组织 部分并单独传代培养增殖。绿色愈伤组织部分单独培养。
[0205] 来自葡萄皮细胞的愈伤组织：从田间生长的葡萄植物在开花20-50天后收 获4-8cm长的幼葡萄串，在流动的自来水中彻底冲洗。将无种子葡萄Vitisvinifera cv. 〃AVNIR 825〃(Agraman与Gamay red的杂交种）的绿色不成熟衆果在含有1.3%w/v 次氯酸钠和（〇. l%v/v)Tween 20(作为增湿剂）的溶液中灭菌10分钟。通过在衆果皮 做3-8mm切口并使用无菌镊子仅剥皮而分离浆果皮。果皮分离在补加过滤灭菌的1. 7mM 抗坏血酸和〇? 8mM柠檬酸、100mg/l DTT (二硫苏糖醇）和50mg/l乙酰半胱氨酸的半强度 MS(Murashige and Skoog，1962)液态基本培养基中进行。
[0206] 将果皮置于RD-1培养基中。在大约10-14天后，在果皮切割表面上开始发育出细 胞丛。选择富集花青素的细胞并在新鲜培养基中传代培养以进一步增殖。
[0207] 来自葡萄种皮的愈伤组织：从田间生长的葡萄植物在开花20-50天后收获4-8cm 长的幼葡萄串，在流动的自来水中彻底冲洗。将无种子葡萄Vitisvinifera cv."AVNIR 825〃(Agraman与Gamay red的杂交种）的绿色不成熟衆果在含有1. 3% w/v次氯酸钠和 (0. 1% vAOTween 20(作为增湿剂）的溶液中灭菌10分钟。将浆果切开以显露幼绿色发 育中种子。切下未成熟种皮并置于培养基上。在补加过滤灭菌的1.7mM抗坏血酸和0.8mM 朽1檬酸、l〇〇mg/l DTT(二硫苏糖醇）和50mg/l乙酰半胱氨酸的半强度MS(Murashige and Skoog，1962)液态基本培养基中进行分离。
[0208] 将种皮切片置于RD-1培养基中。在大约12-20天后，种皮变成褐色，在种皮外植 体的顶部开始出现愈伤组织。选择富于红-褐色着色的细胞并在新鲜培养基中进一步传代 培养以进一步增殖。
[0209] 液态培养物的建立：液态培养物通过在50ml不同培养基（RD1-RD6,见下文）中加 l〇g愈伤组织而建立。在固体培养基上成功建立的所有细胞系在缺少胶凝剂的相同培养基 组合中呈现均匀细胞悬浮液。加入70mg/l DTT或者150mg/l抗坏血酸或柠檬酸改善浆果 来源的悬浮培养物的生长及抑制细胞necrogenesis。所有外植体类型均成功用于建立液态 培养物。每7-10天将培养物在新鲜生长培养基中常规传代培养。
[0210] 导入以建立浆果来源的愈伤组织细胞系的其它葡萄种属：使用上述方案培养如下 葡萄属物种：
[0211] 森林葡萄、V. muscadinia、圆叶葡萄、河岸葡萄、夏特沃氏葡萄、V. lubrisca、 V. daviddi、山葡萄、V. romanelli、夏葡萄、辛西安那葡萄、V. cineria、V. palmate、 V. munsoniana、霜葡萄、Hybrid A23-7-71、V. acerifolia、V. treleasei 和桦叶葡萄。
[0212] 欧洲葡萄横切片、葡萄皮和葡萄种子的愈伤组织产生的效力在下表A中例证。
[0213]表 A
[0214]
[0215] 在这项研究中使用的一些葡萄属物种的不同愈伤组织"类型"产生的效力在下表 B中概括显示。
[0216]表 B
[0217]
[0218] (B-浆果片，SC-种皮，S-果皮）
[0219]阶段 1:Erlenmeyer，摇瓶
[0220] 将红葡萄细胞在持续荧光（lOOOlx)在25±5°C温度下在定轨摇床上的1L Erlenmeyer瓶中悬浮生长。生长培养基含有Gamborg B5培养基和维生素，及补加250mg/ 1酪蛋白水解物、2-4%蔗糖、100mg/l肌醇、0? 2mg/l激动素和0? lmg/1 NAA(1-萘乙酸）、 25-45mM KN03、l-15mM MgS04或者 5-35mM MgN03及 ImM NaH2P04(pH 5.8)。每 6-11 天将细 胞传代培养。
[0221 ] 阶段2:小规模生物反应器
[0222] 通过将在阶段1的Erlenmeyer中生长7-16天的细胞悬浮液在25±5°C接种于 4-8L-次性生物反应器中。将细胞在持续荧光（lOOOlx)下在生长培养基中悬浮生长，所述 生长培养基含有补充的Gamborg B5盐和维生素培养基，补加250mg/l酪蛋白水解物、2-4 % 蔗糖、100mg/l 肌醇、25-45mM KN03、l-15mM MgS04S 5-35mM MgN03及 ImM NaH2P04、0. 2mg/l 激动素和〇. lmg/1 NAA(1-萘乙酸）（pH 5. 4-5. 8)。每9-16天将细胞传代培养。
