一种培养后的nk细胞的冻存液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及细胞冻存液技术领域，具体设及一种培养后的NK细胞的冻存液及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 细胞冻存是长期保存维持细胞活性的一种有效方法，其冻存经过低溫冷冻保存和 超低溫冷冻保存两个阶段，低溫冷冻保存可W降低细胞的代谢，而超低溫（-198°C的液氮 中）冷冻保存可W保存活细胞物质代谢和几乎完全停止细胞生长，在超低溫冻存是，调节 和控制细胞生长代谢的各种酶的活性受到抑制，使细胞内的生化反应十分缓慢，甚至停止， 从而保持了细胞的活性。
[0003] 但是如果单纯的冻存，在冻存过程中细胞会受到两个方面的损伤：第一，在冻存的 过程中，胞外的水分首先结冰，使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，造成细胞死亡，属于 渗透性损伤；第二，由于低溫导致细胞胞内部形成冰晶会破坏细胞内的结构，属于机械损 伤。因此结合W上两点原因，必须解决冷冻的速度，及冻存剂的配方，复苏时融冻的速度也 直接影响细胞的活性。
[0004] 细胞冻存液是指用于保护细胞免受冷冻损失的物质，一般可分为渗透性和非渗透 性两类。渗透性冻存液主要是小分子物质，易溶于水，与水分子结合能力强，容易通过细胞 膜进入细胞内，降低细胞的冰点，提高细胞膜对水的通透性，减少冰晶形成，从而减小冰晶 的损伤。 阳0化]近几年NK细胞对治疗癌症等疾病的研究及应用较为广泛，NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。NK细胞胞浆丰富，含有较大的嗜天青颗粒， 颗粒的含量与NK细胞的杀伤活性呈正相关。其占循环中淋己细胞族群的5-10%，可W分泌 穿孔素及肿瘤坏死因子，摧毁目标细胞，有重要的治疗意义，因此，NK细胞通过冻存保存其 活性和功能也尤为重要。为了避免长时间的培养而增加的成本、培养时间超过最佳对数生 长期后细胞的生长状态及活性的下降而影响细胞的治疗质量和患者多次采血而增加的伤 痛等问题，保存培养后的NK细胞也成了必要的方法之一，也因此保存的冻存液也直接影响 到了细胞冻存的质量，最主要的是细胞冻存后复苏的活率，运样还可W将健康状态下的NK 细胞保存起来，W防将来不时之需。
[0006] 现有技术主要是采取胎牛血清（FB巧、二甲基亚讽值MS0)和RPMI-1640培养基按 不同比例配制冻存液来进行NK细胞培养后的保存，或是采用自体血清代替胎牛血清进行 冻存。虽然前一种方法保存细胞的时间长，但是采用胎牛血清配制的冻存液，就引入了外源 蛋白，增加了病原污染的风险。采用自体血清代替胎牛血清能够完全杜绝外源污染物感染 的风险，但是冻存后复苏培养的NK细胞活性低。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种临床安全性高，同时又能很好的保 持冻存细胞活性的细胞冻存液，用于冻存培养后的NK细胞。
[0008] 本发明还提供一种培养后的NK细胞的冻存液的制备方法。
[0009] 本发明通过W下技术方案实现该目的：
[0010] 一种培养后的NK细胞的冻存液，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液 A和自体血清的体积比为1 :0. 5~2,其中： 阳0川溶液A由自体血清混合液与DMS0配制而成，自体血清混合液与DMS0的体积比为 3 ~6 :1 ;
[0012] 自体血清混合液包括茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C和自体血清，该细胞的冻存 液中茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C的终浓度分别为0. 5~5mg/ml、0. 125~0. 5mg/ml、 0. 5 ~5m邑/ml。
[0013] 作为优选的，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积 比为1 :0. 5~1，其中：
[0014] 溶液A由自体血清混合液与DMS0配制而成，自体血清混合液与DMS0的体积比为 3 ~5 :1 ;
[0015] 自体血清混合液包括茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C和自体血清，该细胞的 冻存液中茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C的终浓度分别为0. 5~2. 75mg/ml、0. 125~ 0. 3125mg/ml、0. 5 ~2. 75mg/ml。
[0016] 作为另一优选的，所述冻存液由溶液A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的 体积比为1:1~2,其中：
[0017] 溶液A由自体血清混合液与DMS0配制而成，自体血清混合液与DMS0的体积比为 5 ~6 ： 1 ;
[0018] 自体血清混合液包括茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C和自体血清，该自体血清混 合液中茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C的终浓度分别为2. 75~5mg/ml、0. 3125~0. 5mg/ ml、2.75 ~5mg/ml。
