专利名称：一种与心力衰竭相关的细胞凋亡调节蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与心力衰竭相关的细胞凋亡调节蛋白，还涉及编码该蛋白的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体和细胞，还涉及利用该蛋白和编码该蛋白的多核苷酸检测心力衰竭疾病的方法，以及利用这些蛋白、多核苷酸、载体或细胞的治疗肿瘤和与细胞增殖相关的疾病的方法和药物组合物。
背景技术：
心脑血管病是威胁人类健康的重大疾病之一。据统计，每年约有260万中国人死于此病，平均每12秒就有一位同胞被该病夺去生命。在中国，心脑血管病死亡人数占总死亡人数的比率从1957年的12.1％上升至1990年的35.8％，升高了2.9倍。据世界银行预测到2020年，全世界心脑血管病死亡人数占总死亡人数的比率将从1990年的28.9％升至36.3％，其中70％的心脑血管病发生在发展中国家。因此，心脑血管病的防治对减轻人类经济负担，确保人体健康具有十分重要的意义。
1972年，Kerr、Wyllie及Gurrie等首次提出“细胞凋亡”的概念。如今，细胞凋亡已经成为细胞学和病理学领域关注的热点。凋亡被认为是与细胞的有丝分裂增殖相互平衡的一种机制。过度的细胞凋亡或者细胞凋亡不足，均能导致人类疾病。过度的细胞凋亡将致使器官萎缩及器官衰竭，例如神经系统疾病、病毒性肝炎等。而细胞凋亡不足，则不能及时清除发生恶性转变、自身免疫、感染的细胞，以及机体多余的细胞，将会导致肿瘤、自身免疫疾病、病毒感染以及先天性畸形。随着分子生物学的深入研究，细胞凋亡的感应器(effector)及调节机制得以阐明，细胞凋亡的进一步深入研究成为一个焦点。最近的研究表明细胞凋亡在许多心血管疾病，包括心肌梗塞、心力衰竭和动脉粥样硬化以及高血压中起着重要作用。
细胞凋亡明显区别于由于毒素反应、物理刺激、缺血等原因引起的细胞凋亡。它是一种自主性的细胞死亡，设计一系列基因的激活、表达以及调控等作用。目前，将细胞死亡分为两大范畴，一类为急性细胞死亡，称为“坏死”(necrosis)，另一类称为程序性细胞死亡(programmed celldeath)或细胞凋亡(apoptosis)。细胞坏死的特征为细胞溶解，破碎，不具备完整的膜结构，线粒体肿胀，Ca内吞，染色质分解，没有蛋白质合成，ATP过分消耗等。而细胞凋亡的特征为细胞膜发生皱缩、凹陷，但可以具有完整的膜结构，染色质变致密，最后断裂成小碎片，进一步发展，细胞膜将细胞质分割包围，形成凋亡小体(apoptotic body)。形成的调往小体能被其周围的细胞或巨噬细胞所吞噬，因此不至产生炎症反应。
心肌细胞数量的减少是心力衰竭产生和/或恶化的最重要病理基础。心肌细胞死亡主要有两种形式，细胞坏死和细胞凋亡。近年来的研究表明心肌细胞凋亡是引起心室心肌细胞数目减少的重要原因，在心力衰竭左室功能损害和恶化中起重要作用。心肌细胞凋亡也是心室重构的重要表现。在增龄、缺氧、缺血再灌注、心肌梗塞、肥厚型心肌病等情况下发现心脏有心肌细胞凋亡的增加，终末期心力衰竭患者心脏心肌细胞凋亡更较正常人增加232倍。一些生长因子和细胞因子(如血管紧张素II、TNF和心房利尿肽等)均可诱导心肌细胞凋亡的发生。但到目前为止细胞凋亡的分子生物学机制尚未完全阐明。
cDNA文库是生物工程领域的重要研究工具之一。通常从细胞中提取mRNA，通过反转录酶合成mRNA的DNA拷贝(即cDNA，Compl ementary DNA)。单链cDNA分子在DNA聚合酶的作用转变成双链DNA分子，然后再插入载体，转化到宿主菌中长成克隆。这样的每个克隆只包含特定的mRNA信息，这样的一套克隆就称为cDNA文库。
由于cDNA不含内含子，从cDNA文库中可以直接筛选到相应的表达基因，故相对基因库而言，cDNA文库具有操作简单、使用方便的优点。人体不同细胞表达基因的差异决定了其组织和器官表型的差异，从人主动脉cDNA文库中分离和鉴定特异表达基因，特别是分离和鉴定疾病相关基因，是研究遗传性心血管病的有效方法之一。
发明概述本发明提供一种与心力衰竭相关、并具有细胞凋亡调节作用的carp蛋白，其如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列.
本发明还提供一种检测方法，包括通过检测取自宿主的样品中carp蛋白的表达，诊断心力衰竭。
本发明还提供一种药物组合物，其含有本发明的carp蛋白和必要时的药物可接受的载体或赋形剂。
因此，本发明涉及作为药物的carp蛋白。
本发明还提供本发明的carp蛋白在制备抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的药物中的应用。
本发明还提供一种治疗肿瘤或者细胞增殖相关性疾病的方法，包括给予需要此类治疗的患者治疗有效量的本发明的carp蛋白。
另外，本发明涉及编码上述本发明carp蛋白的核苷酸序列。
本发明还涉及含有上述本发明核苷酸序列的载体。
本发明还涉及含有上述本发明核苷酸序列或载体的细胞。
本发明还提供作为药物的上述本发明的核苷酸序列、载体或细胞。
本发明还涉及含有上述本发明核苷酸序列、载体或细胞的，具有抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡作用的药物组合物。
本发明还涉及一种治疗肿瘤或者细胞增殖相关性疾病的方法，包括给予需要此类治疗的患者治疗有效数量的上述本发明核苷酸序列、载体或细胞。
附图简述
图1显示carp在12种组织的表达。其中，A为Northern杂交结果；B为Northern杂交表达量的柱形图。(1脑；2心脏；3骨骼肌；4结肠；5胸腺；6脾脏；7肾脏；8肝脏；9小肠；10胎盘；11肺；12外周血白细胞。)图2显示carp在8种肿瘤细胞系中的表达。其中，A为Northern杂交结果；B为Northern杂交表达量的柱形图。(1早幼粒白血病HL-60细胞系；2宫颈癌细胞系S3株；3慢性粒细胞白血病K-562细胞系；4淋巴母细胞性白血病MOL-4细胞系；5 Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞系；6结肠腺SW480细胞系；7肺癌A549细胞系；8黑色素瘤G-361细胞系。)图3为反义探针的原位杂交结果。其中①-④示carp在WKY大鼠肾脏、肝脏、脑和脾脏的表达分布；⑤-⑧示WKY大鼠肾脏、肝脏、脑和脾脏切片的苏木精和曙红(HE)染色结果。
图4为免疫组织化学分析结果。其中，A为正常人心脏组织切片免疫前兔血清；B为人室壁瘤组织切片免疫前兔血清；C为人室壁瘤组织切片抗carp兔血清。
图5为间接ELISA法检测心衰患者血清中carp自身抗体水平的结果。
图6为carp蛋白的亚细胞定位结果。其中，①-②为pEGFPC2转染HEK293S细胞的激光共聚焦照片，图中示绿色荧光蛋白定位于细胞浆；③-④为pEGFPC2-carp转染HEK293S细胞的激光共聚焦照片，图中示carp蛋白定位于细胞核。
图7为依据血球计数结果绘制的细胞的增殖曲线。其中，A为pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B-carp-MYC和pcDNA3.1B转染的肺癌A549细胞的增殖曲线，B为pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE和pcDNA3.1B转染的肺癌A549细胞的增殖曲线。
图8为pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE和pcDNA3.1B转染的肺癌A549细胞的DNA合成柱形图，依据甲基-3H胸腺嘧啶核苷法的测定结果绘制。
图9为carp抑制肝癌H7402细胞系、膀胱癌BIU87细胞系和黑色素瘤WM451细胞系增殖的柱状图，依据血球计数结果绘制。
