K细胞的扩增培养及收集
[0051] 1、外周血单核球的分离 阳05引 1)采集10~80ml的外周血，将其与生理盐水按体积比1 :1的比例混匀，将混匀 后的血液混合液与淋己细胞分离液按体积比2:1的比例缓慢的加至淋己细胞分离液上层，SOOOrpm离屯、20min;
[0053] 2)离屯、后离屯、管的从上到下看，分别为血浆、白膜层，即单个核细胞层（PBMC)、淋 己细胞分离液、红细胞层，抽取PBMC层，将收集到的PBMC用生理盐水洗涂重悬后，150化pm 离屯、lOmin，重复洗涂两次，收集到PBMC;
[0054] 2、NK细胞的扩增培养 阳05引 1)将上述1中收集到的PBMC用RPMI1640基础培养基重悬，按1*106个/ml密度 接种于NK细胞试剂盒中诱导培养NK细胞，置于37°C，浓度为5%的C〇2培养箱中培养；
[0056] 2)诱导5天后，进行补液，全量补加IL-2 500U/ml，补液前细胞密度不大于3*1〇6 个/ml,补液后细胞密度在0. 5-1. 0*106个/ml,每隔3天补液和补加细胞因子。
[0057] 3)直至第14天收集细胞。
[0058]实施例6、对培养后的NK细胞的冻存试验
[0059] 1)分别利用实施例2~4制备的冻存液作为实验组1~3对培养后的NK细胞进 行冻存，利用对比例1制备的常规细胞冻存液作为对照组对培养后的NK细胞进行冻存。
[0060] 实验组1 :用实施例2制备的NK细胞冻存液重悬NK细胞，细胞密度为106个/ml 细胞悬液，每个冻存管1ml/管。
[0061] 实验组2 :用实施例3制备的NK细胞冻存液重悬NK细胞，细胞密度为106个/ml 细胞悬液，每个冻存管1ml/管。
[0062] 实验组3 :用实施例4制备的NK细胞冻存液重悬NK细胞，细胞密度为106个/ml 细胞悬液，每个冻存管1ml/管。 阳06引对照组：用对比例1制备的常规细胞冻存液重悬NK细胞，细胞密度为106个/ml细 胞悬液，每个冻存管1ml/管。
[0064] 2)将上述各冻存管先放入冻存盒中，再将冻存盒放入程序降溫仪中进行冻存，然 后再将冻存管迅速的转移至液氮中冻存。 柳尉实施例7、NK细胞的复苏
[0066] 1)将恒溫水浴锅加热至37。迅速取出上述各组在液氮中冻存了半年（180天） 的细胞冻存管，转移至水浴锅中恒溫水浴，直至完全溶解，再将溶解后的细胞悬液移至加有 完全培养基的离屯、管中洗涂离屯、；
[0067] 2)将上述离屯、后的细胞用完全培养基重悬培养2地，按lOVml个细胞接种于培养 瓶中，全量添加IL-2 500U/ml细胞生长因子，置于37°C，5%C〇2的培养箱中培养。 W側实施例8、NK细胞冻存前后的形态观察 W例将冻存前后的各组NK细胞在倒置显微镜下观察细胞形态，形态观测结果如图1~ 5所示，观测结果表明，3组实验组复苏后的NK细胞与冻存前的细胞形态冻存前后无明显差 异，细胞饱满，透亮光泽，而且有较多的细胞结团，相对对照组，本发明的细胞冻存液对细胞 冻存的影响较小。
[0070] 实施例9、各组NK细胞冻存前与复苏后的各项指标检测 阳07U 1)NK细胞冻存前后的活率检测 阳07引将冻存前后的NK细胞进行台吩蓝染色后，用细胞计数板进行细胞计数，计算出细 胞活率，如下表1所示。
[0073] 表1NK细胞冻存前后细胞活率
[0074]
[0075] 从标1可W看出实验组冻存后复苏的细胞活率接近冻存前，尤其是实验组3的结 果最佳，而实验组的细胞活率都高于对照组，说明本发明的细胞冻存液能够保持细胞的活 性，冻存复苏后细胞的状态基本接近冻存前的状态，冻存效果好。
[0076] 2)NK细胞冻存前后的杀伤活力检测
[0077] 将冻存前后的培养后的NK细胞进行杀伤活性的检测，采用乳酸脱氨酶（LDH)法， WK562细胞为祀细胞，分别检测各组冻存前后的NK细胞，即效应细胞的杀伤活力。效祀比 分别为40 :1、20 :1、10 :1、5 :1的细胞数比例将效应细胞及祀细胞加入96孔板，祀细胞数 为1〇4个/孔，每种效祀比设4个平行孔，每孔200ul。均采用RPMI1640培养基重悬。于 37°C，5%C〇2培养箱中解育地，然后用LDH-切totoxicityColorimetricAssayKitII(美 国，BioVision，货号：K313-500)试剂盒进行检测，采用酶标仪检测波长在490nm时的吸光 值（A)。杀伤活力的计算公式为：NK细胞活性（％ )=(实验-NK细胞自发-K562自发）/ (K562最大-K562自发）X100%，结果如附图6所示。
[0078] 从附图6的结果可W看出各组NK细胞对K562细胞的杀伤活随效祀比的增高而增 强，实验组的NK细胞复苏后与冻存前细胞杀伤活力均无明显差异，而对照组复苏后的NK细 胞在不同的效祀比时杀伤活力均明显低于冻存前的细胞。 阳0巧]3)NK细胞冻存前后免疫表型检测
