编码植物脂酶的dna、转基因植物和控制植物衰老的方法

专利名称：编码植物脂酶的dna、转基因植物和控制植物衰老的方法
技术领域：
本发明涉及编码植物多肽且表现出衰老诱导的表达的多核苷酸、含有反义方向的所述多核苷酸的转基因植物和用于控制植物衰老的方法。更具体地讲，本发明涉及其表达由于衰老开始而被诱导的植物脂酶基因以及应用所述脂酶基因控制植物衰老。
现有技术的描述衰老是植物生命中生物发育的末期。它预示死亡，并且在包括全株、器官、花和果实、组织和单个细胞在内的各种水平生物结构上发生。
细胞膜退化是衰老的一个早期而基本的特征。脂质的代谢、特别是膜脂的代谢，是细胞衰老的几种生物化学表现之一。例如，随着衰老的发展，玫瑰花瓣的酰基水解酶活性持续增加，伴随有膜功能的丧失(Borochov等，Plant Physiol.，1982，69，296-299)。细胞膜退化是衰老的一个早期而特征性的特征，引起通透性增加、离子梯度丧失和关键的膜蛋白例如离子泵功能的降低(Brown等，Plant Physiol.A Treatise，Vol.X.Academic Press，1991，第227-275页)。这种膜结构完整性和功能完整性减退中的大部分可以归因于脂酶介导的磷脂代谢。已经证明在衰老中的花瓣、叶片、子叶和成熟中的果实中有磷酸脂质的丧失(Thompson，J.E.，Senescence and Aging in Plants，Academic Press，SanDiego，1988，第51-83页)，看来这引起膜双分子层分子组成的重大改变，并促进衰老，导致细胞功能受损。特别是，用许多衰老植物组织进行的研究，已经为看来可归因于膜双份子层中脂质代谢物积累的膜中脂质相分离提供了证据(McKersie和Thompson，1979，Biochim.Biophys.Acta，508197-212；Chia等，1981，Plant Physiol.，67415-420)。有越来越多的证据表明，衰老组织中大部分的脂质代谢通过基因表达的衰老特异性变化来完成(Buchanan-Wollaston，V.，J.Exp.Bot.，1997，307181-199)。
衰老的起始可由不同的内部和外部因素诱导。例如，在许多植物中，乙烯在例如种子萌发、幼苗发育、果实成熟和花衰老的各种各样的植物过程中起作用。植物中乙烯的产生也可能与机械创伤、化学物质、胁迫(例如由于温度和水量变化产生的)和病害所诱导的创伤有关。乙烯与许多植物中叶片衰老的调节相关联，但用转基因植物和乙烯反应型突变体获得的证据表明，尽管乙烯对衰老有作用，但它并不是该过程的主要调节物。例如，在无跃变型植物如草莓果的实成熟过程中，在某些花例如萱草的衰老过程中，以及在某些植物例如拟南芥属(Arabidopsis)、特别是在单子叶植物的叶片衰老过程中，不需要乙烯信号(Smart，C.M.，1994，New Phytology，126419-448；Valpuesta等，1995，Plant Mol.Biol.，28575-582)。
诱导衰老过早起始的外部因素包括环境胁迫例如温度、干旱、光照或营养供应差、以及病原体侵袭。同自然(年龄相关的)衰老的情况一样，环境胁迫诱导的衰老的特征为细胞膜完整性的丧失。具体地说，暴露于环境胁迫，诱发反映出膜损伤的电解质渗漏(Sharom等，1994，Plant Physiol.，105305-308；Wright和Simon，1973，J.Exp.Botany，24400-411；Wright，M.，1974，Planta，12063-69；和Eze等，1986，Physiologia Plantarum，68323-328)、膜磷脂水平下降(Wright，M.