诱导细胞凋亡的多肽的制作方法

专利名称：诱导细胞凋亡的多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重建的多肽，其特性在于可诱导具有整合素相关蛋白质(Integrin Associated Protein，IAP)的有核血细胞凋亡，而不引起血细胞凝集反应。本发明尤其涉及重建的多肽，其包含单克隆抗体的二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区，该单克隆抗体可诱导具有IAP的有核血细胞凋亡。该重建的多肽可用作血液病，例如白血病的治疗剂。
背景技术：
日本专利申请9-67499公开了以脾基质细胞系作为致敏抗原的特异性单克隆抗体的制备，其目的在于开发可识别上述脾基质细胞的特异性抗体，并公开了将小鼠整合素相关蛋白质(小鼠IAP)作为抗原识别的新型单克隆抗体的制备。JP-Appl.9-67499还公开了这些单克隆抗体能够诱导骨髓细胞凋亡。
WO99/12973公开了其抗原是人整合素相关蛋白质(此处引用为人IAP；其氨基酸序列和核苷酸序列如J.Cell Biol.，123，485-496，1993；也参见Journal of cell Science，108，3419-3425，1995)的单克隆抗体，其能够诱导具有该人IAP的人有核血细胞(髓系细胞和淋巴系)凋亡。这些单克隆抗体记为抗体MABL-1和抗体MABL-2，产生这些抗体的杂交瘤也分别记为MABL-1(FERM BP-6100)和MABL-2(FERM BP-6101)。
日本专利申请11-63557描述了具有以人IAP为抗原的单克隆抗体的单链Fv区的单链Fvs的制备。该单链Fvs能够诱导具有人IAP的有核血细胞凋亡。
识别IAP作为抗原的单克隆抗体，可诱导具有人IAP的有核血细胞凋亡，但体外也引起血细胞凝集反应。表明给予大剂量识别IAP为抗原的单克隆抗体，可产生副作用，例如血细胞凝集反应。

发明内容
本发明的一个目的在于提供重建的多肽，它具有改进的特性，可诱导具有整合素相关蛋白质(IAP)的有核血细胞凋亡，以及降低或完全消除了其引起血细胞凝集反应的特性。本发明的另一个目的在于提供血液病的治疗剂，其包含上述获得的、可诱导具有整合素相关蛋白质的有核血细胞凋亡的物质。
因此，本发明涉及重建的多肽，其可结合整合素相关蛋白质(IAP)，诱导具有IAP的有核血细胞凋亡，而不引起血细胞凝集反应。
本发明还涉及重建的多肽、改型(reshaped)的抗体。
改型的抗体可以包括任何重建的多肽，其包含来源于单克隆抗体(例如抗体MABL-1、抗体MABL-2、或等等可诱导具有IAP，优选人IAP的有核血细胞凋亡的抗体)的L链V区和H链V区，该多肽可诱导具有IAP，优选人IAP的有核血细胞凋亡，而不引起血细胞凝集反应。此外，本发明也包括其中V区氨基酸序列部分改变的重建多肽。
本发明还涉及该重建多肽的人源化。人源化的重建多肽包含人源化的L链V区和/或人源化的H链V区。具体地，本发明的人源化多肽包括人源化的L链V区，其包含来源于人单克隆抗体L链V区的框架区(FR)以及来源于小鼠单克隆抗体L链V区的CDR和/或人源化的H链V区，其包含来源于人单克隆抗体H链V区的FR以及来源于小鼠单克隆抗体H链V区的CDR。在这种情况下，可部分改变FR或CDR的氨基酸序列，例如缺失、替换或增加。
此外，本发明涉及能够诱导具有人IAP的有核血细胞凋亡的重建多肽，该多肽包含人抗体的L链C区和小鼠单克隆抗体的L链V区，和/或人抗体的H链C区和小鼠单克隆抗体的H链V区。
本发明还涉及诱导具有人IAP的有核血细胞凋亡的重建多肽，该多肽包含对应于上述小鼠CDR、源于小鼠以外的其它哺乳动物，例如人、大鼠、牛、羊等的单克隆抗体的CDR，或者包含上述CDR的L链V区和H链V区。这些CDR、L链V区和H链V区可以包括源于例如由转基因鼠等制备的人单克隆抗体的CDR，以及源于包含上述CDR的人单克隆抗体的L链V区和H链V区。
本发明也涉及上述各种重建多肽的编码DNA，以及用于制备包含该DNA的重组载体的基因工程技术。
本发明还涉及用重组载体转化的宿主细胞。宿主细胞的例子包括哺乳动物细胞，例如人细胞、小鼠细胞等，以及微生物，例如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酵母等。
本发明涉及产生重建多肽的方法，包括培养上述宿主，并从其培养物中提取该重建多肽。
本发明另外涉及产生单链Fv二聚体的方法，包括在无血清培养基中培养可产生该单链Fv的哺乳动物宿主细胞，以分泌单链Fv到培养基中，并分离培养基中形成的单链Fv二聚体。
本发明涉及血液病的治疗剂，其中包含上述获得的重建多肽作为活性成份，该多肽可诱导具有整合素相关蛋白质(IAP)的有核血细胞凋亡。本发明的血液病的治疗剂，可用于治疗血液病，例如白血病，如急性髓细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性成淋巴细胞性白血病、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、混合型白血病和毛细胞白血病、恶性淋巴瘤(何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤)、再生障碍性贫血、骨髓发育不良综合症以及真性红细胞增多症。
本发明的重建多肽优选地包含源于单克隆抗体的2个H链V区和2个L链V区。该重建多肽的结构可以是包含1个H链V区和1个L链V区的单链Fv的二聚体，或者是包含2个H链V区和2个L链V区的多肽。在本发明的重建多肽中，H链V区和L链V区优选地通过包含一个或多个氨基酸的肽接头相连。产生的重建多肽包含亲本抗体的可变区，并保留其互补性决定区(CDR)，因此其结合抗原的特异性与亲本单克隆抗体相同。H链V区本发明源于单克隆抗体的H链V区，可以是诱导具有IAP的有核血细胞凋亡的单克隆抗体的H链V区，或其氨基酸序列部分改变的H链V区，优选的是识别人IAP并诱导具有IAP的有核血细胞凋亡的单克隆抗体的H链V区，或其氨基酸序列部分改变的H链V区。优选源于抗体MABL-1或抗体MABL-2的H链V区，或其氨基酸序列部分改变的H链V区。更优选是人源化的H链V区，其包含人单克隆抗体H链V区的FR，以及小鼠单克隆抗体H链V区的CDR。H链V区进一步可是源于人单克隆抗体、对应于上述小鼠单克隆抗体H链V区的区域，可以利用重组技术产生。本发明的H链V区可以是保留抗原结合能力的上述H链V区的片段。L链V区本发明的L链V区可以是诱导具有IAP的有核血细胞凋亡的单克隆抗体的L链V区，或其氨基酸序列部分改变的L链V区，优选的是识别人IAP并诱导具有IAP的有核血细胞凋亡的单克隆抗体的L链V区，或其氨基酸序列部分改变的L链V区。优选源于抗体MABL-1或抗体MABL-2的L链V区，或其氨基酸序列部分修饰的L链V区。更优选人源化的L链V区，其包含人单克隆抗体L链V区的FR，以及小鼠单克隆抗体L链V区的CDR。L链V区进一步可以是源于人单克隆抗体、对应于上述小鼠单克隆抗体L链V区的区域，可以利用重组技术产生。本发明的L链V区可以是保留抗原结合能力的上述L链V区的片段。互补性决定区(CDR)L链和H链的每个V区形成抗原结合位点。L和H链的可变区由相当保守的4个共同框架区组成，与3个高度可变区或互补性决定区(CDR)相连(Kabat，E.A.等人，“Sequences of Protein ofImmunological Interest”，US Dept.Health and Human Services，1983)。
4个框架区(FR)中的主要部分形成β-片层结构，3个CDR形成环。某些情况下，CDR可形成片层结构的一部分。3个CDR在空间位置上通过FR互相接近，连同3个CDR形成抗原结合结点。
根据Kabat，E.A.等人“Sequences of Protein of Immuno logicalInterest”中的经验规则，将获得的抗体V区氨基酸序列与已知抗体V区的已知氨基酸序列比较，来鉴定这些CDR。单链Fv单链Fv是多肽单体，包含互相连接的源于单克隆抗体的H链V区和L链V区。产生的单链Fv包含亲本单克隆抗体的可变区，并保留其互补性决定区，因此具有与亲本单克隆抗体相同的抗原结合特异性(JP-Appl.11-63557)。本发明单链Fv的可变区和/或CDR的一部分，或其氨基酸序列的一部分可以部分改变，例如缺失、替换或增加。前已述及构成本发明单链Fv的H链V区和L链V区，它们可以直接连接或通过接头相连，优选肽接头。单链Fv的构造可以是[H链V区]-[L链V区]，或者[L链V区]-[H链V区]。本发明中，单链Fv能形成二聚体、三聚体或可以是包括在本发明重建多肽中的四聚体。单链重建多肽本发明的包含两个或多个H链V区以及两个或多个L链V区的单链重建多肽，包含上述的两个或多个H链V区和L链V区。应当安排肽的每个区，使重建单链多肽形成特定的空间结构，精确地模拟由单链Fv二聚体形成的空间结构。例如，按下列顺序安排V区[H链V区]-[L链V区]-[H链V区]-[L链V区]；或者[L链V区]-[H链V区]-[L链V区]-[H链V区]，其中这些区域分别通过肽接头相连。接头本发明中，连接H链V区和L链V区之间的接头可以是能通过基因工程方法引入的任何肽接头，或者是化学合成的任何接头。例如，本发明可以使用文献中公开的接头，如Protein Egineering，9(3)，299-305，1996。肽接头的例子包括，例如SerGly-SerGly-Gly-Ser
Ser-Gly-GlyGly-Gly-Gly-SerSer-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-SerSer-Gly-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Gly-SerSer-Gly-Gly-Gly-Gly-GlyGly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-SerSer-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n以及(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n其中n是不小于1的整数。肽接头长度在1-15个氨基酸范围内，优选2-12个氨基酸，更优选3-10个氨基酸。在重建多肽编码DNA的说明部分或本发明中，描述了引入这些接头的方法。
根据本发明，化学合成的接头，即化学交联剂，可以是常规用于连接肽的任何接头。接头的例子包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯)(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(sulfo-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺基氧羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺基氧羰基氧基)乙基]砜(sulfo-BSOCOES)等。这些都是商品化的。
为形成单链Fv的二聚体，优选接头适于在溶液中，例如培养基中使宿主细胞产生的单链Fv二聚体化超过20％，优选地超过50％，更优选地超过80％，最优选地超过90％。特别地，优选接头由2-12个氨基酸组成，优选地3-10个氨基酸，或其它相应接头。重建多肽的制备通过用上述接头连接源于抗人IAP的单克隆抗体的H链V区和L链V区，可获得可与具有人IAP的细胞结合的重建多肽。单链Fv的例子有MABL1-scFv，其包含源于抗体MABL-1的H链V区和L链V区，以及MABL2-scFv，其包含源于抗体MABL-2的H链V区和L链V区。
为制备重建多肽，如果希望多肽是分泌肽，则可在多肽N端连接信号肽。为有效纯化多肽，可以连接众所周知的用于多肽纯化的氨基酸序列，例如FLAG序列。用抗FLAG抗体可以有效地纯化该多肽。
为制备本发明重建多肽，必须获得重建多肽的编码DNA，即单链Fv的编码DNA或者重建多肽单体的编码DNA。这些DNA可由MABL1-scFv和/或MABL2-scFv的H链V区和L链V区的编码DNA获得。利用DNA为模板，以及对应其两末端的引物对，PCR扩增上述序列中目的氨基酸序列的编码DNA，也可以获得这些DNA。
当希望每个V区的氨基酸序列部分改变时，可使用本领域已知的PCR方法，获得其中一个或一些氨基酸改变的V区，即缺失、替换或增加。为制备对特定抗原具有充分活性的重建多肽，优选地利用本领域已知的PCR方法，改变V区中的部分氨基酸序列。
为确定PCR扩增的引物，必须决定抗体MABL-1和/或抗体MABL-2的H链和L链的类型。然而已有报道，抗体MABL-1为K型L链和Y1型H链，抗体MABL-2为K型L链和Y2a型H链(JP-Appl.11-63557)。为PCR扩增抗体MABL-1和/或抗体MABL-2的H链和L链的编码DNA，可以使用Jones，S.T.等人，Bio/Technology，9，88-89，1991所述引物。
为使用聚合酶链反应(PCR)方法扩增抗体MABL-1和抗体MABL-2的L链V区，按上述方法确定5’端和3’端的寡核苷酸引物。以同样方法确定扩增抗体MABL-1和抗体MABL-2的H链V区所用的5’端和3’端寡核苷酸引物。
本发明的实施方案中，使用的5’端引物包含“GANTC”序列，以在邻近其5’端提供限制性酶Hinf I消化位点，3’端引物包含核苷酸序列“CCCGGG”，以在邻近其5’端提供XmaI消化位点。只要可用于将目的DNA片段亚克隆到克隆载体中，即可以使用这些位点以外的其它限制性酶消化位点。
使用特别设计的PCR引物，在抗体MABL-1和MABL-2的V区编码cDNA的5’端和3’端提供合适的核苷酸序列，从而使cDNA容易插入表达载体并在表达载体中行使适当的功能(例如，本发明设计通过插入Kozak序列提高转录效率)。利用这些引物进行PCR扩增，获得抗体MABL-1和MABL-2的V区，将其插入包含人目的C区的HEF表达载体(WO92/19759)。可利用任何常规方法对克隆的DNA测序，例如包括将DNA插入合适的载体，然后用自动DNA测序仪进行测序(AppliedBiosystems)。
可按下列方法，将一接头，例如肽接头引入本发明的重建多肽。设计具有上述H链V区和L链V区引物的部分互补序列，并编码接头的N端或C端的引物。然后，利用这些引物进行PCR，制备具有目的氨基酸序列及长度的肽接头的编码DNA。利用得到的DNA连接H链V区和L链V区的编码DNA，制备本发明具有目的肽接头的重建多肽的编码DNA。一旦制备了一个重建多肽的编码DNA，即通过设计接头的各种引物，利用引物以及上述DNA为模板进行PCR，可以很容易制备有或没有目的肽接头的重建多肽的编码DNA。
利用常规技术，能够对本发明重建多肽的每个V区进行人源化(例如，Sato K.等人，Cancer Res.，53，851-856(1993))。一旦制备了人源化Fv的编码DNA，可很容易按照常规方法，制备人源化单链Fv、人源化单链Fv的片段、人源化单克隆抗体以及人源化单克隆抗体的片段。优选地，如果需要，可以对其V区氨基酸序列进行部分改变。
此外，利用上述制备源于小鼠的H链V区和L链V区编码DNA的同样方法，可以制备源于其它哺乳动物的DNA，例如人的DNA。得到的DNA可用于制备其它哺乳动物特别是人的H链V区和L链V区、源于人的单链Fv及其片段、以及人源单克隆抗体及其片段。
如上所述，一旦制备了重建多肽的V区以及重建人源化多肽的V区的目的编码DNA，就可以按照常规方法获得包含它们的表达载体以及用载体转化的宿主。此外，可按照常规方法培养宿主，以制备重建单链Fv、重建人源化单链Fv、人源化单克隆抗体及其片段。可从细胞或培养基中分离它们，并纯化为均一物质。为此目的，如果需要，可以联合使用用于蛋白质分离和纯化的任何常规方法，例如，但不局限于，层析、超滤、盐析和透析。
当在无血清培养基中培养动物细胞，例如COS7细胞或CHO细胞，优选CHO细胞，制备本发明的重建单链Fv时，该重建的单链Fv可有效地在培养基中二聚体化。可以稳定并有效地分离上述形成的单链Fv二聚体，并以二聚体形式长期保存。本发明使用的无血清培养基，可以是常规用于制备重组蛋白质的任何培养基，但并不局限于此。
为制备本发明可与具有人IAP的细胞结合的重建多肽，可以利用任何表达系统，例如，真核细胞如动物细胞，例如建立的哺乳动物细胞系、丝状真菌和酵母，以及原核细胞如细菌细胞，例如E.coli。优选地，在哺乳动物细胞中表达本发明的重建多肽，例如COS7细胞或CHO细胞。
在这些情况下，可使用可用于哺乳动物细胞表达的常规启动子。优选使用人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期启动子。包含HCMV启动子的表达载体，包括HCMV-VH-HCY1、HCMV-VL-HCK以及源于pSV2neo的启动子等(WO92/19759)。