图10显示carp诱导细胞凋亡效应。其中，①、⑥是pcDNA3.1B转染的HEK293S细胞，为阴性对照；②-⑤和⑦-⑩是pcDNA3.1B-carp转染的HEK293S细胞，箭头所示为凋亡细胞。
图11显示carp诱导的细胞周期改变。其中，A显示分别转染pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B和pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE的肺癌A549细胞在G1期、S期和G2期的DNA分布；B显示分别转染pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B和pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE的肺癌A549细胞的G2期/G1期DNA分布比较。
发明详述本发明人构建了成人主动脉cDNA文库，通过表达序列标签(EST)引物步移法，从文库中获得carp全长cDNA。进而将carp基因成功地引入原核和真核表达系统，系统地研究了carp蛋白的生物学功能，确定了其与心力衰竭相关，并具有抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。
本发明一方面提供了carp蛋白，该蛋白由SEQ ID NO。1所示的第196-1533位核苷酸编码、并具有推定的SEQ ID NO。1所示的氨基酸序列。carp核苷酸编码序列从成人主动脉cDNA文库中获得。
根据核苷酸编码序列推定的carp蛋白由445个氨基酸组成。生物信息学分析表明carp蛋白分子量为49724.5Da，等电点为4.69。氨基酸序列内没有信号肽和跨膜区，但存在蛋白激酶C磷酸化位点、络氨酸激酶II磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、G蛋白耦联受体复合物1信号。
在一些优选实施方案中，本发明的carp蛋白可以与另一种多肽或蛋白形成融合蛋白。在实施例3中，carp蛋白与硫氧还蛋白融合产物在原核系统获得了表达，并通过纯化的融合蛋白制备多克隆抗体。在实施例4中，carp蛋白与绿色荧光蛋白融合，通过融合蛋白确定了carp蛋白在真核细胞中定位于细胞核。根据本发明carp蛋白的生物学功能，可以设想将carp蛋白与其它功能性肽或蛋白融合，形成不同形式的多功能融合蛋白。例如，与各类细胞因子，如IL-2融合，以在抑制细胞增殖的同时局部活化T淋巴细胞等；与特异性抗体或其片段，如肿瘤细胞抗体或其片段融合，从而使本发明carp蛋白在体内的分布具有靶向性。
本发明的carp蛋白及其融合蛋白可以是重组的，天然的，或者是合成的。优选通过重组方法获得，即，通过在适当宿主中表达含有本发明carp蛋白或融合蛋白编码序列的多核苷酸，然后纯化表达的蛋白产物来获得。
可以将编码本发明carp蛋白的寡核苷酸，与用相应限制酶消化的含其它多肽或蛋白编码序列的适当载体用T4连接酶连接，得到编码融合蛋白的DNA序列。所述其它多肽或蛋白的编码序列一般是已知的，有些可以以载体形式购买得到，或者可以按常规方法合成或从已知生物体中克隆得到。如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段的核苷酸序列可以用常规方法，如双脱氧链终止法(Sanger等人，PNAS，1977，745463-5467)测定。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。
表达载体中应含有适当的启动子、核糖体结合位点、终止子等。为了便于表达产物在细胞中定位，在蛋白编码序列上游可加入适当的前导序列。合适载体和启动子的选择为本领域普通技术人员周知。细菌适用的有效表达载体可以这样构建将编码目的蛋白的结构DNA序列随同适当的翻译起始和终止信号被插入到带有一个功能启动子的可操纵的阅读框中。本领域普通技术人员周知用于构建含有本发明核苷酸序列以及合适的转录及翻译调控元件之载体的方法。本领域技术人员知晓，根据本发明DNA序列所插入的表达载体或构建体的种类和特性选择合适的宿主以表达目的蛋白质。
适于表达本发明蛋白的宿主包括但不限于原核宿主，诸如大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等；真核宿主，诸如酵母属、曲霉属、昆虫细胞，诸如果蝇S2和草地夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO、COS(猴肾成纤维细胞系，Gluzman(Cell 23175，1981)及其它的能表达相容载体的细胞系。将构建体导入上述宿主细胞的方法为本领域技术人员周知，包括但不限于氯化钙介导的转化、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、显微注射、粒子轰击法或基因枪方法(Sambrook，J.(1989)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N.Y.；Ausubel，F.M.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.；Hobbs，S.等人，McGraw Hill Yearbook ofScience and Technology(1992)，McGraw Hill，N.Y.191-196；Engelhard，E.K.等人，PNAS，913224-3227；Logan，J.等人，PNAS，813655-3659)。在适当的培养条件与培养基中培养经转化的宿主菌株或细胞，使其生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。针对不同的宿主菌株或细胞选择以及所表达的目的蛋白质的性质相应的培养条件和培养基在本领域技术人员知识范围之内。所表达的多肽或融合蛋白按常规方法从培养物中分离和纯化，如离心、沉淀、各种色谱、HPLC等。
另一方面，本发明涉及一种预测评估心力衰竭(如室壁瘤)的方法。本发明人已经发现，carp蛋白与心力衰竭的密切相关，心力衰竭患者血清中carp自身抗体明显升高(实施例4)。因此，根据本发明，可以用carp蛋白作为诊断指标，通过检测来自宿主的样品中carp蛋白的异常表达，判断心力衰竭的程度及治疗效果。可以用本领域公知的各种方法，在体内或体外进行检测。分析来自宿主的样品中carp改变水平的方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、Western印迹分析、ELASA测定等等。优选ELASA法。
在本发明的一个优选实施方案中，利用间接ELASA法，检测到心力衰竭患者血清中高水平的carp自身抗体。
另一方面，本发明的carp蛋白或其融合蛋白可以与药学上可接受的赋形剂或载体结合，形成药物组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料。所述药物组合物适于胃肠外、舌下、脑池内、腹膜内、直肠内、颊内、肿瘤内或表皮给药。
胃肠外给药包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、关节内注射和输注。适于胃肠外给药的药物组合物包括无菌水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在临使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、羧甲基纤维素、植物油和可注射的有机酯如油酸乙酯。这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂等佐剂。加入等渗剂如糖类、氯化钠等可能是有利的。