，1974，Planta，12063-69)和脂质相变(Sharom等，1994，Plant Physiol.，105305-308)，所有这些都可以归因于脂酶的作用。暴露于环境胁迫的植物组织也产生乙烯，通常称为胁迫乙烯(Buchanan-Wollaston，V.，1997，J.Exp.Botany，48181-199；Wright，M.，1974，Planta，12063-69)。如上所述，已知乙烯在某些植物中引起衰老。导致渗透的膜退化也是种子老化的基本特征，有证据表明，这也反映出膜磷脂中的脂肪酸脱酯化(McKersie，B.D.，Senarata，T.，Walker，M.A.，Kendall，E.J.和Hetherington，P.R.载于Senescence and Aging in Plants，L.D.Nooden和A.C.Leoopold编著，Academic Press，1988.第441-464页)。
目前，对于控制由内部或外部因子例如环境胁迫引起的衰老的起始，没有广泛适用的方法。当前，用于控制衰老并增加新鲜易腐植物产品(例如水果、花和蔬菜)的储藏期限的技术，主要依赖于降低乙烯生物合成。例如，美国专利5,824,875公开了转基因天竺葵属植物，所述植物由于三个1-氨基-环丙烷-1-羧酸(ACC)合酶基因之一以反义取向表达，引起乙烯水平降低，而表现出储藏期限增加。因此，该技术仅适用于范围有限的乙烯敏感型植物。
通过减少乙烯生物合成，引起成熟更缓慢地发生，也使某些果实的储藏期限得以延长。由于这些果实的衰老在成熟后被诱导，所以乙烯生物合成减少对储藏期限的作用是间接的。用来延迟水果成熟的另一种方法是通过改变在成熟早期合成的一种细胞壁软化酶-多聚半乳糖醛酸酶的细胞水平。这种方法与控制乙烯生物合成相似，因为它也是仅仅间接地影响衰老，再者，它仅适用于很窄范围的植物。
因而，需要一种适用于各种各样植物的控制植物衰老的方法。因此，开发适用于所有类型植物(无论其是否对乙烯敏感)的调节衰老的技术是有意义的。
发明概述本发明基于编码康乃馨衰老诱导脂酶的全长cDNA克隆和编码拟南芥(Arabidopsis thaliana)衰老诱导脂酶的全长cDNA克隆的发现与克隆。本文公开了所述衰老诱导脂酶基因的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。已经成功地用康乃馨衰老诱导脂酶基因的核苷酸序列作为异源探针，检测几种植物中受相似调节的相应基因或RNA转录物。
本发明提供一种用于基因修饰植物以控制衰老起始的方法，所述衰老或者为年龄相关的衰老，或者为环境胁迫诱导的衰老。将本发明的衰老诱导脂酶核苷酸序列、其片段或这类片段的组合，以反向导入植物细胞中，以抑制内源衰老诱导脂酶基因的表达，从而降低内源衰老诱导脂酶的水平并且改变转化植物中的衰老。
运用本发明的方法产生转基因植物，并监测其生长和发育。选择由于衰老诱导脂酶水平降低所致的植物生长、开花、果实腐败减少、种子老化减少和/或叶片黄化减少而表现出生命或储藏期限延长的植物或植物的分离部分(例如插条、花、营养体、果实、种子或叶片)，作为具有改良特性(包括叶黄化减少、花瓣脱落减少、运输和储藏期间果实腐败减少)的所需产品。繁殖这些优良植物。同样，选择表现出对环境胁迫抗性增强(例如对低温(寒冷)、干旱、侵染等的敏感性降低)的植物作为优良产品。
在一方面，本发明涉及一种编码衰老诱导脂酶、与SEQ ID NO1杂交的分离的DNA分子或与SEQ ID NO1杂交的所述分离DNA分子的功能衍生物。在本发明的一个实施方案中，所述分离的DNA分子具有SEQ ID NO1的序列，即与SEQ ID NO1 100％互补(序列同一性)。在本发明该方面的另一实施方案中，所述分离的DNA分子含有SEQID NO4的核苷酸序列。