此外，本发明可使用的可用于哺乳动物细胞基团表达的其它启动子，包括来源于逆转录病毒、多形瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40)的病毒启动子，以及来源于哺乳动物的启动子，例如人多肽链延长因子1α(HEF-1α)。根据Mulligan R.C.等人的方法可容易使用SV40启动子(Nature 277，108-114(1979))，也可根据Mizushima S.等人方法使用HEF-1α启动子(Nucleic Acids Research，18，5322(1990))。
可用于本发明的复制起点(ori)，包括来源于SV40、多形瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的起点。为了在宿主细胞系统扩增基因拷贝数等目的，表达载体可包含磷酸转移酶APH(3’)II或I(neo)基因、胸苷激酶(TK)基因、E.coli黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因或二氢叶酸还原酶(DHFR)基因作为选择标志。
以小鼠抗体MABL-1和MABL-2对人IAP的结合-抑制能力为指标，可评价上述制备的重建多肽的抗原结合活性。具体地，以对小鼠抗体MABL-2与人IAP抗原的结合是否存在浓度依赖性抑制作用为指标，评价其活性。
更详细地，培养用本发明包含重建多肽编码DNA的表达载体转化的动物细胞，例如COS7细胞或CHO细胞。培养的细胞和/或培养上清、或从中纯化的重建多肽，用于测定与抗原的结合。只转化表达载体的细胞的培养上清，用作对照。将本发明重建多肽的测试样品或对照上清加入小鼠白血病L1210细胞系，L1210细胞表达人整合素相关蛋白质(IAP)，然后进行测定，例如流式细胞术，以评价抗原结合活性。
用以下方法评价体外的凋亡诱导效应将上述重建多肽的测试样品加入转有人IAP基因的细胞中，评价其诱导人IAP特异性细胞死亡的能力。
用以下方法评价体内的凋亡诱导效应制备人骨髓瘤的小鼠模型。对小鼠静脉内给予单克隆抗体或本发明的重建多肽，诱导具有IAP的有核血细胞凋亡。对照组小鼠只给予PBS。基于小鼠血清中人IgG含量及其存活时间的变化，根据抗肿瘤效应评价其凋亡诱导作用。
用以下方法测试血细胞凝集效应从健康供者血液制备红细胞悬液。悬液中加入不同浓度的测试样品，然后温育，以测定血细胞凝集反应。
本发明包含二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区的重建多肽，可以是包含一个H链V区和一个L链V区的单链Fv的二聚体、三聚体或四聚体，或者是其中有二个或多个H链V区和二个或多个L链V区相连的多肽。可以认为，由于这样的构造，使肽模拟亲本单克隆抗体抗原结合位点的三维结构，从而保持优良的抗原结合特性。
本发明多肽相比于所有IgG，对组织或肿瘤的灵活性强，而血细胞凝集反应的副作用显著降低或消失。因此，期望本发明的肽可用作血液病的治疗剂，例如白血病，如急性髓细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性成淋巴细胞性白血病、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、混合型白血病和毛细胞白血病、恶性淋巴瘤(何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤)、再生障碍性贫血、骨髓发育不良综合症以及真性红细胞增多症。还期望本发明的肽经过RI标记后可用作造影试剂。通过连接RI化合物或毒素，可增强肽的效果。本发明的最佳工作方式本发明将根据以下实施例具体阐明，但并不限制本发明的范围。
为阐明本发明重建多肽的制备方法，如下所示制备单链Fv的实施例。制备重建多肽的实施例中使用小鼠抗人IAP抗体，MABL-1和MABL-2。1997年9月11日，将产生这两个抗体的杂交瘤MABL-1和MABL-2，国际上分别以FERM BP-6100和FERM BP-6101存放于微生物保藏机构——国立生命科学和人体技术研究所，国际贸易和工业部(National Institute of BioScience and human Technology，Agencyof Industrial Science and Technology，Minister of InternationalTrade and Industry)(1-3 Higasi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，Japan)。实施例1(克隆小鼠抗人IAP单克隆抗体V区的编码DNA)如下克隆小鼠抗人IAP单克隆抗体MABL-1和MABL-2的可变区的编码DNA。1.1制备信使RNA(mRNA)利用mRNA Purification试剂盒(Pharmacia Biotech)获得杂交瘤MABL-1和MABL-2的mRNA。1.2合成双链cDNA利用Marathon cDNA Amplification试剂盒(CLONTECH)从1μgmRNA合成双链cDNA，并连上一个接头。1.3 PCR扩增抗体可变区的编码基团利用Thermal Cycle(PERKIN ELMER)进行PCR。(1)扩增MABL-1 L链V区编码基因用于PCR方法的引物是SEQ ID No.1所示Adapter引物-1，(CLONTECH)，它与接头的部分序列杂交，以及SEQ ID No.2所示MKC(鼠Kappa恒定)引物(Bio/Technology，9，88-89，1991)，它与小鼠Kappa型L链V区杂交。
50μl PCR溶液包含5μl 10×PCR缓冲液II、2mM MgCl2、0.16mMdNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)、2.5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(PERKIN ELMER)、0.2μM SEQ ID No.1接头引物、0.2μM SEQ ID No.2 MKC引物以及0.1μg来源于MABL-1的双链cDNA。溶液于起始温度94℃预热9分钟，然后依次94℃加热1分钟、60℃1分钟，72℃1分20秒。此温度循环重复35次，然后72℃再加热反应混合物10分钟。(2)扩增MABL-1 H链V区的编码cDNASEQ ID No.1所示Adapter引物-1以及SEQ ID No.3所示MHC-Y1(小鼠重链恒定)引物(Bio/Technology，9，88-89，1991)用作PCR引物。
按照实施例1.3-(1)所述L链V区基因的扩增方法进行cDNA扩增，只是使用0.2μM MHC-Y1引物，而非0.2μM MKC引物。(3)扩增MABL-2 L链V区的编码cDNASEQ ID No.1的Adapter引物-1以及SEQ ID No.2的MKC引物用作PCR引物。
按照实施例1.3-(1)所述MABL-1 L链V区基因的扩增方法进行cDNA扩增，只是使用0.1μg来源于MABL-2的双链cDNA，而非0.1μgMABL-1的双链cDNA。(4)扩增MABL-2 H链V区的编码cDNASEQ ID No.1的Adapter引物-1以及SEQ ID No.4所示MHC-Y2a引物(Bio/Technology，9，88-89，1991)用作PCR引物。
按照实施例1.3-(3)所述L链V区基因扩增方法进行cDNA扩增，只是使用0.2μM MHC-Y2a引物，而非0.2μM MKC引物。1.4纯化PCR产物利用QIAquick PCR Purification试剂盒(QIAGEN)纯化上述PCR扩增的DNA片段，并溶于含1mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH8.0)。1.5连接和转化上述制备的包含源于小鼠MABL-1 Kappa型L链V区编码基因的DNA片段约140ng，与50ng pGEM-T Easy载体(Promega)于15℃连接3小时，反应缓冲液包含30mM Tris-HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇、1mM ATP以及3单位T4 DNA连接酶(Promega)。
然后将1μl反应混合物加入50μlE.ColiDH5α感受态细胞中(Toyobo Inc.)，细胞于冰上保存30分钟，42℃温育1分钟，冰上再保存2分钟。加入100μl SOC培养基(GIBCO BRL)。将E.coli细胞接种在含100μg/ml氨苄青霉素(SIGMA)的LB琼脂培养基中(Molecular CloningA laboratory Manual，Sambrook等人，ColdSpring Harbor laboratory Press，1989)，37℃培养过夜，获得E.coli转化子。
转化子在3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，使用QIAprep Spin Minprep试剂盒(QIAGEN)从培养物中制备质粒DNA。
所得包含源于杂交瘤MABL-1的小鼠Kappa型L链V区的编码基因的质粒，命名为pGEM-M1L。
按照上述相同的方法，从纯化的DNA片段中制备质粒，其包含源于杂交瘤MABL-1的小鼠H链V区编码基因，命名为pGEM-M1H。
从纯化的DNA片段中制备质粒，其包含源于杂交瘤MABL-2的小鼠Kappa型L链V区编码基因，命名为pGEM-M2L。
从纯化的DNA片段中制备质粒，其包含源于杂交瘤MABL-2的小鼠H链V区编码基因，命名为pGEM-M2H。实施例2(DNA测序)利用Auto DNA Sequencer(Applied Biosystem)和ABI PRISM DyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒(AppliedBiosystem)，按照制造商规程，测定上述质粒中cDNA编码区的核苷酸序列。
质粒pGEM-M1L中包含小鼠抗体MABL-1的L链V区编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
质粒pGEM-M1H中包含小鼠抗体MABL-1的H链V区编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
质粒pGEM-M2L中包含小鼠抗体MABL-2的L链V区编码基因，其核者酸序列如SEQ ID No.7所示。
质粒pGEM-M2H中包含小鼠抗体MABL-2的H链V区编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。实施例3(确定CDR)L链与H链的V区通常结构相似，其每四个框架区通过三个高度可变区，即互补性决定区(CDR)相连。框架的氨基酸序列相对很保守，而CDR的氨基酸序列极其高度可变(Kabat E.A.等人，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，US Dept.Health and HumanServices，1983)。
基于这些事实，将小鼠抗人IAP单克隆抗体的可变区氨基酸序列，进入Kabat等人建立的抗体氨基酸序列数据库中，检索其同源性。表1所示为根据同源性确定的CDR区。
表1质粒 SEQ ID No.CDR (1)CDR(2)CDR(3)pGEM-M1L 5 43-58 74-80 113-121pGEM-M1H 6 50-54 69-85 118-125pGEM-M2L 7 43-58 74-80 113-121pGEM-M2H 8 50-54 69-85 118-125实施例4(鉴定克隆cDNA的表达、制备嵌合MABL-1抗体和嵌合MABL-2抗体)4.1制备表达嵌合MABL-1抗体的载体分别编码小鼠抗体MABL-1的L链与H链V区的cDNA克隆pGEM-M1L和pGEM-M1H，经过PCR方法改变后，引入HEF表达载体(WO92/19759)，制备嵌合MABL-1抗体的表达载体。
设计L链V区的正向引物MLS(SEQ ID No.9)和H链V区的正向引物MHS(SEQ ID No.10)，使之可与每个V区前导序列开始处的编码DNA杂交，并包含Kozak共有序列(J.Mol.Biol.，196，947-950，1987)以及HindIII限制性酶位点。设计L链V区反向引物MLAS(SEQID No.11)和H链V区反向引物MHAS(SEQ ID No.12)，使之可与J区末端编码DNA杂交，并包含剪接供体序列以及BamHI限制性酶位点。
将包含10μl 10×PCR缓冲液II、2mM MgCl2、0.16mM dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)、5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold、0.4uM每种引物和8ng模板DNA(pGEM-M1L或pGEM-M1H)的100μl PCR溶液，在起始温度94℃预热9分钟，然后依次94℃加热1分钟、60℃ 1分钟、72℃ 1分20秒。此温度循环重复35次，72℃再加热反应混合物10分钟。
用QIAquick PCR Purification试剂盒(QIAGEN)纯化PCR产物，然后用HindIII和BamHI消化。L链V区的产物克隆到HEF表达载体HEF-K中，将H链V区的产物克隆到HEF表达载体HEF-γ中。DNA测序后，包含正确序列DNA片段的质粒，分别命名为HEF-M1L和HEF-M1H。4.2制备表达嵌合MABL-2抗体的载体按照如实施例4.1所述相同的方法，对cDNA进行改变和克隆，只是使用pGEM-M2L和pGEM-M2H为模板DNA，而非pGEM-MiL和pGEM-MiH。DNA测序后，含有正确序列DNA片段的质粒，分别命名为HEF-M2L和HEF-M2H。4.3转染COS7细胞在COS7细胸中测试上述表达载体，观察嵌合MABL-1和MABL-2抗体的瞬时表达。(1)转染嵌合MABL-1抗体的基因使用Gene Pulser装置(BioRad)，通过电穿孔将HEF-M1L和HEF-M1H载体共转化COS7细胞。小杯中加入每种DNA(10μg)和0.8ml含1×107细胞/ml的PBS。混合物用1.5KV脉冲、25μF电容处理。
室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞转到包含10％无γ-球蛋白的胎牛血清的DMFM培养基中(GIBCO BRL)。培养72小时后，收集上清，离心去除细胞碎片并回收。(2)转染嵌合MABL-2抗体的基因利用如实施例4.3-(1)所述相同方法，将嵌合MABL-2抗体的编码基因共转染COS7细胞，只是使用HEF-M2L和HEF-M2H载体，而非HEF-M1L和HEF-M1H载体。以同样方法回收上清。4.4流式细胞术利用上述COS7细胞培养上清进行流式细胞术分析，测量其抗原结合。将表达嵌合MABL-1抗体的COS7细胞或表达嵌合MABL-2抗体的COS7的细胞的培养上清或者作对照的人IgG抗体(SIGMA)，加入4×105表达人IAP的小鼠白血病细胞系L1210细胞中，冰浴。洗涤后，向其中加入FITC标记的抗人IgG抗体(Cappel)。温育并洗涤后，用FACScan装置(BECTON DICKINSON)测量其荧光强度。
由于嵌合MABL-1和MABL-2抗体特异性结合表达人IAP的L1210细胞，可以确认，这些嵌合抗体分别具有小鼠单克隆抗体MABL-1和MABL-2的正确V区结构(附图1-3)。实施例5(制备抗体MABL-1和抗体MABL-2的重建单链Fv(scFv))5.1制备抗体MABL-1的重建单链Fv如下制备抗体MABL-1的重建单链Fv。利用PCR方法分别扩增抗体MABL-1的H链V区和L链V区，以及接头，并连接在一起，以制备抗体MABL-1的重建单链Fv。制备方法如图4所示。利用六种引物(A-E)制备抗体MABL-1的单链Fv。引物A、C和E具有正义序列，引物B、D和F具有反义序列。
H链V区的正向引物VHS(引物A，SEQ ID No.13)设计为可与H链V区N端编码DNA杂交，并包含NcoI限制性酶识别位点。H链V区的反向引物VHAS(引物B，SEQ ID No.14)设计为可与H链V区C端编码DNA杂交，并与接头重叠。
接头的正向引物LS(引物C，SEQ ID No.15)设计为可与接头N端编码DNA杂交，并与H链V区C端编码DNA重叠。接头的反向引物LAS(引物D，SEQ ID No.16)设计为可与接头C端编码DNA杂交，并与L链V区N端编码DNA重叠。
L链V区的正向引物VLS(引物E，SEQ ID No.17)设计为可与接头C端编码DNA杂交，并与L链V区N端编码DNA重叠。L链V区的反向引物VLAS-FLAG(引物F，SEQ ID No.18)设计为可与L链V区C端编码DNA杂交，并具有FLAG肽编码序列(Hopp T.P.等人，Bio/Technology，6，1204-1210，1988)、两个终止密码子以及EcoRI限制性酶识别位点。