[0080] 将冻存前与复苏后的收集的NK细胞用PBS重悬NK细胞，密度为106个/ml,加入 FITC标记的CD16和阳标记的CD56抗体，室溫避光解育30min后，用流式细胞仪检测，检测 具有相应免疫表型的细胞比例（％ )，检测结果如表2所示：
[0081] 表2NK细胞冻存前后的免疫表型检测结果
[0082]
[0083]
[0084] 从表2的结果可W看出，冻存前后的NK细胞的免疫表型存在一定差异，实验组比 对照组的免疫表型检测结果高，说明本发明的细胞冻存液的冻存效果更好。
[0085] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种培养后的NK细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液由溶液A和自体血清配制 而成，溶液A和自体血清的体积比为1 :0. 5~2,其中： 溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为3~ 6:1; 自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该细胞的冻存液中 茶多酸、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为0. 5~5mg/ml、0. 125~0. 5mg/ml、0. 5~ 5mg/ml〇2. 根据权利要求1所述的培养后的NK细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液由溶液 A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为1 :0. 5~1，其中： 溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为3~ 5:1; 自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该细胞的冻存液中 茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为0? 5~2. 75mg/ml、0. 125~0? 3125mg/ml、 0? 5 ~2. 75mg/ml〇3. 根据权利要求1所述的培养后的NK细胞的冻存液，其特征在于，所述冻存液由溶液 A和自体血清配制而成，溶液A和自体血清的体积比为I: 1~2,其中： 溶液A由自体血清混合液与DMSO配制而成，自体血清混合液与DMSO的体积比为5~ 6:1; 自体血清混合液包括茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，该自体血清混合液 中茶多酸、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为2. 75~5mg/ml、0. 3125~0. 5mg/ml、 2. 75 ~5mg/ml〇4. 一种培养后的NK细胞的冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 自体血清混合液的配制：分别称取适量茶多酚、葡萄籽提取物和维生素C加入自体 血清中，制得自体血清混合液； 2) 溶液A的配制：向步骤1)中制得的自体血清混合液中缓慢加入DMS0,自体血清混合 液与DMSO的体积比为3~6 :1，制得溶液A，置于2~8°C度冰箱预冷，备用； 3) 将预冷后的溶液A取出，缓慢加入到自体血清中，溶液A和自体血清的体积比为1 : 0. 5~2,制得冻存液，其中，茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C的终浓度分别为0. 5~5mg/ ml、0. 125 ~0? 5mg/ml、0. 5 ~5mg/ml〇
【专利摘要】本发明涉及细胞冻存液技术领域，具体涉及一种培养后的NKT细胞的冻存液及其制备方法，本发明的培养后的NK细胞的冻存液包含茶多酚、葡萄籽提取物、维生素C和自体血清，由于其采用自体血清，不存在外源动物病毒的污染及外源蛋白质的引入，安全性高；其中加入的茶多酚、葡萄籽提取物(原花青素)、维生素C不仅能有效的抑制细胞氧化，保持细胞的活性，对人体无任何伤害，而且冻存复苏后细胞的状态基本接近冻存前的状态，冻存效果好。
【IPC分类】A01N1/02
【公开号】CN105211051
【申请号】CN201510727721
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 李丽娟
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月29日