本发明也涉及一种编码衰老诱导脂酶、与SEQ ID NO18杂交的分离的DNA分子或与SEQ ID NO18杂交的所述分离DNA分子的功能衍生物。在本发明该方面的一个实施方案中，所述分离的DNA分子具有SEQ ID NO18的序列，即与SEQ ID NO18 100％互补(序列同一性)。在本发明该方面的另一实施方案中，所述分离的DNA分子含有SEQ ID NO19的核苷酸序列。
在本发明的另一实施方案中，提供一种由本文上述的DNA分子编码的分离的蛋白质或其功能衍生物。一种优选的蛋白质具有SEQ IDNO2的氨基酸序列，或是其功能衍生物。
此中也提供编码与上述DNA分子的RNA转录物的至少一部分互补的RNA分子的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中所述RNA分子与所述RNA转录物杂交，使得内源衰老诱导脂酶的表达被改变。所述反义寡核苷酸或多核苷酸可以是全长的，或最好具有约6个至约100个核苷酸。
所述反义寡核苷酸或多核苷酸与编码衰老诱导脂酶的DNA分子的一条链的相应部分基本上互补，其中所述编码衰老诱导脂酶的DNA分子与SEQ ID NO1、SEQ ID NO18杂交或与这两者杂交，或者与所述编码衰老诱导脂酶的DNA分子所编码的RNA序列的相应部分基本上互补。在本发明的一个实施方案中，所述反义寡核苷酸或多核苷酸与SEQ ID NO1、SEQ ID NO18或这两者的一条链的相应部分基本上互补，或者与SEQ ID NO1所编码的RNA转录物的相应部分基本上互补。在另一实施方案中，所述反义寡核苷酸与编码衰老诱导脂酶的DNA分子的一条链的5’非编码部分或3’端部分的约100-200个核苷酸的相应部分基本上互补，其中所述DNA分子与SEQ ID NO1、SEQ IDNO18或这两者杂交。在另一实施方案中，所述反义寡核苷酸或多核苷酸与SEQ ID NO4核苷酸序列的一条链可读框的相应部分或与由SEQ ID NO4所编码的RNA转录物的相应部分基本上互补。
本发明还涉及用于转化植物细胞的载体，所述载体包含(a)反义核苷酸序列，所述反义核苷酸序列(1)与编码衰老诱导脂酶的DNA分子的一条链的相应部分基本上互补，其中所述编码衰老诱导脂酶的DNA分子与SEQ ID NO1、SEQ ID NO18或这两者杂交，或者(2)与所述编码衰老诱导脂酶的DNA分子所编码的RNA序列的相应部分基本上互补；和(b)调节序列，所述调节序列与所述反义核苷酸序列有效连接，使得所述反义核苷酸序列在其转化的植物细胞中表达。
所述调节序列包括在转化植物细胞中有功能的启动子，所述启动子可以是诱导型的或是组成型的。所述调节序列可任选地包括一个聚腺苷酸化信号。
本发明也提供一种用上述载体转化的植物细胞、由这种细胞产生的小植株或成熟植株、或这种小植株或植株的一种植物部分。
本发明方法还涉及一种产生与未经修饰的植物相比衰老诱导脂酶水平降低的植物的方法，所述方法包括(1)用上述载体转化植物；(2)让所述植物生长至至少小植株阶段；(3)分析所述转化植株或小植株的改变的衰老诱导脂酶活性和/或改变的衰老和/或改变的环境胁迫诱导的衰老和/或乙烯诱导的衰老；和(4)选择并培育与非转化的植物相比衰老诱导脂酶活性改变和/或衰老改变和/或环境胁迫诱导的衰老改变或乙烯诱导的衰老改变的植株。
按照上述方法产生的植物、或者子代、杂种、克隆或植物部分最好表现出衰老诱导脂酶表达减少和衰老延迟和/或胁迫诱导的衰老或乙烯诱导的衰老延迟。