表皮给药包括在皮肤、粘膜上、以及在肺和眼的表面给药。这样的药物组合物包括粉剂、软膏、滴剂、透皮贴剂、离子电渗疗法装置以及吸入剂等。在适于吸入的组合物中，本发明的蛋白被压缩或含于压缩气体如氮气或液化气体推进剂中。优选地，本发明的蛋白不溶于液化推进介质中。
直肠给药的组合物优选为栓剂，它可以通过将本发明的肽与适宜的非刺激性赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合制备，所述赋形剂或载体在室温为固态，在体温下为液态，因此在直肠腔内熔化并释放出活性化合物。
由于carp蛋白具有抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用，而恶性肿瘤的特性之一是无限制增殖，因此，本发明的carp蛋白以及含有carp蛋白的药物组合物有望成为治疗肿瘤和细胞增殖性疾病的药物。
当以上述或其他方式进行治疗时，治疗有效量的本发明的蛋白可以是纯净形式、药物可接受的盐形式，使用或不使用药物可接受的赋形剂。治疗有效量是指以适宜治疗的、对肿瘤或对细胞增殖相关性疾病有效的本发明蛋白的量。对任何特定患者的具体治疗有效剂量取决于许多因素，包括所治疗的疾病和气其严重程度；所用具体化合物的活性；所用的特定组合物；患者的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况；给药时间；给药途径；具体化合物的排泄速度；治疗的持续时间联合或同时服用的其他药物等。例如，本发明的蛋白在局部给药时，总的日剂量为0.05-20mg/kg体重，在系统给药时的日剂量为0.15-50mg/kg体重。对于分子量为约2.7万的融合蛋白，在局部给药时的日剂量为0.15-60mg/kg体重，传统给药时的日剂量为0.5-150mg/kg体重。如果需要，日剂量可以分成多次给药。因此，组合物的单一剂量形式可以含有构成日剂量的全部或其一部分的量。
另一方面，本发明还涉及编码如上所定义本发明蛋白的多核苷酸。
因此，本发明进一步涉及含有本发明多核苷酸的质粒或病毒载体，以及含有本发明多核苷酸或载体的细胞。
相应地，本发明涉及一种治疗肿瘤或细胞增殖相关性疾病(如血管增生)的药物组合物，其含有本发明的多核苷酸、载体或细胞，和必要时药学上可接受、特别是基因治疗适用的赋形剂。
最后，本发明涉及治疗肿瘤或细胞增殖相关性疾病的方法，包括给予需要此类治疗的患者治疗有效量的本发明的蛋白、多核苷酸、载体或细胞。
为了更清楚地理解本发明，现参照以下实施例对其进行说明。实施例对本发明的保护范围没有任何限制意义。优选实施例详述实施例1.成人主动脉cDNA文库的构建1.总RNA的提取和mRNA的分离使用RNA gentsTotal RNA Isolation System kit(美国Promega公司)从成人主动脉组织提取细胞总RNA。具体操作参见试剂盒说明。
使用Quick prepmicro mRNA purification kit(Pharmacia公司)，通过亲和层析，得到高纯度的mRNA。本实验采用的柱床介质oligo(dT)纤维素含有12-18个核苷酸(T)多聚链，在多盐条件下，带oligo(A)尾巴的mRNA与oligo(dT)结合并挂在柱子上，不带oligo(A)尾巴的rRNA和tRNA被洗掉。随后在低盐条件下洗脱挂在柱子上的mRNA。具体操作参照试剂盒说明。
2.双链cDNA的合成使用ZAP ExpressTMcDNA Synthesis Kit(美国STREGENE公司)合成双链cDNA。
在离心管中依次加入10×第一链缓冲液5μl，甲基化的dNTP混合物3μl，含有XhoI酶切位点和Poly(dT)的引物2μl(1.4μg/μl)，DEPC处理的去离子水32.5μl，RNA酶抑制剂1μl(40u/μ1)，mRNA 5μg，置室温10分钟。再加入MMLV-反转录酶1.5μl(50u/μl)，反应总体积50μl。混匀，37℃孵育1小时，以合成cDNA的第一链。
在冰浴中依次加入45μl第一链cDNA，20μl 10×第二链缓冲液1，6μl dNTP混合物，114μl去离子水，2μl[α-32p]dATP(800ci/mmol)，2μl RNA酶H(1.5u/μl)，11μl DNA聚合酶I(9.0u/μl)，反应总体积200μl。混匀，16℃孵育2.5小时，以合成cDNA的第二链。得到的双链cDNA用酚∶氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀.
3.cDNA与载体的连接(1)cDNA与连接子的连接使用ZAP ExpressTMcDNA GigapackII Gold Cloning Kit(Stregene公司)。从试剂盒中取9μl EcoRI连接子(5’-AATTCGGCACGAG-3′和3’-GCCGTGCTC-5’)溶解cDNA。取1μl进行电泳，在剩余的8μ1中依次加入10×连接酶缓冲液1μl，γ-三磷酸腺苷1μl(10mmol/L)，T4DNA连接酶1μl(4u/μl)。8℃水浴16小时后，70℃孵育30分钟。
用限制酶XhoI消化1.5小时。通过琼脂糖凝胶CL-2B柱，除去小于400碱基的核苷酸。
(2)cDNA与ZAP噬菌体载体的连接100ng cDNA，10×连接酶缓冲液0.5μl，10mmol/L γ-ATP 0.5μl(pH7.5)，ZAP表达载体1.0μl(1μg/μl)，T4 DNA连接酶0.5μl(4u/μl)，加去离子水至总体积5μl。12℃连接16小时。
(3)连接反应物的体外包装从-70℃快速取出包装蛋白，冰上溶解后，在25μl的包装蛋白内加1μl连接反应物，混匀，22℃包装2小时.加入500μl SM缓冲液(0.1M Nacl，0.08M MgSO4.7H2O，O.05M Tris-HCl，0.01％明胶)和20μl氯仿。此混合物即为原始的cDNA文库，包装后的重组噬菌体产生转染活性。
4.cDNA文库的效价取5μl原始的cDNA文库，用45μl SM缓冲液稀释。将10μl稀释液加入200μl感受态XL1-Blue MRF′宿主菌(OD600＝0.5)。37℃水浴20-30分钟，加入3ml上层琼脂糖，混匀后铺于NZY平板(0.09M NaCl，0.08M MgSO4，0.5％酵母提取液，1％NZ胺A)，凝固后倒置，37℃培养过夜，计数平板上的克隆。
以噬菌斑成斑单位(pfu/ml)表示cDNA文库的效价。pfu/ml＝噬菌斑数×稀释倍数×1,000/稀释液用量(μl)。本发明人构建的成人主动脉cDNA文库的库容量为2.4×106个独立重组克隆。
5.cDNA文库的扩增和保存原始的cDNA文库可直接用于筛选，但非野生型的噬菌体容易失活，不够稳定。因此进行一次扩增，以进行多次筛选。
取5×104个噬菌体转染XL1-Blue MRF′宿主菌，铺板，37℃孵育8-10小时。然后将8ml SM缓冲液加至150mm平皿，4℃轻摇过夜，收集上清，即得到扩增后的cDNA文库。加入7％的二甲基亚砜，于-70℃长期保存。
实施例2.新全长cDNA的克隆
1.随机克隆的PCR反应cDNA文库铺盘，噬菌斑密度为200-500个克隆/培养皿(150mm)。挑取清亮的单个噬菌斑，转入含有75μl SM缓冲液和5μl氯仿的离心管中，混匀，4℃离心，取5μl上清用于PCR扩增。
ZAP载体3′端引物5′-CCAAGCTCGAAATTAACCCTCAC-3′ZAP载体5′端引物5′-CAGTCAATTGTAATACGACTCACT-3′反应总体积50μl。扩增参数为94℃，3分钟；94℃，45秒，55℃，30秒，72℃，3分钟，30个循环；72℃，延伸5-10分钟。
2.表达序列标签的测定使用PE公司的ABI 377自动测序仪(ABI PRISMTM377 DNA sequencer)和测序试剂盒(BigDyeTMTerminator Ready Reaction Mix)，测定每个cDNA克隆的表达序列标签(EST)。操作步骤参见试剂盒说明。
用BIAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将EST与GenBank/EMBL/DDBJ数据库(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)进行同源性比较。根据BLAST的结果，碱基同源序列小于100-200个碱基，Score值小于100的EST是新的表达序列标签。
3.EST引物步移法测序(1)ZAP噬菌体的体内环化ZAP噬菌体(ZAP Express cDNA Synthesis kit和ZAP Express cDNAGigapackTMGold Doning kit)能将目的DNA片段直接在体内从λ噬菌体载体转移到质粒，环化为带CMV病毒早期启动子的噬菌粒(PBK-CMV)。
用3μl含新EST的噬菌体和1μl辅助噬菌体共转染300μl大肠杆菌XL1-Blue MRF’株(OD600＝1.0)菌液，获取单链DNA后再转染大肠杆菌XLOLR株。加入5ml LB培养液，25μl卡那霉素，37℃摇床培养12-16小时。
(2)质粒的提取和鉴定使用QIAPrep Spin Miniprep kit(德国QIAGEN公司)，参照试剂盒推荐的步骤提取质粒DNA。
对质粒进行酶切鉴定，反应体系包括3μl 10×酶切缓冲液3，1μl NotI内切酶(15u/μl)，1μl EcoRI内切酶(15u/μl)，1μl BSA，2μl DNA，22μl去离子水，总体积30μl。混匀，37℃温育4-6小时。
(3)引物步移法测定carp全长cDNA使用ABI PRISMTM377 DNA测序仪和BigDyeTMTerminator ReadyReaction Mix试剂盒，测定阳性克隆的质粒DNA序列。
通过逐级引物引导的方法测定全长cDNA，即根据上轮测序反应获得的末端碱基序列确定下轮测序反应的引物。引物设计采用oligo 4.0软件。
本发明人从成人主动脉cDNA文库随机测定5000个ESTs，共获得182条新的全长cDNA。carp全长cDNA是其中之一。
4.carp的生物信息学分析carp基因全长2371bp，如SEQ ID NO.1所示。193bp-199bp为Kozak序列(ATCATGT)，2332bp-2337bp为加尾信号为AATAAA。196bp-1533bp为开放读码框架。carp基因定位于10号染色体10p13-10p14。
推断的carp蛋白由445个氨基酸组成。生物信息学分析表明蛋白分子量为49724.5Da，等电点为4.69。carp蛋白内没有信号肽和跨膜区，有5个蛋白激酶C磷酸化位点(69-71SEK，73-75SWR，157-159SFR，274-276SPK，438-440TDR)，12个络氨酸激酶II磷酸化位点(36-39SESE，41-44SALE，73-76SWRD，78-81SEEE，89-92TLCD，115-118TTEE，125-128SPAE，160-163SLPE，258-261TLME，326-329SLLE，339-342SDPE，375-378SGPE)，4个N-豆蔻酰化位点(20-25GLSDTI，48-53GGPCAV，176-181GNKFGV，387-392GLKQSN)，1个G蛋白耦联受体复合物1信号(136-152SSALAVEELGFERFHAL)。
实施例3.carp的原核表达1.PCR扩增目的片断正向引物5′-CGG GAC CGG GAT TAC C-3′反向引物5′-ATG TCT AGA TCA TAG AGC ACG AA-3′反应体系0.5μl carp测序质粒(模板)，正向引物和反向引物各2.0μl(25uM)，5.0μl dNTPs(2mM)，5.0μl 10×Taq酶缓冲液，2.0μl Taq DNA聚合酶(2u/μl)，加去离子水至总体积50.0μl。
反应参数94℃，2分钟；94℃×40秒，55℃×40秒，72℃×1分钟，30个循环；72℃延伸，10分钟。
反应产物用6倍体积醋酸铵/乙醇(1∶5)沉淀，75％乙醇洗涤，室温干燥，溶于10μl ddH2O，-20℃保存。
2.原核表达载体的构建(1)酶切pTrxFus载体(Invitrogen公司)20.0μl，限制性内切酶SmaI和XbaI(GIBCOBRL)各1.0μl，10×缓冲液4(GIBCOBRL)4.0μl，加去离子水至总体积40.0μl。37℃温育3小时。
carp PCR产物10.0μl，限制性内切酶SmaI和XbaI(GIBCOBRL)各1.0μl；10×缓冲液4(GIBCOBRL)2.0μl，加去离子水至总体积20.0μl。37℃温育3小时。酶切产物用240μl醋酸铵/乙醇(1∶5)纯化。
(2)连接、转化和筛选pTrxFus酶切产物1.0μl，PCR酶切产物3.0μl，T4DNA连接酶1.0μ1，连接缓冲液1.0μl，加去离子水至总体积10.0μl。16℃温育过夜。
用CaCl2法制备感受态GI724细胞，将连接产物转化入GI724细胞。
挑取阳性克隆，提取质粒，用SmaI和XbaI进行酶切鉴定，对阳性克隆进行序列测定。筛选出的重组质粒pTRX-carp50保存在15％甘油中，于-70℃存放。
3.重组蛋白的诱导表达(1)诱导取50μl含pTRX-carp50的菌液，接种于5ml RM-Amp培养基中，30℃，220-250rpm摇床过夜。取250μl过夜菌，接种入5ml IM诱导培养基中(1000ml TM培养基含有6g无水Na2HPO4，3g KH2PO4，0.5g NaCl，1g NH4Cl，2g酸水解酪素；0.095g MgCl2，1ml 100mg/ml氨卡青霉素，25ml 20％葡萄糖，pH7.0±0.2)，30℃，220-250rpm摇床培养3小时。
菌液OD550约0.5时，加色氨酸至终浓度为100ug/ml。37℃，220-250rpm继续培养4小时。4300g离心10分钟，收获菌体。
(2)超声释放融合蛋白用溶液II(20mM Tris-HCl，pH8，2.5mM EDTA)重悬菌体，OD550约100。以3×10秒脉冲，于冰上进行超声破碎。超声后立即将菌液置于液氮中速冻，再迅速置于37℃水浴中速溶，重复该步骤两次。4℃，4300g离心10分钟，收集上清，冷冻保存。上清中含有硫氧环蛋白和carp蛋白的融合表达产物。
3.聚丙烯酰氨凝胶电泳和蛋白质免疫印迹杂交按照《精编分子生物学实验指南》的方法进行聚丙烯酰氨凝胶电泳和蛋白质免疫印迹杂交。
(1)聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)取20μl融合蛋白溶液，加适量的载样缓冲液(5％浓缩胶和15％分离胶)，煮沸5分钟，5000rpm离心5分钟，取20μl上清上样。60V恒压进浓缩胶。120V恒压进分离胶。考马斯亮兰染色，随后脱色。
(2)蛋白质免疫印迹杂交(Western Blot)半干系统(Bio-Rad)转膜1小时。取下硝酸纤维素膜，置10ml封闭液(1×TBS，3％BSA)中作用1小时，用20ml TBST(1×TBS，05％Tween-20(w/v))洗膜。
将膜转移到1∶20,000稀释的一抗缓冲液(1×TBST，1％BSA)中浸润1-2小时，用20ml TBST洗膜。再将膜转移到10ml 1∶5000稀释的二抗缓冲液中浸润1小时，依次用20ml的TBST和TBS洗膜。
用20ml碱性磷酸酶缓冲液(100mM Tris-Cl，100mM NaCl，5mM MgCl2，pH9.5)洗膜。加10ml底物溶液(66μl氮蓝四唑，33μl BCIP，10ml碱性磷酸酶缓冲液)显色10-30分钟。用20ml高压水终止显色。
4.重组蛋白TRX-carp50表达条件的优化(1)活化时间对重组蛋白表达的影响TRX-carp50表达菌株于30℃，220-250rpm分别活化1、2、3、4、5和6小时，然后加色氨酸至终浓度为100ug/ml。37℃，220-250rpm诱导4小时，SDS-PAGE检测重组蛋白表达量的变化，活化6小时的菌株的蛋白表达量最高.
