专利名称：重建人t－PA分子及表达重建人t－PA蛋白的工程菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重建的新型t-PA分子及其重建方法，以及用于高效表达这种重建人t-PA蛋白的工程菌株。
血栓类疾病是常见病、多发病，随着我国人民生活水平的不断提高，人们营养摄入的不平衡，高脂化、血栓类疾病已成为危害人类健康的最危险的杀手，其中冠心病、心肌梗塞、脑血栓病已成为我国及全世界死亡多的流行病，并且有年青化的趋势，这些疾病的发生和发展均与不溶性纤维蛋白在血管壁沉积或血栓的形成有密切的关系。
血栓形成是指在机体心脏或血管内由血液的组成成份所形成的一种半固体凝块。血栓可在血循环的任何部分形成。在血管内处于流动状态的血液，会不断有不溶性的纤维蛋白的析出，贴附在血管壁内，形成薄层。同时血液循环中的溶纤系统的各种因子则不断将已析出的纤维蛋白溶解以排除其在血管中的沉积，使血凝与纤溶处于一种动态平衡，避免血管堵塞。在血液中的纤维蛋白酶原，可受各种激活因子作用而活化为纤溶酶。
纤溶酶原激活剂有链激酶(SK)、尿激酶(UK)和人组织型纤溶酶激活因子(t-PA)，由于SK和UK副作用大，缺乏溶纤特异性，造成溶纤酶原系统性激活，因此，在临床应用于心肌梗塞、脑血栓等疾病急救时用量大，且在溶血栓的同时极易引起内出血和脑出血，这同样是致命的。而t-PA来源于人组织，它能特异性地与血栓处的纤维蛋白结合，优先激活该处的纤溶酶原，因此使用起来效率高，专一性强，副作用小，安全性高，临床上应用能在短时间内使通血率达75％以上，这是所有的其它溶栓剂所不能比拟的。尽管如此，由于全长天然t-PA具有与纤溶酶激活物抑制物(PAⅠ)相互作用的结构，其活性很容易被PAⅠ所抑制。鉴此，研究开发一种增加和保留优点，克服缺点的新的t-PA的变异分子或重建分子是非常必要的。
本发明的目的在于提供一种重建的人t-PA分子及其重建方法，以及用于表达这种重建的人t-PA蛋白的工程菌株。这种重建的人t-PA分子应具有较高的溶纤活性和较强的特异性，并能在工程菌株中高效表达。
基于上述目的，本发明采用基因工程、分子生物学等先进技术，重建了一种人t-PA分子，并在工程菌中高效表达，纯化的这种重建t-PA蛋白分子，具有激活溶纤活性高、特异性强和稳定性高等特点。
为实现上述目的，本发明的所采用的具体技术方案如下一．t-PA基因重建过程根据对原型t-PA蛋白分子的结构与功能域分析估计，保留与特异性和激活有关的功能区域，去除无关的及与PA1抑制物结合的区域，设计了4条核苷酸引物，用RT-PCR法分别从脐带血管内皮细胞总RNA模板中扩增获得t-PA N端包括F-G区编码和C端P区编码的二个DNA片段(约0．3Kb和0．8Kb)分别克隆到puc-T载体中，转化DH5α菌株，鉴定后扩增质粒，用内切酶切割、低熔点琼脂糖电脉回收0．3和0．8Kbr DNA带，把编码N端氨基酸的0．3KbDNA定向克隆到原核表达载体pQE30的BamHⅠ-KpnⅠ位点，建成pQEtPAⅠ，把0．8Kb片段插入pQE30的KpnⅠ和HindⅢ之间，建成pQEtPA2，扩增pQEtPA1质粒DNA，用KpnⅠ和HindⅠ切割，定向插入0．8Kb的C端P编码区，建成pQEtPAr，pQEtPAr即本发明的tPA重建分子。经内切酶分析鉴定后，作全序列分析证实，重建的tPA分子与设计完全相符，pQEtPAr转化的JM109和M15产生的工程菌株均能表达出有激活溶纤酶原活性的tPA蛋白，分子量约41～42Kda，有良好的激活溶纤活性。
1． RT-PCR引物(1) 5’ -GAG CTC ATG AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AGA-3’BglⅡ(2) 5’ -GTC GAC GGT ACC CGTGGC CCT GGT ATC TAT-3’KpnⅠ(3) 5’ -GTC GAC GGT ACC TGC GGC CTG AGA CAG GAC-3’KpnⅠ(4) 5’ -AGA TCT AGA AGC TTC TCG AG TCA CGG TCG CAT GTT GTC-3’HindⅢ2．RT-PCR法获得tPA基因DNA片段引物(1)和(2)扩增0．3KbDNA，引物(3)和(4)为一对扩增0．8KbDNA。
RT-PCR反应混合物组成和条件为10×bulfer5μldNTPS(脱氧核苷三磷酸) 5μl(每种终浓度为250μM)正负链引物 各1μl(各50pM)模板RNA 2μl(约1μgRNA)RNasin1μl(约40u／μl)H2O(DEPC处理) 31μlMMLV逆转录酶 1μlAdvanTaqTMDNA聚合酶 1μl。
加逆转录酶和Taq DNA聚合酶前，混合其它成份，80℃保温3分钟，以消除RNA分子内部可能存在的二级结构，冷至室温，然后加入MMLV逆转录酶，39℃进行逆转录反应1小时，再加入Taq DNA聚合酶及石蜡油覆盖，94℃4分钟，然后94℃1分钟，52℃1分钟，70℃30秒(扩增0．3Kb)或1分钟(扩增0．8Kb)最后一轮70℃7分钟，进行30个循环。取5μl RT-PCR产物为第二次扩增模板，PCR反应混合物除不加RNasin和MMLV逆转录酶外，其余成份与上述相同。第二次扩增进行30次循环，分别扩增出约0．3Kb和0．8Kb的tPA DNA片段，酚-氯仿提抽提，乙醇沉淀，溶于10μlTE中-20℃保存备用。