在第一个PCR步骤中，进行A-B、C-D、E-F三个反应，纯化其PCR产物。将第一步PCR获得的三种PCR产物按照其互补性进行组装。然后加入引物A和F，扩增抗体MABL-1的重建单链Fv的全长编码DNA(第二步PCR)。第一步PCR中分别用作模板的质粒包括，编码抗体MABL-1 H链V区的质粒pGEM-M1H(参见实施例2)，包含接头区编码DNA序列的质粒pSC-DP1(该接头区包含Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID No.19))(Huston J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5879-5883，1988)，以及编码抗体MABL-1 L链V区的质粒pGEM-M1L(参见实施例2)。
第一步PCR反应的50μl溶液包含5μl 10×PCR缓冲液II、2mMMgCl2、0.16mM dNTPs、2.5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(PERKINELMER)、0.4μM每种引物和5ng每种模板DNA。PCR溶液在起始温度94℃预热9分钟，然后依次94℃加热1分钟、65℃ 1分钟，72℃ 1分20秒。此温度循环重复35次，然后72℃再加热反应混合物7分钟。
利用QIApuick PCR Purification试剂盒(QIAGEN)纯化PCR产物A-B(371bp)、C-D(63bp)和E-F(384bp)，并在第二步PCR中组装。第二步PCR中，将包含1 20ng第一步PCR产物A-B、20ng PCR产物C-D和120ng PCR产物E-F、10μl 10×PCR缓冲液II、2mM MgCl2、0.16mM dNTPs、5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold(PERKIN ELMER)的98μl PCR溶液，在起始温度94℃预热8分钟，然后依次94℃加热2分钟、65℃ 2分钟、72℃2分钟。此温度循环重复2次，然后反应中分别加入每种引物A和F 0.4μM。混合物在起始温度94℃预热1分钟，然后依次94℃加热1分钟、65℃ 1分钟、72℃ 1分20秒。此温度循环重复35次，然后72℃再加热反应混合物7分钟。
纯化第二步PCR制备的843bp DNA片段，用NcoI和EcoRI消化。将得到的DNA片段克隆到pSCFVT7载体。表达载体pSCFVT7包含适于E.coli周质表达系统的pelB信号序列(Lei S.P.等人，J.Bacteriology，169，4379-4383，1987)。DNA测序后，将包含抗体MABL-1的重建单链Fv正确氨基酸序列的编码DNA片段的质粒，命名为“pscM1”(参见图5)。质粒pscM1中包含抗体MABL-1重建单链Fv的核苷酸序列和氨基酸序列，如SEQ ID No.20所示。
利用PCR方法改变pscM1载体，以制备在哺乳动物细胞中表达抗体MABL-1重建单链Fv的载体。将得到的DNA片段引入pCHO1表达载体。表达载体pCHO1是经过EcoRI和SmaI消化DHFR-ΔE-rvH-PM1-f(WO92/19759)，去除抗体基因，并连上EcoRI-NotI-BamHI衔接头(Takara Shuzo)而构建的。
设计SEQ ID No.21所示Sal-VHS引物，作为PCR正向引物，其可与H链V区N端的编码DNA杂交，并包含Sal I限制性酶识别位点。设计如SEQ ID No.22所示FRH1anti引物，作为PCR反向引物，其可与第一框架序列末端的编码DNA杂交。
将包含10μl 10×PCR缓冲液II、2mM MgCl2、0.16mM dNTPs、5单位DNA聚合酶AmpliTaq Gold、0.4μl每种引物以及8ng模板DNA(pscM1)的100μl PCR溶液，在起始温度95℃预热9分钟，然后依次95℃加热1分钟、60℃ 1分钟，72℃ 1分20秒。重复此温度循环35次，然后72℃再加热反应混合物7分钟。
利用QIAquick PCR Purification试剂盒(QIAGEN)纯化PCR产物，用SalI和MboII消化，获得抗体MABL-1的重建单链Fv的N端编码DNA片段。用MboII和EcoRI消化pscM1载体，获得抗体MABL-1的重建单链Fv C的端编码DNA片段。将该SalI-MboII DNA片段和MboII-EcoRI DNA片段克隆到pCHO1-IgS载体。DNA测序后，将包含目的DNA序列的质粒命名为“pCHOM1”(参见图6)。表达载体pCHO1-Igs包含适于哺乳动物细胞分泌表达系统的小鼠IgG1信号序列(Nature，322，323-327，1988)。质粒pCHOM1包含的抗体MABL-1重建单链Fv的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.23所示。5.2制备抗体MABL-2的重建单链Fv按照上述实施例5.1方法，制备抗体MABL-2的重建单链Fv。第一步PCR中利用编码MABL-2的H链V区的质粒pGEM-M2H(参见实施例2)，而非pGEM-M1H，以及编码MABL-2的L链V区的质粒pGEM-M2L(参见实施例2)，而非pGEM-M1L，从而获得质粒pscM2，其中包含的抗体MABL-2的单链Fv目的氨基酸序列的编码DNA片段。质粒pscM2中包含抗体MABL-2的重建单链Fv，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQID No.24所示。
利用PCR方法改变pscM2载体，制备载体pCHOM2，用于在哺乳动物细胞中表达，其中包含抗体MABL-2的重建单链Fv正确氨基酸序列的编码DNA片段。质粒pCHOM2中包含的抗体MABL-2的重建单链Fv，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.25所示。5.3转染COS7细胞在COS7细胞中测试pCHOM2载体，观察抗体MABL-2的重建单链Fv的瞬时表达。
利用Gene Pulser装置(BioRad)，通过电穿孔将pCHOM2转化COS7细胞。向小杯中加入DNA(10μg)以及0.8ml含1×107细胞/ml的PBS。用1.5KV脉冲、25μF，电容脉冲处理混合物。
室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞转到含有10％胎牛血清的IMDM培养基中(GIBCO BRL)。培养72小时后，收集上清，离心去除细胞碎片并回收。5.4在COS7细胞培养上清中检测抗体MABL-2的重建单链Fv在经pCHOM2载体转染的COS7细胞的培养上清中，通过Western印迹方法确认抗体MABL-2的单链Fv的存在。
将经pCHOM2载体转染的COS7细胞的培养上清，以及作对照的经pCHO1转染的COS7细胞培养上清，进行SDS电泳，并转到REINFORCEDNC膜上(Schleicher & Schuell)。用5％脱脂牛奶(Morinaga Nyu-gyo)封闭膜，用0.05％Tween20-PBS洗涤，与抗FLAG抗体混合(SIGMA)。膜在室温下温育、洗涤并混合碱性磷酸酶偶联的小鼠IgG抗体(Zymed)。室温下温育并洗涤后，加入底物液(Kirkegaard PerryLaboratories)显色(图7)。
只在引入pCHOM2载体的COS7细胞的培养上清中检测到FLAG肽特异性蛋白质，从而证明抗体MABL-2的重建单链Fv分泌到培养上清中。5.5流式细胞术利用上述COS7细胞培养上清，通过流式细胞术测定抗原结合。将表达抗体MABL-2的重建单链Fv的COS7细胞培养上清，或者作对照的经pCHO1载体转化的COS7细胞培养上清，加入2×105个表达人整合素相关蛋白质(IAP)的小鼠白血病细胞系L1210细胞中，或者加入作对照的pCOS1转化的L1210细胞系的细胞中。冰浴并洗涤后，加入小鼠抗FLAG抗体(SIGMA)。然后温育细胞并洗涤。之后向其中加入FITC标记的抗小鼠IgG抗体(BECTON DICKINSON)，温育细胞并再次洗涤。随后用FACScan装置(BECTON DICKINSON)测量荧光强度。
由于抗体MABL-2的单链Fv与表达人IAP的L1210细胞特异性结合，故可以确定抗体MABL-2的重建单链Fv与人整合素相关蛋白质(IAP)具有亲和力(参见图8-11)。5.6竞争性ELISA
根据对小鼠单克隆抗体结合抗原的抑制活性，测定抗体MABL-2的重建单链Fv的结合活性。
将抗FLAG抗体调整为1μg/ml，加入96孔板的每孔中，37℃温育2小时。洗涤后，用1％BSA-PBS封闭。室温下温育并洗涤后，将引入了分泌型人IAP抗原基因(SEQ ID No.26)的COS7细胞培养上清，用PBS稀释到两倍体积，加入每孔中。室温下温育并洗涤后，将50μl调整为100ng/ml的生物素化MABL-2抗体与50μl顺序稀释的表达抗体MABL-2的重建单链Fv的COS7细胞培养上清的混合物，加入每孔中。室温下温育并洗涤后，每孔中加入碱性磷酸酶偶联的链亲合素(Zymed)。室温下温育并洗涤后，加入底物液(SIGMA)，测量每孔中反应混合物在405nm处的吸光度。
结果表明，以引入pCHO1的COS7细胞培养上清作对照，相比之下，抗体MABL-2的重建单链Fv(MABL2-scFv)浓度依赖性地显著抑制小鼠抗体MABL-2与人IAP抗原的结合(图12)。因此提示，抗体MABL-2的重建单链Fv中，源于小鼠单克隆抗体MABL-2的每个V区的结构均正确。5.7体外凋亡诱导效应使用人IAP基因转染的L1210细胞、作对照的经pCOS1载体转染的L1210细胞以及CCRF-CEM细胞，通过Annexin-V染色(BoehningerMannheim)，检测抗体MABL-2的重建单链Fv的凋亡诱导作用。
在1×105上述每种细胞中，按50％终浓度加入表达抗体MABL-2的重建单链Fv的COS7细胞培养上清、或作对照的经pCHO1载体转染的COS7细胞培养上清，混合物培养24小时。然后进行Annexin-V染色，用FACScan装置(BECTON DICKINSON)测定荧光强度。
Annexin-V的染色结果分别如图13-18所示。左下区的点代表活细胞，右下区的点代表凋亡早期细胞，右上区的点代表凋亡晚期细胞。结果显示，抗体MABL-2的重建单链Fv(MABL2-scFv)诱导了特异性针对人IAP抗原的L1210细胞死亡(图13-16)，与对照相比，重建的单链Fv也显著诱导CCRF-CEM细胞死亡(图17-18)。5.8在CHO细胞中表达源于MABL-2的单链Fv用pCHOM2载体转染CHO细胞，建立恒定表达源于抗体MABL-2的单链Fv(多肽)的CHO细胞系。
使用Gene Dulser装置(BioRad)，通过电穿孔方法将pCHOM2载体转化CHO细胞。小杯中加入DNA(10μg)和0.7ml含CHO细胞(1×107细胞/ml)的PBS的混合物。用1.5KV、25μF电容脉冲处理混合物。室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞转到含10％胎牛血清的无核酸α-MEM培养基(GIBCO BRL)中培养。得到的克隆用SDS-PAGE确认目的蛋白质的表达，选择表达水平高的克隆，作为源于抗体MABL-2的单链Fv的生产细胞系。在含有10nM氨甲蝶呤(SIGMA)的无血清培养基CHO-S-SFM II(GIBCO BRL)中培养该细胞系。然后，收集培养上清，离心去除细胞碎片并回收。5.9纯化CHO细胞中产生的源于MABL-2的单链Fv将实施例5.8中获得的表达单链Fv的CHO细胞系的培养上清，利用人工透析柱(PAN130SF，ASAHI MEDICALS)多达浓缩20倍。浓缩液-20℃保存，并于纯化时融化。
利用三种层析方法，即Blue-sepharose、羟基磷灰石和凝胶过滤，从CHO细胞培养上清中纯化单链Fv。(1)Blue-sepharose柱层析用20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)稀释浓缩的上清10倍，离心去除不溶物(10000×转/分，30分钟)。用相同缓冲液平衡Blue-sepharose柱(20ml)，将上清上样。用相同缓冲液洗柱后，利用相同缓冲液中的NaCl逐步梯度0.1、0.2、0.3、0.5到高达1.0M，洗脱柱中吸附的蛋白质。用SDS-PAGE分析流过组分和每个洗脱组分。将确认含有单链Fv的组分(0.1-0.3M NaCl洗脱组分)混合在一起，利用Centri Prep-10(AMICON)浓缩高达大约20倍。(2)羟基磷灰石(1)中获得的浓缩液用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释10倍，上样羟基磷灰石柱(20ml，BIORAD)。用60ml 10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗柱。然后，用高达200mM的磷酸钠缓冲液的线性梯度，洗脱柱中吸附的蛋白质(参见图19)。用SDS-PAGE分析每个组分，确认在组分A和组分B中存在单链Fv。(3)凝胶过滤用CentriPrep-10分别浓缩(2)中组分A和B，并上样到用含0.15M NaCl的20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的TSKgel G3000SWG柱(21.5×600mm)。层析图如图20所示。经SDS-PAGE分析各组分，确认了两个主峰(AI和BI)是目的单链Fv。凝胶过滤分析中，组分A在36KDa表观分子量处洗脱，组分B在76kDa处洗脱。用15％SDS聚丙烯酰胺凝胶分析纯化的单链Fv(AI、BI)。在有或无还原剂存在下处理样品，按照Laemmli’s方法进行电泳。然后用考马斯亮蓝染色蛋白质。如图21所示，无论还原剂存在与否，AI和BI都呈现35kDa表观分子量处的单链。从上所述可以推断，AI是单链Fv的单体，BI是单链Fv非共价结合的二聚体。使用TSKgel G3000SW柱(7.5×60mm)通过凝胶过滤分析组分AI和BI，表明只在组分AI中检测到单体峰，只在组分BI中检测到二聚体峰(图22)。二聚体组分(组分BI)占总单链Fv的百分之四。二聚体组分中超过90％的二聚体可4℃稳定保存超过1个月。5.10构建在E.Coli细胞中表达源于抗体MABL-2的单链Fv的载体利用PCR方法改变pscM2载体，以制备在E.coli中有效表达抗体MABL-2的单链Fv的载体。将得到的DNA片段引入pSCFVT7表达载体。
设计如SEQ ID No.27所示Nde-VHSm02引物，作为PCR正向引物，其可与H链V区N端编码DNA杂交，并包含起始密码子和NdeI限制性酶识别位点。设计如SEQ ID No.28所示VLAS引物，作为PCR反向引物，其可与L链V区C端编码DNA杂交，并包含二个终止密码子和EcoRI限制性酶识别位点。为在E.coli中有效表达，在正向引物Nde-VHSm02中与H链V区N端编码DNA可杂交的部分中包含5个点突变。
将包含10μl 10×PCR缓冲液#1、1mM MgCl2、0.2mM dNTPs、5单位KOD DNA聚合酶(都来自TOYOBO)、1μM每种引物和100ng模板DNA(pscM2)的100μl PCR溶液，依次98℃加热15秒、65℃ 2秒以及74℃30秒。重复此温度循环25次。
利用QIAquick PCR Purification试剂盒(QIAGEN)纯化PCR产物，用NdeI和EcoRI消化，得到的DNA片段然后克隆到pSCFVT7载体，该载体中已用NdeI和EcoRI消化去除了pel B信号序列。经DNA测序后，将产生的包含带有目的DNA序列的DNA片段的质粒命名为“pscM2DEm02”(参见图23)。质粒pscM2DEm02中包含的源于抗体MABL-2的单链Fv，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.29所示。5.11在E.coli细胞中表达源于抗体MABL-2的单链Fv用pscM2DEm02载体转化E.coliBL21(DE3)pLysS(STRATAGENE)，得到表达源于抗体MABL-2的单链Fv的E.coli菌株。用SDS-PAGE检查得到的克隆中目的蛋白质的表达，选择表达水平高的克隆，作为源于抗体MABL-2的单链Fv的生产菌株。5.12纯化E.coli中产生的源于抗体MABL-2的单链Fv将转化获得的E.coli单克隆在3ml LB培养基中，28℃培养7小时，然后在70ml LB培养基中28℃培养过夜。将预培养物转移到7LLB培养基中，300转/分搅拌，用Jar发酵罐28℃培养。培养基吸光度达到O.D.＝1.5时，用1mM IPTG诱导细菌，然后培养3小时。