(2)诱导时间对重组蛋白表达的影响TRX-carp50表达菌株活化6小时，然后加色氨酸至终浓度为100ug/ml，37℃，220-250rpm分别诱导0、1、2、3、4、5和6小时，SDS-PAGE检测重组蛋白TRX-carp50表达量的变化，最佳诱导时间为6小时。
5.融合蛋白的纯化和浓缩(1)亲和层析纯化用20mM的β巯基乙醇(β-ME)平衡并填充树脂。
约2ml融合蛋白溶液上样，以2ml/12×75试管收集，每管取5μl稀释到500μl。用8ml的1mM β巯基乙醇洗柱。分别以6ml的5mM、10mM、50mM、100mM、200mM、500mM、1000mM β-ME洗脱。大多数目的蛋白在10-200mM的β-ME之间被洗脱。
(2)透析与浓缩以1×肠激酶缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，1mM CaCl2，0.1％Tween-20)为透析液，4℃，磁力搅拌透析。每4小时换液一次，换液4次。
用聚乙二醇(德国Merck公司)浓缩至约1ml，4℃保存。用Bradford法测定纯化的融合蛋白的浓度。
4.多克隆抗体的制备新西兰大耳白兔4只(2.5公斤/只)，饲养1周后，进行第一次免疫。免疫前取血清，将耳缘静脉切开，收集约10-15ml血，4℃放置过夜。3,000rpm离心15分钟，收集上血清，加NaN3至终浓度0.02％，-20℃冻存。
第一次免疫用约0.5-1.0ml融合蛋白(约300ug)加等体积的不完全弗氏佐剂，进行背部多点注射。每隔3周进行一次加强免疫。加强免疫时将不完全弗氏佐剂换为完全弗氏佐剂。每次加强免疫后，自白兔耳缘静脉取血少许，收集血清，ELISA测定抗体效价。
实施例4.carp的组织分布1.Northern杂交(1)探针标记以carp测序质粒为模板，PCR扩增得到约850bp的carp片段。纯化后稀释至25ng/μl，用作Northern杂交的探针。
在0.5ml离心管中加入carp片段(25ng/μl)l.0μl，5×标记缓冲液10.0μl，dNTPs(无dCTP)2.0μl，BSA 2.0μl，Klenow片断1.0μl，[α-32P]dCTP 5.0μl，加无离子水至总体积50.0μl。室温放置1-3小时，进行探针标记。
(2)杂交用6×SSC浸泡多组织膜和肿瘤细胞系尼龙膜(CLONTECHTM)5分钟。将9.3μg/μl鲑精DNA煮沸5分钟，置冰上约2分钟；向5ml 68℃预热的杂交液中加入50μl变性鲑精DNA，混匀，迅速加入杂交管，68℃预杂交1小时。
小心倒掉杂交液，加入5ml 68℃预热的杂交液，加入变性探针(98℃变性5分钟，冰上冷却约2分钟)，68℃杂交3小时。
(3)洗膜和压片杂交后取出尼龙膜，置200ml洗液I(2×SSC，0.05％SDS)中，水浴摇床，室温洗膜3次，每次10分钟。再用200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％ SDS)50℃洗膜20分钟，56℃洗膜20分钟。压片，-70℃曝光。冲洗X光胶片。
结果多组织膜杂交结果如图1所示，carp核酸序列在心脏、骨骼肌、肾脏和肝中的表达水平相对较高。
肿瘤细胞系杂交结果如图2所示，carp核酸序列在早幼粒白血病HL-60细胞系、宫颈癌细胞系S3株(Helas)、慢性粒细胞白血病K-562细胞系、淋巴母细胞性白血病MOL-4细胞系、Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞系、结肠腺SW480细胞系、肺癌A549细胞系和黑色素瘤G-361田胞系中均有表达。其中，以肺癌A549细胞系和Helas中表达最高。
2.RNA-RNA原位杂交选用DIG RNA标记试剂盒和DIG核酸检测试剂盒(德国Boehringermannheim公司).操作步骤依照试剂盒说明。
(1)探针的制备和标记设计特异性引物，扩增carp中约300bp DNA片段。
上游引物5’-TGA CGG GAC ATG CTG TTT CT-3，下游引物5’-TCT TCT GGG TCG TAG GTT TGA-3’将扩增产物克隆到T载体(Promega)。提取重组质粒，纯化，测序以确定基因片断的插入方向。按照试剂盒的说明，进行探针标记。
(2)标本制备对玻片进行清洁及消毒处理。0.01％的多聚赖氨酸(PLL)以1∶9的比例加入DEPC，混合均匀，将玻片浸入以进行包被。
新鲜标本0.4cm×0.4cm，用1×PBS冲洗。制备8um切片，置于有1mg/mlPLL的载玻片上，室温晾干。用4％多聚甲醛固定15-20分钟，1×PBS冲冼切片。
(3)杂交前处理为提高组织的通透性和核酸探针的穿透性，对切片进行以下处理。
用0.2N HCl浸泡25分钟，0.3％ TritonX-100浸泡5分钟。用1×PBS洗两次，每次5分钟。4％多聚甲醛后固定6分钟，用1×PBS洗两次。将5ml乙酸酐加入1000ml 0.1mol/L三乙醇胺溶液(pH8.0)，完全溶解后，浸入切片10分钟。以上反应在室温下进行。
(4)杂交反应将切片从乙酰化溶液中取出，干燥，加入预杂交液30μl，湿盒内42℃温育2小时。
甩去预杂交液，加入杂交液25μl(用去离子甲酰胺，20×SSC，100×Denhardt’s液，10％SDS，10mg/ml变性的鲱鱼精子DNA配制)。小心覆盖Parafilm膜，湿盒内42℃温育16小时。
(4)显色反应将玻片从温盒取出，去掉Parafilm膜，分别用2×SSC、1×SSC冲洗三次。使用Dig核酸检测试剂盒(Boehringer Mannheim)进行显色反应，操作参照试剂盒说明。
结果原位杂交结果见图3，(1)-(4)示carp在WKY大鼠肾脏、肝脏、脑和脾脏的表达分布情况，由图可见，carp在肾小管中高表达。(5)-(8)示大鼠肾脏、肝脏、脑和脾脏切片的HE染色结果，显示细胞形态。
实施例4.carp与心力衰竭1.免疫组织化学法制作正常人心脏组织和室壁瘤患者病理组织的石蜡切片。除另有说明以外，以下反应均在室温下进行。
每张切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗。滴加50μl过氧化酶阻断溶液，以阻断内源性过氧化物酶的活性，孵育10分钟，用PBS冲洗。
加50μl非免疫性动物血清，孵育5分钟，PBS冲洗。加50μl的一抗(多克隆兔抗血清)，孵育60分钟或4℃过夜，PBS冲洗。加50μl生物素标记的二抗，孵育10分钟，PBS冲洗。
加50μl链亲和素-过氧化物酶溶液，孵育10分钟，PBS冲洗。加100μl新鲜的DAB溶液，显微镜下观察3-10分钟。自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。
结果如图4所示，正常人心脏组织几乎无着色(见A)，患者室壁瘤组织着色最深(见C)，且着色在细胞核。由于室壁瘤是由于心肌梗塞后，坏死心肌组织心壁变薄失去收缩能力，在心肌收缩时构成无效缩区，从而导致心力衰竭。因此，在室壁瘤组织检测到carp的高水平表达，提示该蛋白与心力衰竭有关。
2.间接ELISA法检测心衰患者血清中carp自身抗体水平以10例心衰患者的血清作为检测样品，以健康志愿者的血清作为正常对照。健康志愿者的年龄、性别与心衰患者相匹配。
抗原多肽为人工合成de carp 72-83位的氨基酸序列S-S-W-R-D-C-S-E-E-E-Q-K，经HPLC纯化、鉴定。
用50mM的柠檬酸溶液(pH5.0)溶解抗原多肽，配成5mg/l抗原包被液，以50ul/孔包被，37℃，2小时。洗板2次，37℃封闭1小时。洗板2次，加入稀释的待测血清，37℃孵育1小时。洗板3次，羊抗人HRP-IgG 37℃孵育1小时。洗板3次，OPD显色，490nm读数。2M硫酸终止。
结果ELISA结果如图5所示，心衰患者血浆中的carp自身抗体水平明显比正常人高，n＝10，p＜0.001。
实施例5.carp真核表达载体的构建真核表达载体pcDNA3.1B(INVITROGEN)和pEGFPC2(CLONTECH)。重组质粒pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B-carp-MYC、pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE和pEGFPC2-carp的构建过程相似，除引物和酶切位点不同之外，其余步骤相同。以下pcDNA3.1B-carp的构建为例，说明重组载体的构建方法。
1.真核表达载体引物(1)pcDNA-carp正向引物5′-CCG GTT CTC GAG CAT GTC CGA ACT GAC TAA AGA-3′反向引物5′-TTA TGA ATT CTT AGA CAA ATT AAT TTA GTG AAG-3′(2)pcDNA-carp-MYC正向引物5′-CCG GTT CTC GAG CAT GTC CGA ACT GAC TAA AGA-3′反向引物5′-AGA CGA ATT CAT TTA GTG AAG GAG AGC GAT C-3′(3)pcDNA-carp-ANTISENSE正向引物5′-ATG TCT AGA TCA TAG AGC ACG AA 3′反向引物5′-CCG GTT CTC GAG CAT GTC CGA ACT GAC TAA ASA-3′(4)pEGFP-carp正向引物5′-CCG GTT CTC GAG CAT GTC CGA ACT GAC TAA AGA-3′反向引物5′-TTA TGA ATT CTT AGA CAA ATT AAT TTA GTG AAG-3′上述引物由上海生工生物公司合成，用聚丙烯酰氨凝胶电泳纯化，OD260＝5。用去离子水溶解引物，使其终浓度为25uM，-20℃保存。