3．tPA重建分子的拼接和克隆1)．0．3Kb和0．8Kb片段的puc-T载体克隆a．DH5α受体菌感受态细胞制备用标准冷CaCl2法。
b．DNA连接反应10×T4DNA连接酶反应Buffer2μl，1μl puc-T DNA(约0．1μg)，1μl 0．3Kb或0．8KbDNA片段，1μl T4DNA连接酶(约2u)，15μl水．混合后16℃反应6小时。
c．转化在50μl感受态DH5α细胞中加入10μl连接反应产物，冰中放30分钟，41℃水浴放90秒钟，然后放冰中5分钟后直接涂布含Amp和IPTG、X-Gal的2YT平皿，37℃培养过夜。
c．重组质粒puctPA1和puctPA2鉴定用接种环挑选平皿中的白色菌落，接种10ml含Amp的2YT培养液，37振荡培养过夜，取0．5ml加0．5ml无菌30％甘油作菌种保存(-20℃)，其余培养液离心收集菌体，用标准冷碱法提取质粒DNA，用BglⅡ和KpnⅠ(鉴定0．3Kb克隆)或KpnⅠ和HindⅢ(鉴定0．8Kb克隆)双酶切，1．5％琼脂糖胶电泳鉴定，经鉴定后获得的0．3Kb克隆命名puctPA1，0．8Kb克隆命名为puctPA2。
2)0．3Kb和0．8Kb的tPADNA片段的拼接和表达载体pQE30克隆a．0 3Kb和0．8Kb片段克隆pQE30质粒DNA用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切(用于克隆0．3kb片段)和用KpnⅠ加HindⅢ双酶切(用于克隆0．8Kb片段)，puctPA1 DNA用BglⅡ和KpnⅠ双酶切，puctPA2 DNA用KpnⅠ和HindⅢ切割，用低熔点琼脂糖胶电泳分离后，分别回收约0．3Kb片段和0．8Kb片段及切开的pQE30 DNA，经连接后转化JM109菌株，重组质粒用双酶切鉴定，分别获得pQEtPA1和pQEtPA2重组质粒转化的JM109菌株。
B．0．8Kb片段插入pQEtPA1质粒DNA用KpnⅠ和HindⅢ切开，用KpnⅠ和HindⅢ双酶切割puctPA2DNA获得0．8Kb片段，连接转化JM109菌株，经酶切鉴定，获得重建的tPA克隆，命名为E．coli JM109pQEtPAr。该工程菌株已于2000年6月1日提交到中国典型培养物保藏中心、(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC No M200018。
由本发明所得的工程菌种的生物学特性如下JM109pQEtPAr recAl supE44 endAl hsdR17 gyrA96 relA1 thi△(lac-proAB)F{traD36proAB+lacⅠqlacz△M15}pQEtPAr，一种支持带有琥珀突变的载体生长的重组缺陷的抑制型菌株，对转染的DNA有修饰作用而无限制作用，带有pQEtPAr质粒，并能表达出有活性的重建tPA蛋白。
4．重建tPA分子克隆pQEtPAr的内酶切分析和DNA序列测定EcoRⅠ切割，两条带0 6Kb和3．9Kb；EcoRⅠ+HindⅢ切割，三条带0．5Kb，0．6Kb和3．4Kb；KpnⅠ+HindⅢ切割，两条带0．8Kb和3．7Kb；pstⅠ+HindⅢ切割，两条带约1Kb和3．5kb；
用HindⅢ、KpnⅠ、pstⅠ任意一种酶单独切割，都产生一条带4．5Kb带。
克隆的重建tPA基因全序列分析结果，含tPA编码区共1074nt，编码358个氨基酸，见后。
二、重建t-PA在JM109中的表达1．JM109 pQEtPAⅡ接种2YT(Amp)，37℃培养过夜，10％转种，IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(1mmol/L)，37℃诱导培养5小时，或30℃诱导24小时，取诱导前后样品，以只含载体pQE30的JM109作对照，SDS-PAGE检查。
2．JM109 pQEtPAr接种2YT(Amp)，37℃培养过夜，10％转种，加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(1mmol／L)，37℃诱导培养7-8小时，取诱导前后样品，只含载体pQE30的JM109作对照，SDS-PAGE检查，表达出的重建tPA蛋白分子量约为41～42KD。
三、重建分子t-PA活性测定(纤维平板测活法)1．按文献中国生物化学与分子生物学报，1998，14(2)156-159]方法略改动(平板中不加纤溶酶原改加到加样孔中)制作纤维平板。
