2000获得。
[0370] 溶解性测定
[0371] 将RGC、合成的白藜芦醇（S-RES ;Sigma-Aldrich)及从植物虎杖（Polygonum capsidatum)中提取的白藜芦醇（植物-RES)溶解于80%甲醇中以实现100%溶解。然后， 将所有RES来源在pH 2和pH 7均溶解于水中，在水中的溶解百分比与在甲醇中的溶解百 分比对比。所有样品中的RES均在306nm基于其特征性吸光图谱监测，其浓度通过白藜芦 醇分析标准的标定曲线确定。
[0372] 结果
[0373] LC/MS
[0374] RGC粉末的负离子模式的质谱和代表性LC/MS层析图在图6A和6B中显示。针 对RGC中白藜芦醇（m/z-227. 0701-227. 0737的四种衍生物检测的LC-MS分析，均显示在 306nm的UV吸光度。这些衍生物中三种是反式-RES异构体的己糖苷，在4. 6、5. 3和6. 1分 钟的保留时间检测到。第四种衍生物是反式-RES，在6. 9分钟的保留时间检测到（表12)。 证实四种衍生物的相同性，如通过ESI质谱显示（图7)。
[0375] 表12:RGC中白藜芦醇衍生物的鉴定
[0376]
[0377] 溶解性
[0378] 将RGC-RES的溶解性与两种反式-RES产物对比：合成的RES和植物虎杖RES。所 有三种所检测的产物均完全溶解于80%甲醇溶液中。然而，当这三种RES产物溶解于模拟 胃pH条件的酸化水（pH = 2)以及在pH 7. 0时，RGC-RES的溶解比两种其它RES的溶解高 6倍，RGC-RES为44%，两种其它RES为7% (图8)。
[0379] 人生物利用度研究
[0380] 该研究是单一剂量随机的交叉对比性药动学研究。15个成人健康禁食男性对象接 受研究产物RGC (口服剂量等价于50mg或150mg反式-RES)，间隔至少7天冲洗（washout) 期）。在给药后4小时提供标准饮食。遵循以色列卫生部（M0H)的所有规章制度及根据 ICHGCP指导进行研究。该方案由Soroka University Medical Center IRB许可，包括给每 个患者施用一次50或150mg剂量，随后7天冲洗，第二次施用，这次与第一次不同，由此开 始接受50mg的患者将接受150mg，反之亦然。在这项研究中征募15个健康非吸烟男性志愿 者。志愿者资格标准包括年龄在18-55岁，BMI彡19及彡30。要求对象在第一次给药之前 7天及在整个研究期间禁食含有RES的食物、营养补充剂或饮料，及禁食所有药物包括非处 方药。
[0381] 样品收集和处理
[0382] 将在施用前（t0)和施用后 0?33、0. 67、1、1. 5、2、2. 5、3、4、5、6、8、10和12小时的 静脉血样品收集在含有K2EDTA的试管中。将血液样品保持在冰浴中，并在黄光下立即处理。
[0383] 血浆中白藜芦醇含量分析
[0384] 由PRACS Institute (Toronto, Canada)进行样品制备及血衆样品中游离和总RES 的LC-MS分析。血浆样品经液体-液体提取并用于LC-MS/MS系统进行分析。对于游离和 总RES的较低限度定量（LL0Q)分别为0. 5和20ng/mL。对于总RES分析，在LC-MS/MS分析 之前进行酶促水解和蛋白质沉淀提取。
[0385] 药代动力学分析
[0386] 使用未分区药代动力学方法针对游离RES和总RES(游离和缀合的）计算下列药 代动力学变量：最大血浆浓度（Cmax)和最大血浆浓度时间（Tmax)，在整个收集期间的平均 浓度，通过梯形法的从时间（0)至最后可计量浓度（Clast，高于L0Q)的血浆浓度对时间曲 线下面积（AUC)。
[0387] LDL氧化试验
[0388] LDL制备：通过不连续的密度梯度超速离心法从健康正常血脂的志愿者分离LDL。
[0389] 铜离子诱导的LDL氧化：LDL(100mg蛋白质/mL)与各实验中浓度升高的葡萄粉末 的乙醇提取物在室温温育10分钟。添加CuS04并将试管在37°C温育2小时。在温育结束 后，通过测量所产生的硫代巴比妥酸反应性物质（TBARS)和脂质过氧化物的量确定LDL氧 化的程度。