2.目的片断的扩增反应体系0.5μl carp测序质粒(模板)，正向引物和反向引物各2.0μl(25uM)，5.0μl dNTPs(2mM)，5.0μl 10×Taq酶缓冲液，2.0μlTaq DNA聚合酶(2u/μl)，加去离子水至总体积50.0μl。
反应参数94℃，2分钟；94℃×40秒，55℃×40秒，72℃×1分钟，30个循环；72℃延伸，10分钟。
反应产物用6倍体积醋酸铵/乙醇(1∶5)沉淀，75％乙醇洗涤，室温干燥，溶于10μl ddH2O，-20℃保存。
3.酶切、连接和转化真核表达载体pcDNA3.1 B 20.0μl，EcoRI和XhoI(BioLabs)各1.0μl，10×缓冲液4.0μl，去离子水14.0μl，总体积40.0μl。37℃温育3小时。
PCR产物10.0μl，EcoRI和XhoI各1.0μl，10×缓冲液2.0μl，去离子水6.0μl。总体积20.0μl，37℃温育3小时。酶切产物经醋酸铵/乙醇纯化，溶于10μl去离子水。
酶切后的载体和目的片断以1∶3的比例，在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接过夜。将连接产物转化入CaCl2法制备的感受态DH5α细胞。
挑取阳性克隆，用XhoI和EcoRI酶切反应和PCR反应进行鉴定，测定阳性克隆的序列。筛选到真核表达重组质粒pcDNA3.1B-carp，保存于15％甘油中，-70℃存放。
实施例6.carp的亚细胞定位使用LIPOFECTAMINE2000(INVITROGEN公司)试剂盒提供的试剂和方法，将真核表达载体pEGFPC2-carp(实验)和pEGFPC2(对照)转染入HEK293S细胞。
将1μg质粒DNA稀释到50μl无血清、无抗生素的1640培养液中。将1μl LIPOFECTAMINE2000试剂稀释到50μl无血清、无抗生素的1640培养液中，室温放置5分钟。混合经稀释的质粒DNA和LIPOFECTAMINE2000试剂，混匀，室温放置20分钟。
将HEK293S细胞接种到96孔培养板，孵箱内培养18-24小时后，将培养液换为无血清、无抗生素的1640培养液，滴加100μl混合液，混匀。孵箱内培养24小时后，将培养液换为完全培养液(1640，10％FBS)。
转染48小时后，在荧光倒置显微镜下观察转染效率，在激光共聚焦显微镜下照相。
结果如图6所示，①-②为pEGFPC2转染HEK293S细胞的激光共聚焦照片，示绿色荧光蛋白的亚细胞定位-细胞浆；③-④为pEGFPC2-carp转染HEK293S细胞的激光共聚焦照片，示carp蛋白的亚细胞定位-细胞核。
实施例7.carp的抑制细胞增殖效应1.对肺癌A549细胞的抑制增殖效应(1)血球计数板法A.转染哺乳动物细胞使用LIPOFECTAMINE2000(Ivitrogen)，依照试剂盒说明书，将真核载体pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B-carp-MYC、pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE和pcDNA3.1B(对照)转染入HUVEC304细胞和肺癌A549细胞。
B.挑取阳性克隆显微镜下观察已形成克隆的细胞，标记各个克隆的位置。弃培养液，用0.9％NaCl清洗。将经过0.125％胰蛋白酶消化液浸润的滤纸片(3mm×3mm)置于标记的克隆处，5-20秒。取出已粘附克隆细胞的滤纸片，置于24孔培养板的培养孔中(每孔含1.0ml G418选择培养基)。涮洗滤纸片数次，使粘附的细胞脱下。将长有克隆细胞的培养板，置37℃，5％CO2培养箱培养2-5天。待细胞长满后，用0.125％的胰蛋白酶消化，将细胞转移至96孔培养板继续培养。然后，传代到培养瓶中培养，收获细胞，冻存。
C.细胞计数25cm2培养瓶培养细胞达70％-80％融合，弃细胞培养液，用5ml 0.9％NaCl清洗细胞，加入1.5ml 0.125％的胰蛋白酶消化液。倒置显微镜下观察至细胞刚刚变圆，吸出消化液，加入2ml完全培养液，用滴管吹匀细胞，用微量加样器将悬液加到血球计数板上，计4个大格内的细胞数。
用新鲜的完全培养液稀释细胞，至细胞悬液终浓度为1×104细胞/毫升。以2.0毫升/孔，将细胞悬液接种到96孔培养板，每种细胞接3-4孔。约16小时后，换新鲜培养液。此后每隔48小时换一次培养液。从接种细胞48小时后起，每天计细胞数一次，每次每种细胞计3-4孔。
结果如图7所示，A为pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B-carp-MYC和pcDNA3.1B转染的肺癌A549细胞的增殖曲线。由图可见，相对于pcDNA3.1B转染的肺癌A549细胞(对照)，pcDNA3.1B-carp和pcDNA3.1B-carp-MYC转染的肺癌A549细胞增殖明显较为缓慢。
B为pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE和pcDNA3.1B转染的肺癌A549细胞的增殖曲线。由图可见，相对于pcDNA3.1B转染的肺癌A549细胞(对照)，pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE转染的肺癌A549细胞的增殖明显加快。
(2)MTT法吸取1×104细胞/毫升的细胞悬液，以100μl/孔接种到96孔培养板。每48小时更换一次培养液。待生长最快的细胞达到90％-100％融合时，直接加入10μl MTT溶液(5mg/ml)，37℃放置4小时。每孔加100μl DMSO)，测定560nm处的光吸收值(OD)。
(3)酸性磷酸酶法吸取1×104细胞/毫升的细胞悬液，以100μl/孔接种到96孔培养板。每48小时更换一次培养液。弃细胞培养液，用0.9％NaCl洗涤细胞。弃洗液，加酸性磷酸酶底物100μl/孔。37℃放置约2小时，405nm测OD值。
(4)甲基-3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)法以4×104细胞/毫升/孔，将转染pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE和pcDNA3.1B(对照)的肺癌A549细胞接种至24孔培养板(含有10％FBS的1640培养基)。16小时后换为含有10％FBS的1640培养基。32小时后换为含有0.4％FBS的1640培养基。
饥饿44小时后，换为含有10％FBS、100uCi3H/ml的1640培养基，0.5ml/孔。4小时后，吸出培养基，加0.5ml 4℃预冷的三氯乙酸(TCA)，4℃固定细胞30分钟。弃TCA，加0.5ml 4℃预冷的0.9％NaCl，洗2次，加0.5ml 1％SDS，0.1N NaOH，37℃过夜。将过夜的裂解液收集到含有8.0ml闪烁液(800ml二甲苯，200ml TROTON X-100，4.5g PPO，0.45gPOPOP)的测量杯中。摇匀、测量。
结果如图8所示，pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE转染的肺癌A549细胞的DNA合成明显比pcDNA3.1B转染的A549细胞快。2.对肿瘤细胞系的抑制增殖效应用上述方法，将carp真核表达质粒分别转染入乳腺癌MCF-7细胞系、肝癌H7402细胞系、膀胱癌BIU87细胞系和黑色素瘤WM451细胞系。对细胞进行计数，观察carp对4种肿瘤细胞系的作用。
结果细胞计数结果如图9显示，carp能够抑制肝癌H7402细胞系、膀胱癌BIU87细胞系和黑色素瘤WM451细胞系的增殖。
实施例8.carp诱导的细胞凋亡效应将转染pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B的HEK293S细胞分别接种到25cm2的细胞培养瓶。0.125％胰蛋白酶消化细胞，0.9％NaCl洗涤细胞。加终浓度为10ug/ml的DMSO，37℃染色30分钟。离心，弃染液，滴片，荧光显微镜下观察并拍照。
结果如图10所示，①、⑥是转染pcDNA3.1B的HEK293S细胞，作为本实验的阴性对照；②-⑤和⑦-⑩是转染pcDNA3.1B-carp的HEK293S细胞，显示出不同程度的细胞凋亡(箭头指示为凋亡细胞)。
实施例9.carp诱导细胞周期改变复苏转染pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B和pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE的肺癌A549细胞株。按1∶8传代，在25cm2的培养瓶中培养。24小时后，换成不完全1640培养液(0.4％FBS)继续培养。24小时后，换成完全1640培养液(10％FBS)，继续培养48小时。弃培养液，加入2ml 0.l25％的胰蛋白酶消化细胞。
加入4ml 1×PBS液，吹打细胞使之成为单细胞悬液。1,500rpm离心5分钟，取约0.5ml上清液，振荡。加入2.5ml冰预冷的70％乙醇，4℃固定1小时。1,500rpm离心5分钟，弃固定液，加3ml 1×PBS液重悬5分钟。400目筛网过滤，1,000rpm离心5分钟，弃PBS。用PI染液于4℃避光染色30分钟，用流式细胞仪检测。
结果如图11A所示，转染pcDNA3.1B-carp的肺癌A549细胞主要处在G1期和S期；转染pcDNA3.1B的肺癌A549细胞(对照)在G1期、S期和G2期的分布比较平均；转染pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE的肺癌A549细胞主要处在S期和G2期。
3种细胞的G2/G1比较结果如图11B所示，转染pcDNA3.1B-carp的肺癌A549细胞DNA合成变慢，而转染pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE的肺癌A549细胞DNA合成变快。