本发明还涉及一种抑制植物细胞中内源衰老诱导脂酶表达的方法，所述方法包括(1)使一种载体整合到植物的基因组中，所述载体包含(A)反义核苷酸序列，所述核苷酸序列(i)与编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子的一条链的相应部分互补，其中所述编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子与SEQ IDNO1、SEQ ID NO18或这两者杂交，或(ii)与由所述内源衰老诱导脂酶基因所编码的RNA序列的相应部分互补；和
(B)调节序列，所述调节序列与所述反义核苷酸序列有效连接，使得所述反义核苷酸序列得以表达；和(2)培育所述植物，从而使所述反义核苷酸序列转录，并且所述转录物与所述内源RNA结合，致使所述衰老诱导脂酶基因的表达被抑制。
附图简述

图1描绘了由得自康乃馨花cDNA文库的衰老诱导脂酶cDNA克隆(SEQ ID NO1)编码的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。所述氨基酸序列中的共有基序如下单下划线，酰胺化位点；点下划线，蛋白激酶C磷酸化位点；双下划线，N-肉豆蔻酰化位点；实线框(box border)，cAMP磷酸化位点；阴影框，酪蛋白激酶II磷酸化位点；交叉影线框(cross-hatched box)，脂酶家族的共有序列；而虚线框，N-糖基化位点。
图2描绘了与脂酶样蛋白的部分序列比对的推导的全长康乃馨花瓣衰老诱导脂酶氨基酸序列(SEQ ID NO2)。carlip康乃馨花瓣衰老诱导脂酶的全长序列(SEQ ID NO11)；arlip，得自拟南芥的脂酶样蛋白的部分序列(Gen Bank登记号AL021710)(SEQ ID NO12)；ipolip，得自番薯属(Ipomea)的脂酶样序列的部分序列(Gen Bank登记号U55867)(SEQ ID NO13)；arlipi，得自拟南芥的脂酶样蛋白的部分序列(Gen Bank登记号U93215)(SEQ ID NO14)。框注了三种或四种所述序列中的相同氨基酸。
图3显示了得自在大肠杆菌(E.coli)中表达的康乃馨脂酶cDNA的融合蛋白表达产物的蛋白质印迹分析。用抗所述衰老诱导脂酶蛋白的抗体探测所述蛋白质印迹。第1泳道，麦芽糖结合蛋白；第2泳道，由借助于蛋白酶(因子Xa)酶切位点与麦芽糖结合蛋白cDNA融合的康乃馨脂酶构成的融合蛋白；第3泳道，用因子Xa部分切割为游离脂酶蛋白(50.2kDa)和游离麦芽糖结合蛋白的融合蛋白。
图4为从不同发育阶段的康乃馨花瓣中分离的RNA的RNA印迹分析。图4A为总RNA的溴化乙锭染色的凝胶。每个泳道含有10μgRNA。图4B为用32P-dCTP标记的全长康乃馨衰老诱导脂酶cDNA探测的RNA印迹的放射自显影照片。
图5为脂解性酰基水解酶的原位证明，所述水解酶即通过在大肠杆菌中过量表达康乃馨衰老诱导脂酶cDNA获得的蛋白产物的脂酶活性。mal，在基础盐培养基中的仅含麦芽糖结合蛋白的大肠杆菌细胞；mLip，在基础盐培养基中的含有由与麦芽糖结合蛋白融合的康乃馨衰老诱导脂酶构成的融合蛋白的大肠杆菌细胞；40mal/40mLip，在补充Tween 40的基础盐培养基中的仅含麦芽糖结合蛋白[mal]或含有所述脂酶-麦芽糖结合蛋白融合产物[mLip]的大肠杆菌细胞；60mal/60mLip，在补充Tween 60的基础盐培养基中的仅含麦芽糖结合蛋白[mal]或含有所述脂酶-麦芽糖结合蛋白融合产物[mLip]的大肠杆菌细胞。
图6A图解所述康乃馨衰老诱导脂酶的可读框的限制性酶切图谱。数字指的是可读框中的核苷酸。
图6B是用各种限制性酶消化并用康乃馨衰老诱导脂酶cDNA探测的康乃馨基因组DNA的DNA印迹分析。