[0019] 一种培养后的NK细胞的冻存液的制备方法，包括W下步骤：
[0020] 1)自体血清混合液的配制：分别称取适量茶多酪、葡萄巧提取物和维生素C加入 自体血清中，制得自体血清混合液；
[002U。溶液A的配制：向步骤1)中制得的自体血清混合液中缓慢加入DMS0,自体血清 混合液与DMS0的体积比为3~6 :1，制得溶液A，置于2~8°C度冰箱预冷，备用； 阳022] 3)将预冷后的溶液A取出，缓慢加入到自体血清中，溶液A和自体血清的体积比 为1 :0. 5~2,制得冻存液，其中，茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C的终浓度分别为0. 5~ 5mg/ml、0. 125 ~0. 5mg/ml、0. 5 ~5mg/ml。
[002引相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明的培养后的NK细胞的冻存液包含 茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C和自体血清，由于其采用自体血清，不存在外源动物病毒 的污染及外源蛋白质的引入，安全性高；其中加入的茶多酪、葡萄巧提取物（原花青素）、维 生素C不仅能有效的抑制细胞氧化，保持细胞的活性，对人体无任何伤害，而且冻存复苏后 细胞的状态基本接近冻存前的状态，冻存效果好。
【附图说明】
[0024] 图1为冻存前的NK细胞形态图。
[002引图2为冻存后的实验组1的NK细胞形态图。
[0026] 图3为冻存后的实验组2的NK细胞形态图。
[0027] 图4为冻存后的实验组3的NK细胞形态图。
[0028] 图5为冻存后的对照组的NK细胞形态图。
[0029] 图6为冻存前后的NK细胞杀伤活性曲线图。
【具体实施方式】
[0030] W下结合附图及具体实施例对本发明进行详细描述。 阳0川 实施例1、
[0032] 本实施例提供一种培养后的NK细胞的冻存液的制备方法，包括W下步骤：
[0033] 1)自体血清混合液的配制：分别称取适量茶多酪、葡萄巧提取物和维生素C加入 自体血清中，制得自体血清混合液；
[0034]。溶液A的配制：向步骤1)中制得的自体血清混合液中缓慢加入DMS0,自体血清 混合液与DMS0的体积比为3~6 :1，制得溶液A，置于2~8°C度冰箱预冷，备用；
[0035] 3)将预冷后的溶液A取出，缓慢加入到自体血清中，溶液A和自体血清的体积比 为1 :0. 5~2,制得冻存液，其中，茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C的终浓度分别为0. 5~ 5mg/ml、0. 125 ~0. 5mg/ml、0. 5 ~5mg/ml。
[0036] 实施例2、
[0037] 本实施例按照实施例1所述的方法制备培养后的NK细胞的冻存液，由溶液A和自 体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1 :0. 5,其中： 阳03引溶液A由自体血清混合液与DMS0配制而成，自体血清混合液与DMS0的体积比为 3:1；
[0039]自体血清混合液包括茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C和自体血清，该自体血清混 合液中茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C的终浓度分别为0. 5mg/ml、0. 125mg/ml、0. 5mg/ml。 W40] 实施例3、
[0041]本实施例按照实施例1所述的方法制备培养后的NK细胞的冻存液，由溶液A和自 体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1 :2，其中： 阳0创溶液A由自体血清混合液与DMS0配制而成，自体血清混合液与DMS0的体积比为6:1;
[0043]自体血清混合液包括茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C和自体血清，该自体血清混 合液中茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C的终浓度分别为5mg/ml、0. 5mg/ml、5mg/ml。 W44] 实施例4、
[0045] 本实施例按照实施例1所述的方法制备培养后的NK细胞的冻存液，由溶液A和自 体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1 :1，其中： 阳046] 溶液A由自体血清混合液与DMS0配制而成，自体血清混合液与DMS0的体积比为 4. 5 :1 ;
[0047]自体血清混合液包括茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C和自体血清，该自体血清混 合液中茶多酪、葡萄巧提取物、维生素C的终浓度分别为2. 75mg/ml、0. 3125mg/ml、2. 75mg/ mlo
[0048] 对比例1、
[0049] 本对比例配制常规细胞冻存液，所述常规细胞冻存液为含有10%DMSO的FBS。
[0050] 实施例5、N