[0390] 脂质过氧化试验：通过在532nm的硫代巴比妥酸反应性物质（TBARS)试验直接在 培养基中测量LDL氧化的程度，使用丙二醛（MDA)做标准曲线。还通过脂质过氧化物测试 确定脂蛋白氧化，所述测试通过脂质过氧化物将碘化物转变成碘的能力（如在365nm用分 光光度计所测量的）分析脂质过氧化物形成。
[0391] 结果
[0392] 人口统计学和安全性：15个健康男性志愿者参与这项研究。对象年龄范围是 28-55岁（平均42. 1岁），BMI范围是21. 4-30 (平均25. 8)。所有对象在筛选和准入时均 检测对药物和乙醇是阴性的，关于实验室参数和生命体征测量无临床显著异常。在整个研 究中无不利事件观测到或报道。
[0393] 游离和总白藜芦醇的血浆药代动力学：总RES和游离RES的平均反式-RGC-RES血 浆浓度与时间曲线在图9中显示。正如所见，在两个浓度的RGC图展示两个清晰的浓度峰， 第一个峰在1小时后，第二个峰（更高）在5小时后。
[0394] t-RES的平均药代动力学参数在表12A和12B中概括。
[0395] 表13A和13B:在补加RGC之后血浆药代动力学数值
[0396]A?总白藜芦醇
[0397]
[0400] 在前两个测量时间点0. 33和0. 67小时分析表明在接受RGC的对象血浆中RES的 可测量数量（表14)。此外，在0. 33小时时间点期间，RGC组中所有对象（除了RGC150mg 组中的一个）均具有可测量的总RES浓度（表14和15)。
[0401] 表14 :在前两个测量时间点血浆中具有可检测量RES(总/游离）的对象
[0402]
[0403] 表15 :在施用后前三个测量时间点的总RES和游离RES的浓度（ng/mL)
[0404]
[0405] 结论
[0406] 源自RGC中的RES特征在于添加一个己糖部分。尽管己糖的提取类型及其精确 定位还未鉴定，但是很可能的是，RGC RES是云杉新甙-天然存在于红葡萄中的最常见类型 的RES。在游离和总体形式的RES中证实的两个峰的现象是独特的及在其它类型RES中未 观测到。可能RGC RES中糖苷基团的存在使其更可溶，这可以在溶解性检测中观测到，其中 RGC-RES与合成的和植物衍生的RES相比更溶于水。这种独特的两个浓度峰的模式也可归 因于RGC的独特成分及之间的协同，所述RGC含有完全的红葡萄基质和高水平的糖苷白藜 芦醇。发现这种性状在高浓度RES存在的情况下以高速率表现，快达施用后20分钟。
[0407] 如在浓度/时间曲线（图9A)中清晰可见的，RGC-RES在1和5小时出现两个非 常明显的浓度峰。
[0408] 重要地，合成的或酵母发酵来源的RES(Poulsen，et al.，2013)以及植物来源的 RES(Amiot，et al.，2013)的浓度时间曲线显示明显的单一浓度峰。这显示一天补充一次 RGC对于延长作用是足够的，而在其它产物中，可需要多于一次的补充或者每天更高水平以 达到相同作用。
[0409] 实施例7 :临床研究-RGC粉末对患有高血压前期或轻微高血压的人中的血压、血 管功能和血浆氧化参数的作用
[0410] 进行随机、双盲、安慰剂对照的研究。登记合格的对象并将其分为三个治疗方案， 接受200mgRGC粉末或400mgRGC粉末或安慰剂。所治疗的对象不同时摄取其他相关的药 物。临床试用的产品或安慰剂每天摄取一次，共12周。在所施用的剂量中的白藜芦醇和总 多酚的量在下表16中显示。
[0411] 表16 :RGC中的白藜芦醇和总多酚水平
[0412]
[0413] 结果
[0414] 55个对象中的46个（92% )完成了研究。在所有处理组中基线标准是相当的。 200mg组与其它两个处理组相比具有更高的BMI。研究人群的平均年龄是57. 5 ±7. 2岁（范 围：41. 7 - 70. 0 岁）。
[0415] 安全性
[0416] 用RGC治疗是安全且耐受良好的。一起严重的不良事件是烧心转变为胸部疼痛， 在第二天同时解决了，并且被认为是中度的SAE，不太可能与研究的产品有关。所有其它的 不良事件是轻微或中度的，并且不被认为与研究的产品有关。在研究过程中没有出现临床 显著的至关重要的标志或实验室值的变化。
[0417] 效力
[0418] 表17:比较RGC对所有补充12周的测量结果的作用