SEQUENCE LISTING<110> 中国医学科学院阜外心血管病医院<120> 一种与心力衰竭相关的细胞凋亡调节蛋白<130> D0111012F<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 2371<212> DNA<213> 智人(Homo sapiens)<220><221> CDS<222> (196)..(1533)<400> 1aaaactcgct gctgccccaa cctggcttga caggcttggt ctctgcaagt ggctctcagc 60cccttcttct ttcctgcctc accttccaat tcgtttgccg ccgccgtccc gcagctgctg120tttccggagt tgccccttcc ccatgttccg gggcaggagt ccgcaaagcg aagatccgcc180cgccggttcc ccatc atg tcc gaa ctg act aaa gag ctg atg gag ctg gtg 231Met Ser Glu Leu Thr Lys Glu Leu Met Glu Leu Val1 5 10tgg ggc acc aag agc agc ccc ggt ctc tcg gac acc att ttc tgc cgc 279Trp Gly Thr Lys Ser Ser Pro Gly Leu Ser Asp Thr Ile Phe Cys Arg15 20 25tgg acg caa ggg ttt gtg ttt agt gaa tca gag gga tct gca tta gaa 327Trp Thr Gln Gly Phe Val Phe Ser Glu Ser Glu Gly Ser Ala Leu Glu30 35 40cag ttt gaa ggt ggc ccc tgt gct gtt att gca cct gtt cag gca ttt 375Gln Phe Glu Gly Gly Pro Cys Ala Val Ile Ala Pro Val Gln Ala Phe45 50 55 60ctt ttg aag aag ctc ctg ttt tct tcg gag aag tct tct tgg cgg gat 423Leu Leu Lys Lys Leu Leu Phe Ser Ser Glu Lys Ser Ser Trp Arg Asp65 70 75tgt tca gag gaa gag cag aag gaa ctc ctt tgt cat acc ttg tgt gat 471Cys Ser Glu Glu Glu Gln Lys Glu Leu Leu Cys His Thr Leu Cys Asp80 85 90att tta gaa agt gct tgt tgt gac cac tct gga tca tac tgc ttg gtt 519Ile Leu Glu Ser Ala Cys Cys Asp His Ser Gly Ser Tyr Cys Leu Val95 100 105tca tgg tta aga gga aag aca act gag gaa act gct agt att tct ggg 567Ser Trp Leu Arg Gly Lys Thr Thr Glu Glu Thr Ala Ser Ile Ser Gly110 115 120agt cct gca gag tct agt tgc caa gtg gaa cat tct tct gcc ttg gct 615Ser Pro Ala Glu Ser Ser Cys Gln Val Glu His Ser Ser Ala Leu Ala125 130 135 140gtc gaa gag ctt ggc ttt gag cga ttt cat gca tta att caa aaa aga 663Val Glu Glu Leu Gly Phe Glu Arg Phe His Ala Leu Ile Gln Lys Arg145 150 155tcg ttc aga agt tta cca gaa tta aaa gat gct gtc ttg gac cag tat 711Ser Phe Arg Ser Leu Pro Glu Leu Lys Asp Ala Val Leu Asp Gln Tyr160 165 170tca atg tgg gga aat aaa ttt gga gta ttg ctt ttt ctg tat tct gta 759Ser Met Trp Gly Asn Lys Phe Gly Val Leu Leu Phe Leu Tyr Ser Val175 180 185tta ctg aca aag ggc att gaa aac ata aaa aac gaa att gaa gat gca 807Leu Leu Thr Lys Gly Ile Glu Asn Ile Lys Asn Glu Ile Glu Asp Ala190 195 200agt gaa ccc ttg ata gat cct gta tat gga cat ggc agc caa agt tta 855Ser Glu Pro Leu Ile Asp Pro Val Tyr Gly His Gly Ser Gln Ser Leu205 210 215 220att aat ctc ctg ctg acg gga cat gct gtt tct aat gta tgg gat ggt 903Ile Asn Leu Leu Leu Thr Gly His Ala Val Ser Asn Val Trp Asp Gly225 230 235gat aga gag tgc tca gga atg aaa ctt ctt ggt ata cat gaa caa gca 951Asp Arg Glu Cys Ser Gly Met Lys Leu Leu Gly Ile His Glu Gln Ala240 245 250gca gta gga ttt tta aca cta atg gaa gct tta aga tac tgt aag gtt 999Ala Val Gly Phe Leu Thr Leu Met Glu Ala Leu Arg Tyr Cys Lys Val255 260 265ggt tct tac ttg aaa tct cca aaa ttc cct att tgg att gtt ggc agt 1047Gly Ser Tyr Leu Lys Ser Pro Lys Phe Pro Ile Trp Ile Val Gly Ser
270 275 280gag act cac ctc acc gta ttt ttt gcc aag gat atg gct tta gtt gcc 1095Glu Thr His Leu Thr Val Phe Phe Ala Lys Asp Met Ala Leu Val Ala285 290 295 300cct gaa gct cct tca gaa caa gcc aga aga gtt ttt caa acc tac gac 1143Pro Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Arg Arg Val Phe Gln Thr Tyr Asp305 310 315cca gaa gat aat gga ttc ata ccc gat tca ctt ctg gaa gat gtg atg 1191Pro Glu Asp Asn Gly Phe Ile Pro Asp Ser Leu Leu Glu Asp Val Met320 325 330aaa gca ttg gac ctt gtt tca gat cct gaa tat ata aat ctc atg aag 1239Lys Ala Leu Asp Leu Val Ser Asp Pro Glu Tyr Ile Asn Leu Met Lys335 340 345aat aaa tta gat cca gaa gga tta gga atc ata tta ttg ggc cca ttt 1287Asn Lys Leu Asp Pro Glu Gly Leu Gly Ile Ile Leu Leu Gly Pro Phe350 355 360ctt caa gaa ttt ttt cct gat cag ggc tcc agt ggt cca gaa tct ttt 1335Leu Gln Glu Phe Phe Pro Asp Gln Gly Ser Ser Gly Pro Glu Ser Phe365 370 375 380act gtc tac cac tac aat gga ttg aag cag tca aat tat aat gaa aag 1383Thr Val Tyr His Tyr Asn Gly Leu Lys Gln Ser Asn Tyr Asn Glu Lys385 390 395gtc atg tac gta gaa ggg act gca gtt gtg atg ggt ttt gaa gat ccc 1431Val Met Tyr Val Glu Gly Thr Ala Val Val Met Gly Phe Glu Asp Pro400 405 410atg cta cag aca gat gac act cct att aaa cgc tgt ctg caa acc aaa 1479Met Leu Gln Thr Asp Asp Thr Pro Ile