1．在平板上均匀打孔，分别加入待测样品+纤溶酶原；t-PA标准品+纤溶酶原JM109 pQE30裂解液+纤溶酶原纤溶酶原JM109 pQE30裂解液于37℃放置10小时，测溶纤圈大小(圈的面积-加样孔面积)与t-PA标准品比较，得出样品单位数量大小。(注样品为诱导表达后，收集菌体超声波破细胞的上清。)重建t-PA分子的测序结果CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AGA GAT GAA AAA→tPA编码 pstⅠACG CAG ATG ATG ATA TAC CAG CAA CAT CAG TCA TGG CTG CGC CCT GTG CTC AGAAGC AAC CGG GTG GAA GAT TGG TGG TGC AAC AGT GGC AGG GCA CAG TGC CACTCA GTG CCT GTC AAA AGT TGC AGC GAG CCA AGG TGT TTC AAC GGG GGC ACCTGC CAG CAG GCC CTG TAC TTC TCA GAT TTC GTG TGC CAG TGC CCC GAA GGATTT GCT GGG AAG TGC TGT GAA ATA GAT ACC AGG GCC ACG GGT ACC TGC GGCKpn ⅠCTG AGA CAG GAC ACC CAG CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCCGAC ATC GCC TCC CAC CCC TGG CAG GCT GCC ATC TTT GCC AAG CAC AGG AGGTCG CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGV GGG GGC ATA CTC ATC AGC TCC TCC TGGATT CTC TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG GAG AGG TTT CCG CCC CAC CAC CTTACG GTG ATC TTG GTC AGA ACA TAC CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG GAGCAG AAA TTT GAA GTC GAA AAA TAC ATT GTC CAT AAG GAA TTC GAT GAT GACEcoR ⅠACT TAC GAC AAT TAC ATT GCG CTG CTG CAG CTG AAA TCG GAT TCG TCC CGCTGT GCC CAG GAG AGC CGC GTG GTC CGC ACT GTG TGC CTT CCC CCG GCG GACCTG CAG CTT CCG GAC TGG ACG GAG TGT GAG CTC TCC GGC TAC GGC AAG CATGAG GCC TTG TCT CCT TTC TAT TCG GAG CGG CTG AAG GAG GCT CAT GTC AGACTG TAC CCA TCC AGC CGC TGC ACA TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTCACC GAC AAC ATG GTG TGT GCT GGA GAC ACT CGG AGC GGC GGG CCC CAG GCAAAC TTG CAC GAC GCC TGC CAG GGC GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG TGT CTGAAC GAT GGC CGC ATG ACT TTG GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGC CGG GGC TGTGGA CAG AAG GAT GTC CCG GGT GTG TAC ACC AAG GTT ACC AAC TAC CTA GACTGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA 。stop
权利要求
1．一种重建的人组织型纤溶酶激活因子t-PAr，其基因全序列为CAT CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AGA GAT GAA AAA→tPA 编码 pst IACG CAG ATG ATG ATA TAC CAG CAA CAT CAG TCA TGG CTG CGC CCT GTG CTC AGAAGC AAC CGG GTG GAA GAT TGG TGG TGC AAC AGT GGC AGG GCA CAG TGC CACTCA GTG CCT GTC AAA AGT TGC AGC GAG CCA AGG TGT TTC AAC GGG GGC ACCTGC CAG CAG GCC CTG TAC TTC TCA GAT TTC GTG TGC CAG TGC CCC GAA GGATTT GCT GGG AAG TGC TGT