[0419]
[0420] *括号中的数字代表"N"，是所测试的对象的数量。
[0421]血压（BP)
[0422] 在RGC200mg组中，舒张BP降低-4. 18±8. 96mmHg。不同组间的比较显示，这一 变化与安慰剂组具有统计学显著地差异（表17,p= 0. 0320)。
[0423] 在RGC200mg组中，观察到在基线和治疗结束时收缩BP的细小变化（表17)。
[0424] 血浆氧化参数
[0425] 如表17所示，用RGC400mg治疗使脂质过氧化物值在基线和治疗结束之间显著降 低了 31. 4±56. 0。在200mg治疗组中还观察到30. 0±48. 2的脂质过氧化物值降低。
[0426] 当将来自两个RGC治疗组的脂质过氧化物值结合而得到更大的样品量时，平均脂 质过氧化物值降低31. 0±52. 3nmole/ml(图10,p=0. 013)。
[0427] 通过流量介导的扩张（FMD)测量的血管功能
[0428] 通过FMD在来自200mg组的六个对象、来自400mg组的八个对象和解释安慰剂 的九个对象中测量血管功能。在RGC 400mg组中在基线与治疗结束之间观察到FMD的 2. 14±1. 82mm Hg的统计学显著性增加（表17,p = 0. 013)。通过给上臂上的血压袖套充气 到200mm Hg 5分钟然后在松释所述袖套后60、90和120秒超声测量动脉扩张来进行FMD。
[0429] 与来自200mg治疗组的六个对象中的两个（33.3% )和接受安慰剂的九个对 象中的两个（22. 2% )相比，来自400mg治疗组的所有八个对象经历阳性的相对变化 (FMD>70% )(图11)。400mg治疗组中所观察到的改进率与200mg组和安慰剂组所观察到 的具有统计学显著性差异（对于400mg vs200mg，p = 0. 015,而对于400mg vs安慰剂，p = 0. 0023) 〇
[0430] 本文显示的结果表明，每天摄取RGC粉末改进FMD并且可以改进轻微高血压对象 中的氧化胁迫。RGC还可以未受医学治疗的具有中度高血压的对象中的降低舒张和收缩血 压。
[0431] 实施例8:随机、双盲、安慰剂对照的红葡萄细胞（RGC)粉末摄取对健康的适度训 练的自行车运动员的量度的作用的研究
[0432] 实验步骤
[0433] 根据实施例1制备RGC细胞培养物粉末。
[0434] 在三组健康的适度训练的自行车运动员进行临床研究。15个对象接受剂量为 200mg每天的RGC，并且14个对象接受剂量为lOOOmg每天的RGC，共六周。15个对象（对 照组）接受安慰剂六周。
[0435] 在摄取RGC前的基线访视，所述对象经历人体测量学检测，包括体重和身高和体 脂百分比测量。然后所述对象经历使用固定的自行车测力器的心肺运动测试。所测量的参 数包括静息和运动高峰期的心率和血液，以及一系列有氧健身参数。在摄取RGC或安慰剂 六周后，重复精确的测量。
[0436] 如表18中可见的，补充后仅在两个RGC组中发现静息舒张血压的显著的5% -6% 的降低。相似地，平均静息收缩压也更低。测量舒张和收缩血压降低的对象的数量表明，与 安慰剂相比，两个RGC组中这样的对象的数量将近两倍。
[0437] 在运动高峰期（表19)，仅在低剂量组中在研究结束时舒张血压更低，具有边界 (borderline)统计学显著性。与安慰剂组相比，在两个RGC组中，在研究结束时运动高峰期 舒张血压降低的参与者的数量都要高超过三倍。对于高峰期的最大收缩血压测量观察到相 似的趋势。
[0438] 表18显示在基线和在研究结束时的平均静息心率和血压以及其组间差异的数 据。各参数改进的参与者的比例也在括号中显示。
[0439]
[0441] 表19显示在基线和在研究结束时的最大有氧能力的度量以及其组间差异的数 据。各参数改进的参与者的比例也在括号中显示。
[0442]
[0443] 虽然本发明的某些特征在本文已经例证和描述，但是本领域技术人员对本发明可 以进行一些修改、取代、改变和等价处理。因此，应理解所附权利要求涵盖在本发明原理内 的所有这些修改和变化。
【主权项】