培养基离心(10000×g，10分钟)回收细菌沉淀物。向细菌中加入含5mM EDTA、0.1M NaCl和1％Triton x-100的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，超声波破碎细菌(输出量4，工作循环70％，1分钟×10次)。离心破碎细菌的悬浮液(12000g，10分钟)，以沉淀包涵体。将分离的包涵体与含5mM EDTA、0.1M NaCl和4％Triton x-100的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)混合，再次超声处理(输出量4，工作循环50％，30秒×2次)，离心(12000g，10分钟)分离目的蛋白质沉淀，去除上清中包含的蛋白质。
在含6M脲、5mM EDTA和0.1M NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中裂解含目的蛋白质的包涵体，上样到Sephacryl S-300凝胶过滤柱(5×90cm，Amersharm Pharmacia)，该柱用含4M脲、5mM EDTA、0.1M NaCl和10mM巯基乙醇的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡，流速为5ml/分钟，以去除相关的高分子量单链Fv。经SDS-PAGE分析得到的组分，用凝胶过滤所用缓冲液将高纯度的蛋白质组分稀释到O.D280＝0.25。然后用含5mM EDTA、0.1M NaCl、0.5M Arg、2mM还原型各胱苷肽以及0.2mM氧化型谷胱苷肽的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，透析该组分3次，以使蛋白质重折叠。进一步用含0.15MNaCl的20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)透析该组分三次，以更换缓冲液。
将透析产物上样到Superdex 200pg凝胶过滤柱(2.6×60cm，Amersharm Pharmacia)，该柱已用含0.15M NaCl的20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)平衡，以去除少量通过分子间S-S键交联的高分子量蛋白质。如图24所示，在宽峰(预期为高分子量聚集物)后洗脱出两个峰，即主峰和副峰。SDS-PAGE分析(参见图21)以及凝胶过滤分析这两个峰的洗脱位置，提示主峰是单链Fv单体，副峰是非共价结合的单链Fv二聚体。非共价结合的二聚体占总单链Fv的4％。5.13源于抗体MABL-2的单链Fv的体外凋亡诱导活性利用引入人IAP基因的L1210细胞(hIAP/L1210)，按照两种Annexin-V染色(Boehringer Mannheim)方法，检测CHO细胞和E.coli产生的源于抗体MABL-2的单链Fv(MABL2-scFv)的凋亡诱导作用。
第一种方法中，向5×104个hIAP/L1210细胞中加入样品抗体，终浓度为3μg/ml，培养24小时。分析样品抗体，即实施例5.9中获得的来自CHO细胞的MABL-2单链Fv的单体和二聚体，实施例5.12中从E.coli获得的MABL-2单链Fv的单体和二聚体，以及作对照的小鼠IgG抗体。培养后进行Annexin-V染色，用FACScan装置(BECTONDICKINSON)测量其荧光强度。
第二种方法中，向5×104个hIAP/L1210细胞中加入样本抗体，终浓度为3μg/ml，培养2小时，并与抗FLAG抗体(SIGMA)混合，终浓度为15μg/ml，再培养22小时。分析样本抗体，它们是从实施例5.9的CHO细胞获得的MABL-2单链Fv的单体，以及作对照的小鼠IgG抗体。培养后进行Annexin-V染色，使用FACScan装置测量其荧光强度。
Annexin-V染色分析的结果如图25-31所示。结果表明，CHO细胞和E.coli中产生的MABL-2单链Fv多肽的二聚体，与对照相比(图25)，可显著诱导细胞死亡(图26，27)，而针对CHO细胞和E.coli中产生的MABL-2单链Fv多肽的单体，则没有观察到凋亡诱导作用(图28，29)。当一起使用抗FLAG抗体时，与对照相比(图30)，CHO细胞中产生的源于MABL-2抗体的单链Fv多肽的单体显著诱导细胞死亡(图31)。5.14 scFv/CHO多肽的单体和二聚体对人骨髓瘤模型小鼠的抗肿瘤效应(1)定量测量小鼠血清中的人IgG利用以下ELISA方法测量小鼠血清中含有的、由人骨髓瘤细胞产生的人IgG(M蛋白质)。用0.1％碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)将山羊抗人IgG抗体(BIOSOURCE，Lot#7902)稀释到1μg/ml，向96孔板(Nunc)中每孔加入100μl，4℃温育过夜，使抗体固定化。封闭后，向每孔加入100μl逐步稀释的小鼠血清或作为标准的人IgG(CAPPEL，Lot#00915)，室温下温育2小时。洗涤后，加入100μl 5000倍稀释的碱性磷酸酶标记抗人IgG抗体(BIOSOURCE，Lot#6202)，室温下温育1小时。洗涤后加入底物液。温育后，使用MICROPLATE READER Model3550(BioRad)测量405nm处的吸光度。基于由人IgG标准品的吸光值得到的校准曲线，计算小鼠血清中人IgG的浓度。(2)制备给药用抗体在给药当天，用无菌过滤的PBS(-)将scFv/CHO多肽的单体和二聚体分别稀释到0.4mg/ml或0.25mg/ml，制备给药用样品。(3)制备人骨髓瘤的小鼠模型如下制备人骨髓瘤的小鼠模型。将在SCID小鼠(Japan Clare)体内传代的KPMM2细胞(JP-Appl.7-236475)悬浮于含10％胎牛血清(GIBCO-BRL)的RPMI1640培养基中(GIBCO-BRL)，调整为3×107细胞/ml。通过尾静脉将200μl KPMM2细胞悬液(6×106细胞/小鼠)移植给SCID小鼠(雄性，6周龄)，该SCID小鼠已于移植前一天皮下注射脱唾液酸GM1抗体(WAKO JUNYAKU，1瓶溶于5ml)。(4)抗体给药将(2)中制备的抗体样本，单体(250μl)和二聚体(400μl)通过尾静脉给药于(3)中制备的人骨髓瘤细胞模型小鼠。移植KPMM2细胞3天后开始给药，每天2次，进行3天。作为对照，同样通过尾静脉给药200μl无菌过滤的PBS(-)，一天2次，进行3天。每组包含7只小鼠。(5)用人骨髓瘤模型小鼠评价scFv/CHO多肽的单体和二聚体的抗肿瘤效应根据小鼠血清中人IgG(M蛋白质)浓度的变化以及小鼠的存活时间，用人骨髓瘤模型小鼠评价scFv/CHO多肽单体和二聚体的抗肿瘤效应。移植KPMM2细胞后24小时收集小鼠血清，利用上述(1)中的ELISA方法测定人IgG浓度的变化。PBS(-)给药组(对照)血清中人IgG(M蛋白质)含量提高到约8500μg/ml，而scFv/CHO二聚体给药组的人IgG含量明显较低，等于或少于对照组的十分之一。所以，此结果表明scFv/CHO二聚体强烈抑制KPMM2细胞生长(参见图32)。如图33所示，与PBS(-)给药组相比，在scFv/CHO二聚体给药组观察到的存活时间明显延长。
如上所述可以确认，scFv/CHO二聚体对于人骨髓瘤模型小鼠具有抗肿瘤效应。可以认为scFv/CHO二聚体，即本发明的重建多肽，其抗肿瘤效应是由于该重建多肽具有凋亡诱导作用。5.15血细胞凝集反应实验根据Tokyo Kagaku Dojin出版，日本生物化学会编辑的Zoku-Seikagaku Jikken Koza“Immuno-Biochemical Investigation”，进行血细胞凝集反应测试并确定血细胞凝集反应。
用经肝素处理的注射器取健康供者血液，用PBS(-)洗涤三次，然后用PBS(-)制备终浓度2％的红细胞悬液。测试样本包括，MABL-2抗体，CHO细胞产生的单链Fv多肽的单体和二聚体，E.coli产生的单链Fv多肽的单体和二聚体，以及小鼠IgG对照(ZYMED)。利用购自Falcon的园底96孔板研究血细胞凝集效应。每孔中加入50μl上述抗体样本，以及50μl 2％红细胞悬液，于孔中混合。37℃温育2小时后，将反应混合物4℃保存过夜，测定其血细胞凝集反应。对照为每孔50μl PBS(-)，按同样方法进行血细胞凝集反应测试。使用的小鼠IgG和抗体MABL-2的抗体终浓度为0.01、0.1、1.0、10.0或100.0μg/ml。使用的单链Fv终浓度为0.004、0.04、0.4、4.0、40.0或80.0μg/ml，只在E.coli产生的多肽二聚体情况下，另外使用160.0μg/ml。结果如表2所示。对于抗体MABL-2而言，在大于0.1μg/ml浓度下观察到血细胞凝集反应，而对单链Fv的单体和二聚体都没有观察到血细胞凝集反应。
表2血细胞凝集反应测试对照 0.010.1 110100 μg/mL1mIgG - - - -- -MABL-2- - + +++ +++ ++(完整)对照 0.004 0.040.4 4 40 80 μg/mL1scFv/CHO - - - -- --单体scFv/CHO- - - -- --二聚体对照 0.004 0.040.4 4 40 80160 μg/mL1scFv/E.coli - - - -- --单体scFv/E.coli - - - -- ---二聚体实施例6包含2个H链V区和2个L链V区的重建多肽sc(Fv)2，以及具有不同长度接头的抗体MABL-2scFv。6.1构建抗体MABL-2sc(Fv)2表达质粒利用下述PCR方法改造上述pCHOM2，其中包含源于上述MABL-2的scFv的编码DNA，将产生的DNA片段插入pCHOM2，以制备重建多肽[sc(Fv)2](其中包含源于抗体MABL-2的二个H链V区和二个L链V区)的表达质粒。
PCR所用引物包括，EF1引物(SEQ 2D No30)为正向引物，设计为可与EF1α编码DNA杂交，和反向引物(SEQ ID No19)，设计为可与L链V区C端编码DNA杂交，并包含接头区的编码DNA序列，以及包含SalI限制性酶识别位点的VLLAS引物(SEQ ID No31)。
100μl PCR溶液包含10μl 10x PCR缓冲液#1、1mM MgCl2、0.2mMdNTPs(dATP，dGIP，dCTP和dTTP)、5单位KOD DNA聚合酶(Toyobo，Inc.)、1μM每种引物以及100ng模板DNA(pCHOM2)。将该PCR溶液依次94℃加热30秒、50℃ 30秒以及74℃ 1分钟。重复此温度循环30次。
利用QIAquick PCR Purification试剂盒(QIAGEN)纯化PCR产物，并用SalI消化。将产生的DNA片段克隆到pBluescript KS+载体(Toyobo，Inc.)。DNA测序后，用SalI消化包含目的DNA序列的质粒，得到的DNA片段用快速DNA Ligation试剂盒(BOEHRINGERMANNHEIM)与经SalI消化的pCHOM2连接。DNA测序后，将包含目的DNA序列的质粒命名为“pCHOM2(Fv)2”(参见图34)。质粒pCHOM2(Fv)2中包含的抗体MABL-2 sc(Fv)2区，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ IDNo.32所示。6.2制备具有不同长度接头的抗体MABL-2 scFv的表达质粒。
利用源于MABL-2的H链和L链编码cDNA作模板，如下所述制备scFv，其中包含不同长度接头以及按[H链]-[L链](下文称“HL”)或[L链]-[H链](下文称“LH”)顺序设计的V区。
利用pCHOM2(Fv)2作模板，PCR方法构建HL型scFv。PCR步骤中，使用引物对CFHL-F1(SEQ ID No33)和CFHL-R2(SEQ ID No34)，或引物对CFHL-F2(SEQ ID No35)和CFHL-R1(SEQ ID No36)，和KOD聚合酶。进行PCR程序，温度循环为94℃30秒、60℃30秒和72℃ 1分钟，重复30次，以产生5′端含有前导序列的H链cDNA，或其3′端含有FLAG序列的L链cDNA。混合所产生的H链和L链cDNA，进行PCR，温度循环为依次94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分钟，重复5次，使用混合物为模板以及KOD聚合酶。向反应混合物中加入CFHL-F1和CFHL-R1引物，然后重复上述温度循环30次，进行PCR反应，以产生无接头的HL-0型cDNA。
为构建LH型scFv，利用pGEM-M2L和pGEM-M2H为模板，其中分别包含抗体MABL-2的L链V区和H链V区的编码cDNA，进行PCR反应(参见JP-Appl.11-63557)。使用引物对T7(SEQ ID No37)和CFLH-R2(SEQ ID No38)，或引物对CFLH-F2(SEQ ID No39)和CFLH-R1(SEQ ID No40)，以及KOD聚合酶(Toyobo Inc.)。温度循环为顺次94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分钟，重复30次，进行PCR反应，以产生5′端包含前导序列的L链cDNA，或其3′端包含FLAG序列的H链cDNA。混合所产生的L链和H链cDNA，以该混合物为模板，使用KOD聚合酶，温度循环包含依次94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分钟，重复5次，进行PCR。反应混合物中加入T7和CFLH-R1引物，上述温度循环重复30次进行反应。以反应产物为模板，利用引物对CFLH-F4(SEQ ID No41)和CFLH-R1，温度循环包含依次94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分钟，重复30次，进行PCR，以产生无接头的LH-0型cDNA。
产生的LH-0和HL-0型cDNA用EcoRI和BamHI限制性酶(TakaraShuzo)消化，将消化的cDNA用Ligation High(Toyobo Inc.)分别引入哺乳动物表达质粒INPEP4中。用每个质粒转化感受态E.coliJM109(Nippon Gene)，利用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(QUIAGEN)从转化的E.coli中分离目的质粒。从而制备质粒pCF2LH-0和pCF2HL-0。
为构建包含不同大小接头的HL型表达质粒，以pCF2HL-0为模板，使用的正义引物为CFHL-X3(SEQ ID No42)、CFHL-X4(SEQ ID No43)、CFHL-X5(SEQ ID No44)、CFHL-X6(SEQ ID No45)或CFHL-X7(SEQ IDNo46)，反义引物为与载体序列互补的BGH-1(SEQ ID No47)。使用KOD聚合酶进行PCR反应，温度循环包括依次94℃ 30秒、60℃ 30秒以及72℃ 1分钟，重复30次，用限制性酶XhoI和BamHI(TakaraShuzo)消化反应产物。消化的片段分别用Ligation High(Toyobo Inc.)引入pCF2HL-0的Xhol和BamHl位点之间。用每个质粒转化E.coliJM109感受态，利用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒从转化的E.coli中分离目的质粒。从而制备表达质粒pCF2HL-3、pCF2HL-4、pCF2HL-5、pCF2HL-6和pCF2HL-7。
为构建在COS7细胞中瞬时表达的表达质粒，用限制性酶EcoRI和BamHI(Takara Shuzo)消化质粒pCF2HL-0、pCF2HL-3、pCF2HL-4、pCF2HL-5、pCF2HL-6和pCF2HL-7，用琼脂糖凝胶电泳纯化产生的约800bp片段。利用Ligation High(Toyobo Inc.)分别将获得的片段引入表达质粒pCOS1的EcoRI和BamHI位点之间，用于在哺乳动物细胞中表达。用每个质粒转化E.coliDH5α感受态(Toyobo Inc.)，使用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒从转化的E.coli中分离目的质粒。从而制备表达质粒CF2HL-0/pCOS1、CF2HL-3/pCOS1、CF2HL-4/pCOS1、CF2HL-5/pCOS1、CF2HL-6/pCOS1和CF2HL-7/pCOS1。
作为这些质粒的典型实例，质粒CF2HL-0/pCOS1的构建如图35所示，该质粒中包含的MABL2-scFv<HL-0>的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.48所示。这些质粒中接头区的核苷酸序列和氨基酸序列也如图36所示。