图7是康乃馨衰老诱导脂酶cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ IDNO1)。实线下划线，所述衰老诱导脂酶cDNA的非编码序列；非下划线序列是可读框。
图8是康乃馨衰老诱导脂酶cDNA的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图9A是RNA印迹分析，显示暴露于0.5ppm乙烯达15小时的第II阶段花瓣中所述康乃馨脂酶的表达。图9A是经溴化乙锭染色的凝胶，显示出每个泳道加载恒定量的康乃馨RNA(花瓣第1泳道和第2泳道；叶片第3泳道和第4泳道；+，乙烯处理的；-，未经处理的)。图9B是用标记的全长康乃馨花瓣衰老诱导脂酶cDNA探测的图9A中凝胶的RNA印迹的放射自显影照片。
图10是番茄叶片基因组衰老诱导脂酶的部分核苷酸序列(SEQ IDNO6)和相应的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO17)。保守的脂酶共有基序用影线标注；用来产生基因组片段的引物的序列分别用下划线标注。
图11是一柱状图表，显示低温对膜渗透的影响。将番茄植株于8°冷藏48小时，然后重新温热至室温。测量未经冷藏的对照植株以及经冷藏植株在6小时期间和24小时期间渗出液从叶盘片的渗漏(μMhos)。
图12是从于8°冷藏48小时然后重新温热至环境温度达24小时的植株中分离的番茄叶片RNA的RNA印迹分析。图12A是叶片总RNA的溴化乙锭染色的凝胶。图12B是用32P-dCTP标记的全长康乃馨衰老诱导脂酶cDNA探测的RNA印迹的放射自显影照片。
图13是拟南芥属EST(GenBank登记号N38227)的部分核苷酸序列(SEQ ID NO15)和相应的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO16)，所述氨基酸序列与康乃馨衰老诱导脂酶在64个氨基酸区内有55.5％相同。保守的脂酶共有基序以影线标注。
图14是所述全长拟南芥属衰老诱导脂酶基因的核苷酸序列(上)(SEQ ID NO18)以及推导的氨基酸序列(下)(SEQ ID NO19)。
图15是用32P-dCTP标记的全长拟南芥属衰老诱导脂酶探测的、从不同阶段拟南芥属植株(第1泳道，2周龄植株；第2泳道，3周龄植株；第3泳道，4周龄植株；第4泳道，5周龄植株；第5泳道，6周龄植株)叶片中分离的总RNA的RNA印迹。上图(15A)是放射自显影照片，下图(15B)显示溴化乙锭染色的凝胶。
图16是用32P-dCTP标记的全长拟南芥属衰老诱导脂酶探测的、从用50μM乙烯利(一种乙烯源)处理的3周龄拟南芥属植株叶片中分离的总RNA的RNA印迹。上图(16A)是放射自显影照片，下图(16B)显示溴化乙锭染色的凝胶。
图17是4.6周龄的拟南芥属野生型植株(左图)和表达反义方向的全长拟南芥属衰老诱导脂酶基因、在转基因植株中表现叶片大小增加的转基因植株(右图)的照片。
图18是6.3周龄的拟南芥属野生型植株(左图)和表达反义方向的全长拟南芥属衰老诱导脂酶基因、在转基因植株中表现叶片大小增加和叶片衰老延迟的转基因植株(右图)的照片。
图19是7周龄的拟南芥属野生型植株(左图)和表达反义方向的全长拟南芥属衰老诱导脂酶基因、在转基因植株中表现叶片大小增加的转基因植株(右图)的照片。
图20是一幅图，表明在3个表达反义方向的所述衰老诱导脂酶基因的T1转基因拟南芥属植株系中种子产量增加。种子产量以种子体积表示。显示野生型植株的n＝30的SE。