1. 用于治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或代谢疾病的方法，所述方法包括施用包含 体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物。2. 权利要求1的方法，其中所述果实细胞是葡萄浆果细胞。3. 用于治疗患有代谢综合征的对象中的选自如下的一或多种病症的方法： 冠心病（动脉粥样硬化）、血压、缺血性疾病、心脏衰竭、动脉粥样硬化、慢性肾病（CKD) 和肾脏疾病、系统性硬化、慢性心脏衰竭、高血压、糖尿病、高脂血症、糖耐量异常、肝性脂肪 变性、高血糖症、糖尿病前状态、新发糖尿病、胰岛素抗性、糖尿病、空腹血糖异常、高甘油三 酯血症、抗炎症（脂联素）、高胆固醇血症、低HDL水平、脂肪肝和肥胖症， 所述方法包括给所述对象施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的 组合物的步骤。4. 用于治疗或预防对象中的选自如下的一或多种病症的方法： 冠心病（动脉粥样硬化）、血压、缺血性疾病、心脏衰竭、动脉粥样硬化、慢性肾病（CKD) 和肾脏疾病、系统性硬化、慢性心脏衰竭、高血压、糖尿病、高脂血症、糖耐量异常、肝性脂肪 变性、高血糖症、糖尿病前状态、新发糖尿病、胰岛素抗性、糖尿病、空腹血糖异常、高甘油三 酯血症、抗炎症（脂联素）、高胆固醇血症、低HDL水平、脂肪肝和肥胖症， 所述方法包括给所述对象施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的 组合物的步骤。5. 权利要求3和4任一项的方法，其中所述一或多种病症是高血压、高甘油三酯血症和 糖尿病。6. 权利要求1的方法，其中所述葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物源自葡萄浆果 横切片、葡萄浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、葡萄有种子或无种子栽培种的胚或葡萄种皮 中的一或多种。7. 权利要求1的方法，其中所述组合物是营养组合物。8. 权利要求1的方法，其中所述营养组合物的形式选自漱口水、粉末、条、泡沫、口香 糖、口腔喷雾剂、锭剂、胶囊、牙膏、食品成分添加剂（饮食补剂）、食品成分和食品以及饮 料。9. 权利要求1的方法，其中所述营养组合物或干燥的体外生长的果实细胞的细胞系愈 伤组织培养物是无味的。10. 权利要求1-9任一项的方法，其中所述果实细胞的细胞系愈伤组织培养物是根据 大规模方法制备的，所述大规模方法包括： 使果实细胞在瓶中生长； 将果实细胞从所述瓶接种到第一生物反应器中； 将果实细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中所述另一生物反 应器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，且其中所述第一生物反应器和另一个生 物反应器的至少一个是一次性的；及 从最后的生物反应器收获果实细胞； 其中使从最后的生物反应器收获的果实细胞干燥。11. 权利要求10的大规模方法，其中用于该方法中的每个生物反应器的大小大于果实 细胞先前在其中生长的生物反应器。12. 权利要求10的大规模方法，其中如果所述另一个生物反应器是中间生物反应器， 则进行另外的将果实细胞接种于另一个中间生物反应器或者最后的生物反应器的步骤。13. 权利要求10的大规模方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是4-10 升的生物反应器。14. 权利要求10的大规模方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是 10-50升的生物反应器。15. 权利要求10的大规模方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是 50-200升的生物反应器。16. 权利要求10的大规模方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是 200-500升的生物反应器。