为构建包含不同大小接头的LH型表达质粒，使用pCF2LH-0为模板，CFLH-X3(SEQ ID No49)、CFLH-X4(SEQ ID No50)、CFLH-X5(SEQID No51)、CFLH-X6(SEQ ID No52)或CFLH-X7(SEQ ID No53)为正义引物，与载体序列互补的BGH-1为反义引物。利用KOD聚合酶，温度循环包含依次94℃ 30秒、60℃ 30秒和72℃ 1分钟，重复30次，进行PCR反应，反应产物用限制性酶xhoI和BamHI消化。利用Ligation High分别将消化的片段引入pCF2LH-0的XhoI和BamHI位点之间。每个质粒转化E.coliDH5α感受态(Toyobo Inc.)，使用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒从转化的E.coli中分离目的质粒。从而制备表达质粒pCF2LH-3、pCF2LH-4、pCF2LH-5、pCF2LH-6和pCF2LH-7。
为构建COS7细胞瞬时表达质粒，质粒pCF2LH-0、pCF2LH-3、pCF2LH-4、pCF2LH-5、pCF2LH-6和pCF2LH-7用限制性酶EcoRI和BamHI(Takara Shuzo)消化，用琼脂糖凝胶电泳纯化产生的约800bp片段。利用Ligation High分别将获得的片段引入哺乳动物细胞表达质粒pCOS1的XhoI和BamHI位点之间。用每个质粒转化E.coliDH-5α感受态(Toyobo Inc.)，利用Qiagen Plasmid Maxi试剂盒从转化的E.coli中分离目的质粒。随后制备表达质粒CF2LH-0/pCOS1、CF2LH-3/pCOS1、CF2LH-4/pCOS1、CF2LH-5/pCOS1、CF2LH-6/pCOS1和CF2LH-7/pCOS1。
作为这些质粒的典型实例，如图37所示构建质粒CF2LH-0/pCOS1，该质粒中包含的MABL2-scFv<LH-0>的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.54所示。这些质粒中接头区的核苷酸序列和氨基酸序列也如图38所示。6.3在COS7细胞中表达scFv和sc(Fv)2(1)用含血清培养基制备培养上清在COS7细胞中(JCRB9127，Japan Health Sciences Foundation)瞬时表达HL型和LH型的scFv和sc(Fv)2。在CO2气体培养箱中，用含10％胎牛血清(HyClone)的DMEM培养基(GIBCO BRL)，37℃传代培养COS7细胞。使用Gene Pulser装置(BioRad)，通过电穿孔将实施例6.2制备的CF2HL-0、3～7/pCOS1或CF2LH-0、3～7/pCOS1，或pCHOM2(Fv)2转染COS7细胞。小杯中加入DNA(10μg)以及0.25ml含2×107细胞/ml、10％FBS和5mM BES(SIGMA)的DMEM培养基。维持10分钟后，用0.17kv、950μF电容脉冲处理混合物。室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞转到75cm3培养瓶的DMEM培养基(10％FBS)中。培养72小时后，收集培养上清，离心去除细胞碎片。培养上清用0.22um过滤器(FALCON)过滤，以获得培养上清(下文称“CM”)。(2)用无血清培养基制备培养上清将按与(1)相同方法转染的细胞转到75cm3培养瓶的DMEM培养基(10％FBS)中培养过夜。培养后，弃去上清，用PBS洗涤细胞，然后加入CHO-S-SFM II培养基(GIBCO BRL)。培养72小时后，收集培养上清，离心去除细胞碎片，用0.22um过滤器(FALCON)过滤以获得CM。6.4检测COS7 CM中的scFv和sc(Fv)2用Western印迹方法检测上述实施例6.3(2)中制备的COS7 CM中的各种MABL2-scFv和sc(Fv)2。
SDS-PAGE电泳分析每个COS7的CM，转到REINFORCED NC膜(Schleicher & Schuell)上。用5％脱脂牛奶(Morinaga Nyu-gyo)封闭膜，TBS洗涤。然后向其中加入抗FLAG抗体。膜在室温下温育并洗涤。加入过氧化物酶标记的小鼠IgG抗体(Jachson Immuno Research)。室温下温育并洗涤后，加入底物液(KirKegaard Perry Laboratories)显色(图39)。6.5流式细胞术使用实施例6.3(1)制备的COS7细胞培养上清，进行流式细胞术分析，将测定MABL2-scFv和sc(Fv)2与人整合素相关蛋白质(IAP)抗原的结合。将待测培养上清或作对照的COS7细胞培养上清，加入2×105个表达人IAP的小鼠白血病细胞L1210。冰浴并洗涤后，加入10μg/ml小鼠抗FALG抗体(SIGMA)，然后温育并洗涤细胞。然后加入FITC标记的抗小鼠IgG抗体(BECTON DICKINSON)，再次温育并洗涤细胞。利用FACScan装置(BECTON DICKINSON)测定荧光强度。流式细胞术结果显示，在细胞培养上清中，具有不同长度接头的MABL2-scFv和sc(Fv)2与人IAP的亲合力高(参见图40a和40b)。6.6体外凋亡诱导效应通过Annexin-V染色(Boehringer Mannheim)，利用转染人IAP基因的L1210细胞(hIAP/L1210)，检测实施例6.3(1)制备的COS7培养上清的凋亡诱导作用。
向5×104个hIAP/L1210细胞中加入用每个载体转染的COS7细胞培养上清，或作对照的COS7细胞培养上清，终浓度为10％，混合物培养24小时。然后进行Annexin-V/PI染色，利用FACScan装置(BEKTONDICHINSON)测定荧光强度。结果表明，COS7细胞CM中的scFv<HL3、4、6、7，LH3、4、6、7>以及sc(Fv)2显著诱导了hIAP/L1210细胞的死亡。这些结果如图41所示。6.7构建用于CHO细胞中表达scFv和sc(Fv)2的载体为从培养上清中分离、纯化MABL2-scFv和sc(Fv)2，如下构建用于CHO细胞中表达的载体。
使用Ligation High，将实施例6.2制备的pCF2HL-0、3～7以及pCF2LH-0、3～7的EcoRI-BamHI片段，引入CHO细胞表达载体pCHO1的EcoRI和BamHI位点之间。用其转化E.coliDH5α感受态。使用QIAGEN Plasmind Midi试剂盒(QIAGEN)从转化的E.coli中分离质粒，制备表达质粒pCHOM2HL-0、3～7以及pCHOM2LH-0、3～7。6.8制备表达MARL2-scFv<HL-00、3～7>、MARL2-scFv<LH-0、3～7>以及sc(Fv)2的CHO细胞，并制备其培养上清用实施例6.7构建的每个表达质粒pCHOM2HL-0、3～7和pCHOM2LH-0、3～7，以及pCHOM2(Fv)2载体，转化CHO细胞，以制备恒定表达每种重建多肽的CHO细胞。作为其典型实例，恒定表达MABL2-scFv<HL-5>或sc(Fv)2的CHO细胞，如下所示制备。
通过限制性酶PvuI消化，线性化表达质粒pCHOM2HL-5和pCHOM2(Fv)2，使用Gene Pulser装置(BioRad)通过电穿孔转染CHO细胞。向小杯中加入DNA(10μg)和0.75ml 1×107细胞/ml的PBS，用1.5KV、25μF电容脉冲处理。室温恢复10分钟后，将电穿孔细胞转到含10％胎牛血清的包含核酸的α-MEM培养基中(GIBCO BRL)培养。培养过夜后，弃去上清。用PBS洗涤细胞，加入含10％胎牛血清的无核酸α-MEM培养基(GIBCO BRL)。培养两周后，将细胞在含10nM(终浓度)氨甲蝶呤(SIGMA)的培养基中培养，然后是50nM和100nM的氨甲蝶呤。得到的细胞在CHO-S-SFM II无血清培养基(GIBCO BRL)中转瓶培养。收集培养上清，离心去除细胞碎片，用0.22μm孔径滤膜过滤，分别获得CM。
如上所述，获得了恒定表达MABL2-scFv<HL-0、-3、-4、-6、-7>和<LH-0、-3、-4、-5、-6、-7>的CHO细胞及其CM。6.9纯化MABL2-scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2利用下述两种纯化方法，从实施例6.8制备的CM中纯化MABL2-scFv<HL-5>以及sc(Fv)2。<纯化方法1>
利用位于多肽C端的FLAG序列，通过抗FLAG抗体亲和柱层析以及凝胶过滤纯化HL-5和sc(Fv)2。用抗FLAG M2亲和凝胶(SIGMA)制备柱子(7.9ml)，用含150mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(TBS，pH7.5)平衡，上样在6.8中得到的1升CM。用TBS洗柱后，通过0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH3.5)洗脱scFv。利用SDS-PAGE分析所得到的组分，确认洗脱了scFv。将scFv组分与终浓度可高达0.01％的Tween 20混合，并用Centricon-10(MILIPORE)浓缩。TSKgel G3000SWG柱(7.5×600mm)用含150mM NaCl和0.01％ Tween 20的20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)平衡后，将浓缩液上样。流速为0.4ml/分，通过280nm的吸光度检测scFv。在二聚体处洗脱的主要组分为HL-5，单体处洗脱sc(Fv)2。<纯化方法2>
使用离子交换层析、羟基磷灰石和凝胶过滤，三步纯化HL-5和sc(Fv)2。在离子交换层析中，纯化HL-5使用Q Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia)，纯化sc(Fv)2使用SP-sepharose Fast Flow柱。在第二步之中及之后，用相同程序处理HL-5和sc(Fv)2。HL-5的第一步HL-5的CM用含0.02％ Tween 20的20mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)稀释2倍，然后用1M Tris调pH到9.0。用含0.02％Tween 20的20mMTris-HCl缓冲液(pH8.5)平衡Q sepharose fast flow柱后，将溶液上样。通过含0.1-0.55M NaCl线性梯度的相同缓冲液，洗脱柱上结合的多肽。经SDS-PAGE监测洗脱组分，收集含HL-5的洗脱组分，上样到第二步的羟基磷灰石上。sc(Fv)2的第一步
sc(Fv)2的CM用含0.02％Tween 20的20mM乙酸盐缓冲液(pH5.5)稀释2倍，用1M乙酸调pH到5.5。用含0.02％Tween 20的20mM乙酸盐缓冲液(pH5.5)平衡SP-sepharose fast flow柱后，将溶液上样。通过含0～0.5M NaCl线性梯度的缓冲液洗脱柱上结合的多肽。经SDS-PAGE监测洗脱组分，收集包含sc(Fv)2的组分，上样到第二步的羟基磷灰石中。第二步HL-5和sc(Fv)2的羟基磷灰石层析羟基磷灰石柱(I型，BIORAD)用含0.02％ Tween 20的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)平衡后，分别上样第一步获得的HL-5和sc(Fv)2组分。用同一缓冲液洗柱后，利用直到0.5M线性梯度的磷酸盐缓冲液，洗脱柱上结合的多肽。经SDS-PAGE监测洗脱的组分，收集包含目的多肽的组分。第三步HL-5和sc(Fv)2的凝胶过滤用CentriPrep-10(MILIPORE)分别浓缩第二步获得的每一组分，并上样到用含0.02％ Tween 20和0.15M NaCl的20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)平衡的Superdex 200柱(2.6×60cm，Pharmacia)。在二聚体处洗脱到HL-5，sc(Fv)HL-5和sc(Fv)2分别在单体处作为主要峰被洗脱。
两种纯化方法均难以检测HL-5单体，已证实当单链Fv的接头包含大约5个氨基酸时，形成的单链Fv二聚体产量高。此外，HL-5和sc(Fv)2的二聚体能够在纯化后4℃稳定保存一个月。6.10评价纯化的scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2与抗原的结合活性利用纯化的MABL2-scFv<HL-5>二聚体和纯化的sc(Fv)2进行流式细胞术分析，以评价其与人整合素相关蛋白质(IAP)抗原的结合。将10μg/ml纯化的MABL2-scFv<HL-5>二聚体、纯化的sc(Fv)2、阳性对照抗体MABL-2或阴性对照小鼠IgG(Zymed)，加入2×105个表达人IAP的小鼠白血病L1210细胞(hIAP/L1210)，或经pCOS1转化的L1210细胞(pCOS1/L1210)作对照。冰浴并洗涤后，加入10μg/ml小鼠抗FLAG抗体(SIGMA)，然后温育并洗涤细胞。向其中加入FITC标记的抗小鼠IgG抗体(BECTION DICKINSON)，再次温育并洗涤细胞。然后利用FACScan装置(BECTON DICKINSON)测定荧光强度。
由于纯化的MABL2-scFv<HL-5>二聚体和纯化的sc(Fv)2特异性结合hIAP/L1210细胞，可以证实scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2对人IAP的亲和力高(参见图42)。6.11纯化的scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2在体外的凋亡诱导效应使用引入人IAP基因的L1210细胞(hIAP/L1210)以及人白血病细胞系CCRF-CEM细胞，通过Annexin-V染色(Boehringer Mannheim)，检测纯化的MABL2-scFv<HL-5>二聚体和纯化的sc(Fv)2的凋亡诱导效应。
将不同浓度的纯化的MABL2-scF<HL-5>二聚体、纯化的MABL2-sc(Fv)2、阳性对照抗体MABL-2或阴性对照小鼠IgG，加入5×104个hIAP/L1210细胞或1×105个CCRF-CEM细胞中。培养24小时后进行Annexin-V染色，使用FACScan装置(BECTON DICKLNSON)测定其荧光强度。结果，MABL2-scFv<HL-5>二聚体和MABL2-sc(Fv)2以浓度依赖方式显著诱导hIAP/L1210和CCRF-CEM细胞死亡(参见图43)。6.12纯化的scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2的血细胞凝集反应测试按照实施例5.15方法，使用不同浓度的纯化的scFv<HL-5>二聚体和纯化的sc(Fv)2，进行血细胞凝集反应测试。
用抗体MABL-2作为阳性对照，观察到血细胞凝集反应，而对单链抗体MABL2-sc(Fv)2和MABL2-scFv<HL-5>均未观察到血细胞凝集反应。此外，抗体MABL-2使用两种缓冲液进行血细胞凝集反应，没有实质差别。这些结果如表3所示。
表3血细胞凝集反应测试稀释剂PBs (μg/ml)对照 28.9 14.45 7.225 3.6125 1.8063 0.9031 0.4516 0.2258 0.1129 0.0564 0.0282 0.0141 0.0071 0.0035 0.0018MABL2--- - - - - - - - - - - - - - -sc(Fv)2对照 28.0 14.0 7.03.5 1.750.875 0.4375 0.2188 0.1094 0.0547 0.0273 0.0137 0.0068 0.0034 0.0017MABL2--- - - - - - - - - - - - - - -sc(Fv)<HL5>
对照 80 40 2010 5 2.5 1.250.625 0.3125 0.1563 0.0781 0.0391 0.0195 0.0098 0.0049MABL2 -+ + + + ++ + + + ± - - - - -(完整)mlgG -- - - - -- - - -- - - - - -稀释剂乙酸盐 (μg/ml)对照 80 40 2010 5 2.5 1.250.625 0.3125 0.1563 0.0781 0.0391 0.0195 0.0098 0.0049MABL2 -+ + + + ++ + + ++ + - - - -(完整)6.13纯化的scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2对人骨髓瘤模型小鼠的抗肿瘤效应测试实施例6.8和6.9制备和纯化的scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2的抗肿瘤效应。利用实施例5.1产生的人骨髓瘤小鼠模型，ELISA测定小鼠血清中人骨髓瘤细胞产生的M蛋白质的量，并检测小鼠的存活时间，进行测试。然后根据小鼠血清中M蛋白质的数量变化以及小鼠的存活时间，评价scFv<HL-5>二聚体和sc(Fv)2的抗肿瘤效应。