Lys Arg Cys Leu Gln Thr Lys415 420 425tgg cca tac att gag tta ctc tgg acc aca gat cgc tct cct tca cta 1527Trp Pro Tyr Ile Glu Leu Leu Trp Thr Thr Asp Arg Ser Pro Ser Leu430 435 440aat taa tttgtctaag tatttataag gaagatctta ataacagatg ttgaaagaag 1583Asn445gagtcaagac tggcaattgg ctggattaag ctaaacactg gtatcactga ttaactgtaa 1643ataacaatta aaaacacatt ttcagtgttt atgatatgtt taaattattt gtcctaaagc 1703tttatgttaa agattatcct attttacccc ttcgtgtgaa atttactagc aaaattaagc 1763tttcatcaaa gttcatcact tttgcattca gatacttggt catttactta ccaaattaca 1823aacgcaatac tacagcattt gtatattaag tatcacagtt actattgata aactactttt 1883gggttttatt tcattgaggc acttttttta ttgtttgaat gattccggct tgtaatatat 1943cagcctctac aatgaaatgc agaagagttc atttttctaa gatctgtttt tcattagaaa 2003tattgacaaa taacacattg tcaacctgga tcctttgaca atttacttaa ctctggcatg 2063ttcacaaaaa gtagaaactt taagagacca ttaccattta ttcacagatg tataggggat 2123gtattctaaa aactgacaga aaagagaatc tgatagtcaa cactgttaac ttttactgtg 2183taattgccaa atacactttt ccaaatttgt cccaacagcc ctgtaagcca gctttcttgt 2243atatttataa acgcgataaa tgcatgagaa gatctgttat tccattagta tagtacgtta 2303tttattatga tcctagtgtg atggcctaaa taaacacctt tttctttaaa aaaaaaaaaa 2363aaaaaaaa2371<210> 2<211> 445<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 2Met Ser Glu Leu Thr Lys Glu Leu Met Glu Leu Val Trp Gly Thr Lys1 5 10 15Ser Ser Pro Gly Leu Ser Asp Thr Ile Phe Cys Arg Trp Thr Gln Gly20 25 30Phe Val Phe Ser Glu Ser Glu Gly Ser Ala Leu Glu Gln Phe Glu Gly35 40 45Gly Pro Cys Ala Val Ile Ala Pro Val Gln Ala Phe Leu Leu Lys Lys50 55 60Leu Leu Phe Ser Ser Glu Lys Ser Ser Trp Arg Asp Cys Ser Glu Glu65 70 75 80Glu Gln Lys Glu Leu Leu Cys His Thr Leu Cys Asp Ile Leu Glu Ser85 90 95Ala Cys Cys Asp His Ser Gly Ser Tyr Cys Leu Val Ser Trp Leu Arg100 105 110Gly Lys Thr Thr Glu Glu Thr Ala Ser Ile Ser Gly Ser Pro Ala Glu115 120 125Ser Ser Cys Gln Val Glu His Ser Ser Ala Leu Ala Val Glu Glu Leu130 135 140Gly Phe Glu Arg Phe His Ala Leu Ile Gln Lys Arg Ser Phe Arg Ser145 150 155 160Leu Pro Glu Leu Lys Asp Ala Val Leu Asp Gln Tyr Ser Met Trp Gly165 170 175Asn Lys Phe Gly Val Leu Leu Phe Leu Tyr Ser Val Leu Leu Thr Lys180 185 190Gly Ile Glu Asn Ile Lys Asn Glu Ile Glu Asp Ala Ser Glu Pro Leu195 200 205Ile Asp Pro Val Tyr Gly His Gly Ser Gln Ser Leu Ile Asn Leu Leu210 215 220Leu Thr Gly His Ala Val Ser Asn Val Trp Asp Gly Asp Arg Glu Cys225 230 235 240Ser Gly Met Lys Leu Leu Gly Ile His Glu Gln Ala Ala Val Gly Phe245 250 255Leu Thr Leu Met Glu Ala Leu Arg Tyr Cys Lys Val Gly Ser Tyr Leu
260 265 270Lys Ser Pro Lys Phe Pro Ile Trp Ile Val Gly Ser Glu Thr His Leu275 280 285Thr Val Phe Phe Ala Lys Asp Met Ala Leu Val Ala Pro Glu Ala Pro290 295 300Ser Glu Gln Ala Arg Arg Val Phe Gln Thr Tyr Asp Pro Glu Asp Asn305 310 315 320Gly Phe Ile Pro Asp Ser Leu Leu Glu Asp Val Met Lys Ala Leu Asp325 330 335Leu Val Ser Asp Pro Glu Tyr Ile Asn Leu Met Lys Asn Lys Leu Asp340 345 350Pro Glu Gly Leu Gly Ile Ile Leu Leu Gly Pro Phe Leu Gln Glu Phe355 360 365Phe Pro Asp Gln Gly Ser Ser Gly Pro Glu Ser Phe Thr Val Tyr His370 375 380Tyr Asn Gly Leu Lys Gln Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Val Met Tyr Val385 390 395 400Glu Gly Thr Ala Val Val Met Gly Phe Glu Asp Pro Met Leu Gln Thr405 410 415Asp Asp Thr Pro Ile Lys Arg Cys Leu Gln Thr Lys Trp Pro Tyr Ile420 425 430Glu Leu Leu Trp Thr Thr Asp Arg Ser Pro Ser Leu Asn435 440 44权利要求
1.一种具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白，其与心力衰竭相关，并具有抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。
2.一种检测心力衰竭的方法，包括检测来自宿主的样品中权利要求1的蛋白的表达。
3.权利要求2的方法，其中所述来自宿主的样品是室壁瘤组织。
4.一种药物组合物，其含有权利要求1的蛋白和必要时的药学上可接受的载体或赋形剂。
5.作为药物、特别是作为治疗肿瘤和细胞增殖相关性疾病之药物的权利要求1的蛋白。
6.权利要求1的蛋白在制备治疗肿瘤和细胞增殖相关性疾病的药物中的应用。
7.编码权利要求1的肽的多核苷酸。
8.含有权利要求7的多核苷酸的载体。
9.含有权利要求7的多核苷酸或权利要求8的载体的细胞。
10.作为药物的权利要求7的多核苷酸、权利要求8的载体或权利要求9的细胞。
11.一种治疗肿瘤和细胞增殖相关性疾病的药物组合物，其含有权利要求7的多核苷酸、权利要求8的载体或权利要求9的细胞。
12.一种治疗肿瘤和细胞增殖相关性疾病的方法，包括给予需此治疗的患者治疗有效数量的权利要求1的肽、权利要求7的多核苷酸、权利要求8的载体或权利要求9的细胞。
全文摘要
本发明涉及一种与心力衰竭相关的细胞凋亡调节蛋白，还涉及编码该蛋白的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体和细胞。本发明还公开了利用该蛋白和编码该蛋白的多核苷酸检测心力衰竭疾病的方法，以及利用本发明的蛋白、多核苷酸、载体或细胞，治疗肿瘤和与细胞增殖相关的疾病的方法和药物组合物。
文档编号C12N15/03GK1424324SQ0114036
公开日2003年6月18日 申请日期2001年12月11日 优先权日2001年12月11日
发明者惠汝太, 刘宝华, 刘玉清, 陈敬洲, 于晖, 徐平, 张禅娜 申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院