17. 权利要求10的大规模方法，其中所述第一生物反应器或另一个生物反应器是 200-1000升的生物反应器。18. 权利要求10的大规模方法，其中果实细胞生长于Gamborg B5培养基中。19. 权利要求18的大规模方法，其中所述Gamborg B5培养基补充有镁盐、磷酸盐或硝 酸盐或者其组合。20. 权利要求18的大规模方法，其中所述Gamborg B5培养基补充有KNO 3、MgS04、MgN03 或NaH2PO4或者其组合。21. 权利要求10的大规模方法，其中所述一次性生物反应器是由一或多层聚乙烯制 成。22. 权利要求21的大规模方法，其中所述一次性生物反应器是由聚乙烯内层和外层及 中间的尼龙层制成。23. 权利要求18的大规模方法，其中所述Gamborg B5培养基不包含植物激素。24. 用于治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或代谢疾病的方法，所述方法包括施用包 含果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物，所述果实细胞是根据包括如下步骤的方法 制备的： 使果实细胞在瓶中生长； 将果实细胞从所述瓶接种到第一生物反应器中； 将果实细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中所述另一生物反 应器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，且其中所述第一生物反应器和另一个生 物反应器的至少一个是一次性的；及 从最后的生物反应器收获果实细胞； 其中使从最后的生物反应器收获的果实细胞干燥。25. 用于治疗、减轻、缓解或预防炎症的方法，所述方法包括施用包含果实细胞的细胞 系愈伤组织培养物的组合物，所述果实细胞是根据包括如下步骤的方法制备的： 使果实细胞在瓶中生长； 将果实细胞从所述瓶接种到第一生物反应器中； 将果实细胞从所述第一生物反应器接种到另一个生物反应器中，其中所述另一生物反 应器是最后的生物反应器或者是中间生物反应器，且其中所述第一生物反应器和另一个生 物反应器的至少一个是一次性的；及 从最后的生物反应器收获果实细胞； 其中使从最后的生物反应器收获的果实细胞干燥。26. 权利要求1的方法，其中所述组合物每天施用一次。27. 粉末形式的组合物，其包含大规模方法中体外生长的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤 组织培养物，其中所述葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物源自葡萄浆果横切片、葡萄 浆果皮、葡萄浆果肉、葡萄种子、葡萄有种子或无种子栽培种的胚或葡萄种皮中的一或多 种；其中所述葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含白藜芦醇的量为至少l〇〇〇mg/kg 粉末。28. 权利要求27的组合物，其特征在于在施用一次所述组合物后血浆中白藜芦醇的浓 度的两个峰。29. 降低对象中的血压的方法，其包括给所述对象施用包含体外生长的果实细胞的细 胞系愈伤组织培养物的组合物的步骤。
【专利摘要】本发明的实施方案描述用于治疗、减轻、缓解或预防代谢综合征或代谢疾病的方法，所述方法包括施用包含体外生长的果实细胞的细胞系愈伤组织培养物的组合物。另外的实施方案进一步描述根据大规模方法制备的果实细胞。根据本发明的方法生产的葡萄浆果细胞的细胞系愈伤组织培养物包含白藜芦醇的量为至少1000mg/kg粉末。
【IPC分类】A61K8/97, A01N63/00, A01H9/00, C12Q1/02
【公开号】CN105072913
【申请号】CN201380073592
【发明人】Y·哈加伊, M·阿巴尔格尔, M·阿扎希, Y·罗斯, R·亚图夫
【申请人】生物收获有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2013年12月24日
【公告号】EP2938197A2, WO2014102776A2, WO2014102776A3