[0223] 阶段3:大规模生物反应器
[0224] 将在小规模生物反应器中生长的细胞悬浮液接种于30-50L -次性生物反应器 中。将细胞在持续荧光（lOOOlx)下在25±5°C悬浮生长。生长培养基含有补充的Gamborg 85盐和维生素培养基，补加25〇1^/1酪蛋白水解物、2-4%蔗糖、10〇11^/1肌醇、25-451111 KN0 3、l-15mM MgS04S 5-35mM MgN03及 ImM NaH2P04、0. 2mg/l 激动素和 0? lmg/1 NAA(1-萘 乙酸）（pH5. 4-5. 8)。每12-30天将细胞传代培养。
[0225] 阶段4:更大规模生物反应器
[0226] 将在小或大规模生物反应器中生长的细胞悬浮液接种于300-1000L -次性生物 反应器中。将细胞在持续荧光（lOOOlx)下在25±5°C悬浮生长。生长培养基含有补充的 6&11113〇找135盐和维生素培养基，补加25〇11^/1酪蛋白水解物、2-4%鹿糖、10〇11^/1肌醇、 25-45mM KN03、l-15mM MgS04或 5-35mM MgN03及 ImM NaH2P04、0.2mg/l 激动素和 0.1mg/l NAA(1-萘乙酸）（pH 5. 4-5. 8)。
[0227] 阶段5:收获
[0228] 细胞达到10% -70% (w/v)细胞生物量后，收获细胞。将收获的细胞干燥以产生 精细的粉色-紫色粉末，具有典型成分、味道和气味。
[0229] 实施例2 :培养基成分和生物反应器设计对在大规模生物反应器中生长的红葡萄 细胞中白藜芦醇水平的影响
[0230] 2. 1培养基成分
[0231] 实验1:培养基成分对在Erlenmeyer摇瓶中生长的红葡萄细胞中白藜芦醇量的影 响
[0232] 将红葡萄细胞如实施例1阶段1所述在Erlenmeyer摇瓶中不同培养基成分中生 长：MS、WP、WP+酪蛋白、Gamborg B5。结果示于表1，表明在Gamborg B5培养基中生长的细 胞与在MS、WP、WP+酪蛋白培养基中生长的细胞相比产生高大约4-15倍的白藜芦醇水平。
[0233] 表 1
[0234]
[0235] *数据是至少两个实验的平均数。
[0236] 林MS-Murashige and Skoog 培养基（Toshio Murashige and Folke K. Skoog in 1968)
[0237] ***WP - Woody 植物培养基（WP) (Lloyd and McCown, 1981)
[0238] 实验2 :培养基成分对生长及在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中 的白藜芦醇水平的影响
[0239] 将红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器中如实施例1阶段3所述在不同培养基 成分中生长。
[0240] 将红葡萄细胞在两种类型培养基中生长：Gamborg B5培养基和补充的Gamborg B5。如下表2所示，补加的具有高水平镁、磷酸盐和硝酸盐或硫酸盐（KN03、MgS0 4、MgN03、 NaH2P04)的Gamborg B5培养基与在非补充的Gamborg B5培养基中生长相比获得较高的红 葡萄细胞生物量。
[0241] 表2 :在Gamborg B5和补充的Gamborg B5培养基中在大规模生物反应器中红葡 萄细胞的生长
[0242]
[0243] *数据是三个实验的平均数。
[0244] 此外，检验培养基成分对于在大规模一次性生物反应器中生长的红葡萄细胞中白 藜芦醇和总多酚水平的影响。将细胞在WP培养基及在含有不同浓度镁、硝酸盐和磷酸盐 (相应的是KN03、MgS04、MgN03、謂03和NaH2P04)的GamborgB5培养基中生长。表3表明这 些盐为生产高水平多酚和白藜芦醇所需要，特别是当加入补充的GamborgB5培养基中时。 在WP培养基中不同，其总多酚和白藜芦醇水平非常低。
[0245] 图4显示红葡萄细胞在大规模一次性生物反应器在补充的Gamborg B5培养基中 生长的生长曲线。细胞经历指数生长，在第20