图21是从4周龄拟南芥属野生型植株叶片和从表达反义方向的所述全长衰老诱导脂酶基因的相应转基因植株叶片中分离的总蛋白的蛋白质印迹。(第1泳道和第2泳道加载9μg蛋白质，而第3泳道和第4泳道加载18μg蛋白质)。所述印迹用针对所述拟南芥属衰老诱导脂酶蛋白产生的抗体来探测。在所有转基因植株中，所述衰老诱导脂酶的表达减少。
发明详述提供用于改变植株细胞中衰老诱导脂酶基因表达的方法和组合物。在植物中所述衰老诱导脂酶基因表达的改变导致衰老起始延迟和对环境胁迫的抗性改善，从而延长植物的储藏期限和/或生长期。
已经从由康乃馨(Dianthus caryophyllus)花的衰老花瓣的RNA制备的cDNA文库中，分离出编码表现出衰老诱导的表达的康乃馨脂酶基因的全长cDNA序列。使用对应于所述分离的康乃馨花脂酶cDNA序列以及全长康乃馨脂酶cDNA的所选区的多核苷酸探针，来确定衰老康乃馨叶片、成熟中的番茄果实和衰老中的嫩荚菜豆叶片以及环境胁迫(冷藏)番茄叶片中编码所述脂酶基因的mRNA的存在。使用根据所述康乃馨脂酶cDNA设计的引物，用番茄叶片基因组DNA作为模板，产生聚合酶链式反应(PCR)产物。所述PCR产物含有一个部分可读框，编码包括所述保守的脂酶共有基序ITFTGHSLGA(SEQ ID NO3)的部分蛋白质序列。所述番茄核苷酸序列与所述康乃馨衰老诱导脂酶序列具有53.4％的序列同一性，与拟南芥属脂酶序列具有43.5％的同一性。所述拟南芥属脂酶序列与所述康乃馨核苷酸序列具有44.3％的同一性。
通过用针对胞质脂质-蛋白质颗粒(一种康乃馨脂酶源)产生的抗体，筛选从衰老中的康乃馨花瓣制备的cDNA表达文库，分离出本发明的康乃馨衰老诱导脂酶基因。获得对应于所述康乃馨衰老诱导脂酶基因的阳性全长cDNA克隆并对其测序。所述衰老诱导脂酶cDNA克隆的核苷酸序列示于SEQ ID NO1中。该cDNA克隆编码一种447个氨基酸的多肽(SEQ ID NO2)，所述多肽的计算的分子量为50.2kDa。所述cDNA克隆在大肠杆菌中表达，产生一种表现出酰基水解酶活性的预期分子量的蛋白质，即所述表达的蛋白质水解棕榈酸对硝基苯酯、磷脂和三酰甘油。根据所述酶在发育中的康乃馨花中的表达模式和所述蛋白质的活性，所述酶与衰老有关。
采用衰老中的拟南芥属叶片cDNA文库作为反应模板，通过PCR，也分离出本发明的拟南芥属衰老诱导脂酶基因。所述拟南芥属衰老诱导脂酶基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列示于图14(SEQID NO8)。根据该脂酶基因在发育中的植株中的表达模式，它与衰老有关。
用全长康乃馨cDNA探测的康乃馨花瓣总RNA的RNA印迹表明，所述衰老诱导脂酶基因的表达在自然衰老临起始前被显著地诱导(图4)。RNA印迹分析也证明，衰老诱导脂酶基因被环境胁迫条件例如冷藏(图12)和乙烯(图4和图9)诱导，已知乙烯是响应环境胁迫而产生的。所述RNA印迹分析表明，康乃馨衰老诱导脂酶mRNA的存在量在衰老过程(发育阶段IV)中显著高于幼年阶段I、II和III的康乃馨花瓣中的存在量。此外，乙烯刺激的阶段II的花也显示出衰老诱导脂酶基因的表达较高。同样，已经暴露于低温然后恢复至环境温度的植株，也显示出被诱导的衰老诱导脂酶基因表达并且同时产生冻害症状(例如渗漏)(图11和图12)。
拟南芥属衰老诱导脂酶基因的表达受相似的调节。得自不同发育阶段拟南芥属植株叶片的总RNA的RNA印迹分析表明，所述脂酶基因被正调节，同时叶片开始衰老(图15)。此外，同康乃馨衰老诱导脂酶基因一样，通过用诱导叶片衰老的植物激素乙烯处理，拟南芥属衰老诱导脂酶基因被正调节(图16)。