测试中使用0.01、0.1或1mg/ml的HL-5和sc(Fv)2，它们溶于包含150mM NaCl、0.02％ Tween和20mM乙酸盐缓冲液(pH6.0)的载体中，按0.1、1或10mg/kg剂量对小鼠给药。对照组小鼠只给予载体。分段移植人骨髓瘤细胞26天后，收集小鼠血清，按实施例5.14方法，ELISA测定血清中M蛋白质的数量。结果，给予HL-5二聚体和sc(Fv)2的两组小鼠的血清M蛋白质数量，均以剂量依赖性方式下降(参见图44)。此外，与给予载体的对照组相比，观察到给予HL-5(图45)和sc(Fv)2(图46)的两组，其存活时间均显著延长。这些结果表明，本发明的HL-5和sc(Fv)2具有极好的体内抗肿瘤效应。


图1表示流式细胞术结果，表明人IgG抗体不结合表达人IAP的L1210细胞(hIAP/L1210)。
图2表示流式细胞术结果，表明嵌合MABL-1抗体特异性结合表达人IAP的L1210细胞(hIAP/L1210)。
图3表示流式细胞术结果，表明嵌合MABL-2抗体特异性结合表达人IAP的L1210细胞(hIAP/L1210)。
图4图解根据本发明单链Fv的产生过程。
图5阐明表达质粒的结构，该质粒可用于在E.coli中表达本发明单链Fv的编码DNA。
图6阐明表达质粒的结构，该质粒可用于在哺乳动物细胞中表达本发明单链Fv的编码DNA。
图7显示实施例5.4中Western印迹的结果图。从左侧开始为，分子量标志(从上面显示97.4、66、45、31、21.5和14.5kDa)、引入pCHO1的COS7细胞培养上清、以及引入pCHOM2的COS7细胞培养上清。表明在引入pCHOM2的COS7细胞培养上清中包含抗体MABL-2的重建单链Fv(箭头)。
图8表示流式细胞术结果，表明作对照的pCHO1/COS7细胞培养上清中的抗体，不结合pCOS1/L1210对照细胞。
图9表示流式细胞术结果，表明MABL2-scFv/COS7细胞培养上清中的抗体，不结合pCOS1/L1210对照细胞。
图10表示流式细胞术结果，表明作对照的pCOS1/COS7细胞培养上清中的抗体不结合hIAP/L1210细胞。
图11表示流式细胞术结果，表明MABL2-scFv/COS7细胞培养上清中的抗体特异性结合hIAP/L1210细胞。
图12表示实施例5.6中竞争性ELISA结果，其中以对小鼠单克隆抗体MABL-2结合抗原的抑制作用为指征，与对照的pCHO1/COS7细胞培养上清比较，阐明本发明单链Fv(MABL2-scFv)的抗原结合活性。
图13表示实施例5.7中凋亡诱导效应的结果，表明作对照的pCOS1/COS7细胞培养上清中的抗体，不能诱导pCOS1/L1210对照细胞凋亡。
图14表示实施例5.7中凋亡诱导效应的结果，表明MABL2-scFv/COS7细胞培养上清中的抗体，不能诱导pCOS1/L1210对照细胞凋亡。
图15表示实施例5.7中凋亡诱导效应的结果，表明作对照的pCHO1/COS7细胞培养上清中的抗体，不能诱导hIAP/L1210细胞凋亡。
图16表示实施例5.7中凋亡诱导效应的结果，表明MABL2-scFv/COS7细胞培养上清中的抗体，特异性诱导hIAP/L1210细胞凋亡。
图17表示实施例5.7中凋亡诱导效应的结果，表明作对照的pCHO1/COS7细胞培养上清中的抗体，不能诱导CCRF-CEM细胞凋亡(终浓度50％)。
图18表示实施例5.7中凋亡诱导效应的结果，表明MABL2-scFv/COS7细胞培养上清中的抗体，特异性诱导CCRF-CEM细胞凋亡(终浓度50％)。
图19表示实施例5.9纯化CHO细胞产生的源于抗体MABL-2的单链Fv所得到的层析结果，表明用羟基磷灰石柱纯化来自Blue-sepharose柱的组分时，获得的主要峰，组分A和组分B。
图20表示实施例5.9-(2)获得的组分A和组分B的凝胶过滤纯化结果，表明组分A在表观分子量约36kD处、以及组分B在约76kD处洗脱的主要峰(分别为AI和BI)。
图21为实施例5.9纯化CHO细胞产生的源于抗体MABL-2的单链Fv所获得组分的SDS-PAGE分析，表明两个组分中都观察到分子量约35kD的单一条带。
图22表示凝胶过滤纯化CHO细胞产生的源于抗体MABL-2的单链Fv所获得组分AI和BI的分析结果，其中组分AI包含单体，组分BI包含二聚体。
图23阐明表达质粒的结构，其可用于在E.coli中表达本发明单链Fv的编码DNA。
图24表示实施例5.12凝胶过滤柱纯化E.coli产生的源于抗体MABL-2的单链Fv多肽粗产物的结果，其中每个峰分别表示E.coli产生的单链Fv的单体或二聚体。
图25表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明作对照的小鼠IgG抗体，不能诱导hIAP/L1210细胞凋亡(终浓度3μg/ml)。
图26表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明CHO细胞产生的MABL2-scFv二聚体，显著诱导hIAP/L1210细胞凋亡(终浓度3μg/ml)。
图27表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明E.coli产生的MABL2-scFv二聚体，显著诱导hIAP/L1210细胞凋亡(终浓度3μg/ml)。
图28表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明CHO细胞产生的MABL2-scFv单体对hIAP/L1210细胞的凋亡诱导，与对照处于相同水平(终浓度3μg/ml)。
图29表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明E.coli产生的MABL2-scFv单体对hIAP/L1210细胞的凋亡诱导，与对照处于相同水平(终浓度3μg/ml)。
图30表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明作对照的小鼠IgG抗体，即使加入抗FLAG抗体，也不能诱导hIAP/L1210细胞凋亡(终浓度3μg/ml)。
图31表示实施例5.13中凋亡诱导效应的结果，表明CHO细胞产生的MABL2-scFv单体，当加入抗FLAG抗体时，显著诱导hIAP/L1210细胞凋亡(终浓度3μg/ml)。
图32表示在人骨髓瘤细胞系KPMM2移植小鼠的血清中，人IgG的定量测量结果，显示小鼠中由人骨髓瘤细胞产生的人IgG数量。表明scFv/CHO二聚体显著抑制KPMM2细胞生长。
图33表示小鼠在移植肿瘤后的存活时间，表明scFv/CHO二聚体给药组存活时间显著延长。
图34阐明表达质粒的结构，其可表达包含源于抗体MABL-2的两个H链V区和两个L链V区的重建多肽[sc(Fv)2]。
图35阐明表达scFv(HL型)质粒的结构，其中V区通过没有肽接头的[H链]-[L链]方式连接。
图36阐明HL型多肽的结构以及肽接头的氨基酸序列。
图37阐明表达scFv(LH型)质粒的结构，其中V区通过没有肽接头的[L链]-[H链]方式连接。
图38阐明LH型多肽的结构以及肽接头的氨基酸序列。
图39表示实施例6.4 Western印迹的结果，表明表达了包含两个H链V区和两个L链V区的重建多肽sc(Fv)2、以及具有不同长度肽接头的MABL2-scFv。
图40a和40b表示实施例6.3(1)制备的COS7细胞培养上清的流式细胞术结果，表明MABL2-scFv和具有不同长度肽接头的sc(Fv)2对人IAP的亲和力高。
图41表示实施例6.6凋亡诱导效应的结果，表明scFv<HL3、4、6、7、LH3、4、6和7>以及sc(Fv)2，显著诱导hIAP/L1210细胞死亡。
图42表示实施例6.10抗原结合能力的评价结果，表明scFv<HL5>二聚体和sc(Fv)2对人IAP的亲和力高。
图43表示实施例6.11体外凋亡诱导效应的结果，表明scFv<HL5>二聚体和sc(Fv)2以浓度依赖方式诱导hIAP/L1210细胞和CCRF-CEM细胞凋亡。
图44表示在移植人骨髓瘤细胞的小鼠血清中，由人骨髓瘤细胞系KPMM2产生的M蛋白质的定量测量结果。表明scFv<HL5>二聚体和sc(Fv)2显著抑制KPMM2细胞生长。
图45表示肿瘤移植后小鼠的存活时间(天)，表明scFv<HL5>给药组的存活时间显著延长。
图46表示肿瘤移植后小鼠的存活时间(天)，表明sc(Fv)2给药组的存活时间显著延长。
工业应用本发明重建多肽所具有的特性为，可诱导具有整合素相关蛋白质(IAP)的有核血细胞凋亡，而不引起血细胞凝集反应，并可用作血液病的治疗剂，例如白血病，如急性髓细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、混合型白血病和毛细胞白血病、恶性淋巴瘤(何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤)、再生障碍性贫血、骨髓发育不良综合症以及真性红细胞增多症。
序列表序列表<110>CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA<120>能够诱导细胞凋亡的多肽<130>FOP-415<141>2001-3-12<150>US 09/523,095<151>2000-3-10<150>JP2000-115246<151>2000-04-17<150>JP2000-321822<151>2000-10-20<160>54<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>1ccatcctaat acgactcact atagggc 27<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>2ggatcccggg tggatggtgg gaagatg 27<210>3<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>3ggatcccggg ccagtggata gacagatg28<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>4ggatcccggg agtggataga ccgatg 26<210>5<211>394<212>DNA<213>Mus<220><221>CDS<222>(1)...(393)<223>pGEM-M1L.1～57；信号肽，58～394；成熟肽<400>5atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct 45Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro5 10 15gcg tcc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg 90Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu20 25 30cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt 135Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser35 40 45cag agc ctt cta cac agt aaa gga aac acc tat tta caa tgg tac 180Gln Ser Leu Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr50 55 60cta cag aag cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt 225Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val65 70 75tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga 270Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly80 85 90tca ggg aca gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag 315Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu95 100 105gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac 360Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr110 115 120acg tcc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa c394Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys125 130<210>6<211>409<212>DNA<213>Mus<220><221>CDS<222>(1)...(408)<223>pGEM-M1H.1～57；信号肽，58～409；成熟肽<400>6atg gaa tgg agc tgg ata ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca 45Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala5 10 15ggt gtc cac tcc 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110 115 120tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc 405Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser125 130 135tca g 409Ser<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>9cccaagcttc caccatgaag ttgcctgtta gg 32<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>10cccaagcttc caccatggaa tggagctgga ta 32<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>11cgcggatcca ctcacgtttt atttccagct tggt 34<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>12cgcggatcca ctcacctgag gagactgtga gagt 34<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>13catgccatgg cgcaggtccagctgcagcag 30<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>14accaccacct gaggagactg tgagagt 27<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>15gtctcctcag gtggtggtgg ttcgggt 27<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>16cacaacatcc gatccgccac cacccga 27<210>17<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>17ggcggatcgg atgttgtgat gacccaa 27<210>18<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>18ccggaattct cattatttat cgtcatcgtc tttgtagtct tttatttcca gcttggt 57<210>19<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>接头氨基酸序列和核苷酸序列<400>19ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg 45Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser5 10 15<210>20<211>828<212>DNA<213>Mus<220><221>CDS<222>(1)...