GAA ATA GAT ACC AGG GCC ACG GGT ACC TGC GGCKpn ⅠCTG AGA CAG GAC ACC CAG CCT CAG TTT CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCCGAC ATC GCC TCC CAC CCC TGG CAG GCT GCC ATC TTT GCC AAG CAC AGG AGGTCG CCC GGA GAG CGG TTC CTG TGV GGG GGC ATA CTC ATC AGC TCC TCC TGGATT CTC TCT GCC GCC CAC TGC TTC CAG GAG AGG TTT CCG CCC CAC CAC CTTACG GTG ATC TTG GTC AGA ACA TAC CGG GTG GTC CCT GGC GAG GAG GAGCAG AAA TTT GAA GTC GAA AAA TAC ATT GTC CAT AAG GAA TTC GAT GAT GACEcoR ⅠACT TAC GAC AAT TAC ATT GCG CTG CTG CAG CTG AAA TCG GAT TCG TCC CGCTGT GCC CAG GAG AGC CGC GTG GTC CGC ACT GTG TGC CTT CCC CCG GCG GACCTG CAG CTT CCG GAC TGG ACG GAG TGT GAG CTC TCC GGC TAC GGC AAG CATGAG GCC TTG TCT CCT TTC TAT TCG GAG CGG CTG AAG GAG GCT CAT GTC AGACTG TAC CCA TCC AGC CGC TGC ACA TCA CAA CAT TTA CTT AAC AGA ACA GTCACC GAC AAC ATG GTG TGT GCT GGA GAC ACT CGG AGC GGC GGG CCC CAG GCAAAC TTG CAC GAC GCC TGC CAG GGC GAT TCG GGA GGC CCC CTG GTG TGT CTGAAC GAT GGC CGC ATG ACT TTG GTG GGC ATC ATC AGC TGG GGC CGG GGC TGTGGA CAG AAG GAT GTC CCG GGT GTG TAC ACC AAG GTT ACC AAC TAC CTA GACTGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGAstop 。
2．一种用于表达权利要求1所述的重建的人组织型纤溶酶激活因子t-PAr的工程菌株E．coli JMl09pQEtPAr，该工程菌株已提交到中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC M200018。
3．权利要求1所述的重建的人组织型纤溶酶激活因子t-PAr的重建方法，其特征在于以脐带血管内皮细胞总RNA为模板，设计了4条核苷酸引物(1) 5’ -GAG CTC ATG AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AGA-3’BglⅡ(2) 5’ -GTC GAC GGT ACC CGTGGC CCT GGT ATC TAT-3’KpnⅠ(3) 5’ -GTC GAC GGT ACC TGC GGC CTG AGA CAG GAC-3’KpnⅠ(4) 5’ -AGA TCT AGA AGC TTC TCG AG TCA CGG TCG CAT GTT GTC-3’HindⅢ其中引物(1)和(2)为一组，引物(3)和(4)为一组，用RT-PCR法分别扩增模板获得t-PAN端包括F-G区编码和C端P区编码的一个约0．3Kb DNA片段和一个约0．8Kb DNA片段，再分别克隆到puc-T载体中，转化DH5α菌株，鉴定后扩增质粒，用内切酶切割、低熔点琼脂糖电脉回收0．3和0．8Kbr DNA带，把编码N端氨基酸的0．3Kb DNA定向克隆到原核表达载体pQE30的BamH I-KpnⅠ位点，建成pQEtPAⅠ，把0．8Kb片段插入pQE30的KpnⅠ和HindⅢ之间，建成pQEtPA2，扩增pQEtPAl质粒DNA，用Kpn I和HindⅢ切割，定向插入0．8Kb的C端P编码区，建成pQEtPAr，即为本发明重建的人组织型纤溶酶激活因子t-PAr分子。
全文摘要
本发明公开了一种重建的人t－PA分子及其重建方法,以及用于表达这种重建的人t－PA分子的工程菌株。这种重建的人t－PA分子具有较高的溶纤活性和较强的特异性,并能在工程菌株中高效表达,因此,在医学上具有重要的应用价值。
文档编号C12N15/12GK1281048SQ0011597
公开日2001年1月24日 申请日期2000年8月24日 优先权日2000年8月24日
发明者叶林柏, 郜金荣, 徐进平, 吴正辉 申请人:武汉大学