(826)<223>pscM1.MABL1-scFv<400>20atg aaa tac cta ttg cct acg gca gcc gct gga ttg tta tta ctc 45Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu5 10 15gct gcc caa cca gcc atg gcg cag gtc cag ctg cag cag tct gga 90Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly20 25 30cct gac ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag 135Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys35 40 45gct tct gga tac acc ttc gtt aac cat gtt atg cac tgg gtg aag 180Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Val Asn His Val Met His Trp Val Lys50 55 60cag aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct 225Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro65 70 75tac aat gat ggt act aag tac aat gag aag ttc aag ggc aag gcc 270Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala80 85 90aca ctg act tca gag aaa tcc tcc agc gca gcc tac atg gag ctc 315Thr Leu Thr Ser Glu Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Met Glu Leu95 100 105agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc tac tac tgt gca aga 360Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
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110 115 120tat agt tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc 405Tyr Ser Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser125 130 135tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga 450Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly140 145 150tcg gat gtt gtg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc agt 495Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser155 160 165ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc ctt 540Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu170 175 180cta cac agt aaa gga aac acc tat tta caa tgg tac cta cag aag 585Leu His Ser Lys Gly Asn Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys185 190 195cca ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga 630Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg200 205 210TTT TCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA 675Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr215 220 225gat ttc aca ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga 720Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly230 235 240gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg tcc gga 765Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Ser Gly245 250 255ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac gat gac gat 810Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp260 265 270aaa taa tga 819Lys<210>24<211>828<212>DNA<213>Mus<220><221>CDS<222>(1)...(822)<223>pscM2.MABL2-scFv<400>24atg aaa tac cta ttg cct acg gca gcc gct gga ttg tta tta ctc 45Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu5 10 15gct gcc caa cca gcc atg gcg cag gtc cag ctg cag cag tct gga 90Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly20 25 30cct gaa ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag 135Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys35 40 45gct tct gga tac acc ttc gct aac cat gtt att cac tgg gtg aag 180Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn His Val Ile His Trp Val Lys50 55 60cag aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct 225Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro65 70 75tac aat gat ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc 270Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala80 85 90act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc 315Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Asp Leu95 100 105agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt gca aga 360Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg110 115 120ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act ctc 405Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu125 130 135aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt 450Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly140 145 150ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg 495Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu155 160 165cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt 540Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser170 175 180cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac 585Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr185 190 195ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt 630Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
200 205 210tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga 675Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly215 220 225tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag 720Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu230 235 240gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac 765Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr245 250 255acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa gac tac aaa gac 810Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Tyr Lys Asp260 265 270gat gac gat aaa taa tga 828Asp Asp Asp Lys<2l0>25<211>819<212>DNA<213>Mus<220><221>CDS<222>(1)...(813)<223>pCHOM2.MABL2-scFv<400>25atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca 45Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr5 10 15ggt gtc gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg 90Gly Val Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu20 25 30gta aag cct ggg gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga 135Val 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Leu Thr80 85 90tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg 315Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu95 100 105gcc tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac 360Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr
110 115 120tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc 405Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser125 130 135tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga 450Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly140 145 150tcg gat gtt gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt 495Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser155 160 165ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt 540Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu170 175 180gtg cac agt aat gga aag acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag 585Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys185 190 195cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga 630Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg200 205 210ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca gtg aca 675Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr215 220 225gat ttc aca ctc atg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga 720Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly230 235 240gtt tat ttc tgc tct caa agt aca cat gtt ccg tac acg ttc gga 765Val Tyr phe Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly245 250 255ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt 810Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly260 265 270ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gtc gac tcc cag gtc cag ctg 855Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Asp Ser Gln Val Gln Leu275 280 285cag cag tct gga cct gaa ctg gta aag cct ggg gct tca gtg aag 900Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys290 295 300atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc gct aac cat gtt att 945Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn His Val Ile305 310 315cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga 990His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly320 325 330tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat gag aag ttc 1035Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe335 340 345aag gac aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc 1080Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala350 355 360tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc tat 1125Tyr Met Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr365 370 375tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg ggc caa 1170Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln380 385 390ggc acc act ctc aca gtc tcc tca ggt ggt ggt ggt tcg ggt ggt 1215Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly395 400 405ggt ggt tcg ggt ggt ggc gga tcg gat gtt gtg atg acc caa agt 1260Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser410 415 420cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct 1305Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser425 430 435tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac agt aat gga aag acc tat 1350Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr440 445 450tta cat tgg tac ctg cag aag cca ggc cag tct cca aaa ctc ctg 1395Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu455 460 465atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct ggg gtc cca gac agg ttc 1440Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe470 475 480agt ggc agt gga tca gtg aca gat ttc aca ctc atg atc agc aga 1485Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Met Ile Ser Arg485 490 495gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc tct caa agt aca 1530Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr500 505 510cat gtt ccg tac acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata aaa 1575His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys515 520 525gac tac aaa gac gat gac gat aaa taa tga 1605Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
530<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>33tgaggaattc ccaccatggg atg 33<210>34<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>34cacgacgtca ctcgagactg tgagagtggt gccttggccc 40<210>35<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>35agtctcgagt gacgtcgtga tgacccaaag tccactctcc 40<210>36<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>36gactggatcc tcattattta tcgtcatcgt c 31<210>37<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>37cgcgtaatac gactcactat ag 22<210>38<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>38gcaattggac ctgttttatc tcgagcttgg tcccccctcc gaacgt 46<210>39<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>39gctcgagata aaacaggtcc aattgcagca gtctggacct gaact 45<210>40<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>40gactggatcc tcattattta tcgtcatcgt ctttgtagtc tgaggagact gtgagagtgg 60<210>41<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>41gactgaattc ccaccatgaa gttgcctgtt ag 32<210>42<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>42cagtctcgag tggtggttcc gacgtcgtga tgacccaaag 40<210>43<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>43cagtctcgag tggtggtggt tccgacgtcg tgatgaccca aag 43<210>44<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>44cagtctcgag tggtggtggt ggttccgacg tcgtgatgac ccaaag 46<210>45<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>45cagtctcgag tggtggtggt ggtggttccg acgtcgtgat gacccaaag 49<210>46<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>46cagtctcgag tggtggtggt ggtggtggtt ccgacgtcgt gatgacccaa ag 52<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>47ggccgcatgt tgtcacgaat 20<210>48<211>780<212>DNA<213>Mus<220><221>CDS<222>(1)...(768)<223>CF2HL-0/pCOS1.MABL2-scFv<HL-0><400>48atg gga tgg agc tgt atc atc ctc ttc ttg gta gca aca gct aca ggt gtc 51MET Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val5 10 15gac tcc cag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gaa ctg gta aag cct ggg 102Asp Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly20 25 30gct tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac acc ttc gct aac cat 153Ala Ser Val Lys MET Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Asn His35 40 45 50gtt att cac tgg gtg aag cag aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga 204Val Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly55 60 65tat att tat cct tac aat gat ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac 255Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp70 75 80 85aag gcc act ctg act tca gac aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc 306Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr MET Asp Leu90 95 100agc agc ctg gcc tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt 357Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly105 110 115tac tat act tac gac gac tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcg agt 408Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser120 125 130 135gac gtc gtg atg acc caa agt cca ctc tcc ctg cct gtc agt ctt gga gat 459Asp Val Val MET Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp140 145 150caa gcc tcc atc tct tgc aga tca agt cag agc ctt gtg cac 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Val Ile His Trp Val Lys Gln155 160 165 170aag cca ggg cag ggc ctt gag tgg att gga tat att tat cct tac aat gat 561Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Asp
175 180 185ggt act aag tat aat gag aag ttc aag gac aag gcc act ctg act tca gac 612Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp190 195 200aaa tcc tcc acc aca gcc tac atg gac ctc agc agc ctg gcc tct gag gac 663Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr MET Asp Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp205 210 215 220tct gcg gtc tat tac tgt gca aga ggg ggt tac tat act tac gac gac tgg 714Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Tyr Asp Asp Trp225 230 235ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca gac tac aaa gac gat gac gat 765Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp240 245 250 255aaa taa tga gga tcc 780Lys
权利要求
1.重建的多肽，可结合整合素相关蛋白质(IAP)，诱导有核血细胞凋亡，而不引起血细胞凝集反应。
2.权利要求1的重建多肽，其中该重建多肽是改型抗体。
3.权利要求2的重建多肽，其中该改型抗体包含单克隆抗体的两个或多个H链V区以及两个或多个L链V区。
4.权利要求3的重建多肽，其中该重建多肽是包含H链V区和L链V区的单链Fv的二聚体。
5.权利要求1-4中任一项的重建多肽，其中该重建多肽是纯化的单链Fv的二聚体。
6.权利要求3的重建多肽，其中多肽是包含2个H链V区和2个L链V区的单链多肽。
7.权利要求5或6的重建多肽，其中的H链V区和L链V区通过包含至少一个氨基酸的接头相连。
8.权利要求4、5和7中任一项的单链Fv的编码DNA。
9.权利要求6或7的多肽的编码DNA。
10.权利要求1-3中任一项的重建多肽，其中H链V区和/或L链V区是人源化的。
11.权利要求10的多肽的编码DNA。
12.动物细胞，其可产生权利要求1、2、3、4、5、6、7和10中任一项的重建多肽。
13.微生物，其可产生权利要求1、2、3、4、5、6、7和10中任一项的重建多肽。
14.血液病的治疗剂，其包含权利要求1、2、3、4、5、6、7和10之中任何一项的重建多肽作为其活性成分。
15.权利要求14的治疗剂，其特征在于该血液病是白血病。
16.权利要求14的治疗剂，其特征在于该活性成分是权利要求4、5和7中任何一项的单链Fv。
全文摘要
本发明涉及重建的多肽，其特性在于可诱导具有整合素相关蛋白质(IAP)的有核血细胞凋亡，而不引起血细胞凝集反应。该重建多肽包含一种单克隆抗体的二个或多个H链V区以及二个或多个L链V区，该单克隆抗体可诱导具有IAP的有核血细胞凋亡。该重建多肽可用作血液病，例如白血病的治疗剂。
文档编号C12N15/12GK1422333SQ01807591
公开日2003年6月4日 申请日期2001年3月12日 优先权日2000年3月10日
发明者福岛直, 土屋政幸, 大枝匡义, 宇野慎介, 菊地康文 申请人:中外制药株式会社