在各种植物例如康乃馨、嫩荚菜豆、番茄、拟南芥属和各种植物组织例如叶片、果实和花中的总体基因表达模式证明，本发明的脂酶基因在这些植物和植物组织中参与衰老的起始。因此，预期通过在植物组织中基本上抑制或改变所述衰老诱导脂酶基因的表达，可以延迟衰老、变质和腐败，从而增加易腐水果、花和蔬菜的储藏期限。最好通过用组成型启动子例如CaMV 35S启动子，或者采用组织特异性或衰老诱导型启动子，在水果、花、蔬菜、农作物和森林树种中产生其中所述脂酶cDNA或其寡核苷酸片段以反义构型表达的转基因植物，则可以达到这一目标。
康乃馨衰老诱导脂酶基因是一种单拷贝基因。用不识别康乃馨衰老诱导脂酶cDNA可读框内序列的各种限制性酶切割康乃馨基因组DNA，进行DNA印迹分析。用32P-dCTP标记的全长cDNA(SEQ IDNO1)探测经所述限制性酶消化的基因组DNA。在高严格性杂交条件下，仅一个限制性片段与所述cDNA克隆杂交(杂交和洗涤都于68℃下进行；洗涤缓冲液0.2％×SSC，0.1％ SDS)。因此，康乃馨衰老诱导脂酶基因是一种单拷贝基因(图6)。该基因在康乃馨中不是多基因家族一员的事实，强有力地提示它在其它植物中是一种单拷贝基因。
对于康乃馨衰老诱导脂酶基因或拟南芥属衰老诱导脂酶基因的完整核苷酸序列的了解，足以使得人们可从各种其它植物种中分离衰老诱导脂酶基因。事实上，正如本文所表明的，已经成功地用基于所述康乃馨cDNA序列的寡核苷酸引物，用番茄叶片基因组DNA作为模板，通过聚合酶链式反应产生了番茄叶片衰老诱导脂酶基因片段。
单独或组合的所述克隆化衰老诱导脂酶基因或其片段当在组成型启动子控制下以反向方向(反义)导入时，可以用来遗传修饰植物并且在经修饰的植物中改变衰老，所述启动子例如玄参花叶病毒(fig wartmosaic virus)35S启动子、花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S启动子或MAS启动子。可以用来自与康乃馨衰老诱导脂酶基因享有足够序列同一性的其它植物所选的反义序列，来实现相似的遗传修饰。所述遗传修饰的一个结果是内源可翻译的衰老诱导脂酶的编码mRNA的量减少。因此，在所述植物细胞中产生的衰老诱导脂酶的量减少，从而减少了细胞膜损伤和细胞渗透的量，例如由于老化或环境胁迫所致的叶片、果实和/或花的衰老和腐败减少。
例如，用在双重35S启动子调节下表达反义方向的全长拟南芥衰老诱导脂酶基因的载体转化的拟南芥属植物，表现出与野生型植株相比叶片大小增加和植物生长总体更大，如图17和图18中所示。这些植株也表现出叶片衰老延迟，如图19中所示。
通过在转基因拟南芥属植物中表达反义方向的所述全长脂酶基因所引起的所述衰老诱导脂酶基因表达减少的效应，也表现为转化植物中种子产量增加。表达所述全长衰老诱导脂酶基因的拟南芥属植株系产生的种子为野生型植株的多达约2-3倍(图20)。
在图21中显示出，在转基因植株中观察到的对生物量、叶片衰老和种子产量的效应是由于这些植株中衰老诱导脂酶减少造成的。本发明的转基因植物与野生型植物相比，表现出衰老诱导脂酶的表达显著减少。
因此，本发明的方法和序列可以用来延迟植物腐败包括叶片或果实腐败、以及增加植物生物量和种子产量，总的来讲，改变植物的衰老。
本发明的分离的核苷酸序列可以用来从其它植物或生物中分离基本上互补的衰老诱导脂酶核苷酸序列。这些序列又可以用来转化植物，从而以利用本文所示的分离的核苷酸序列所示方式的相同方式，改变转化植物的衰老。
通过用衰老诱导脂酶、其功能片段或其组合转化植物而观察到的遗传修饰，可以在所述植物中引起衰老诱导脂酶水平的永久改变，并且可以通过自交或采用其它繁殖方案传递给子代植株。用所述遗传改变的植物产生新的植物系，其中所述改变稳定地一代一代地传递。本发明首次提供可以用来在很宽范围的不同植物中实现衰老的稳定遗传修饰的合适DNA序列。
关于所述衰老诱导脂酶基因的鉴定和分离，一般而言，用本领域熟知的常规方法，进行质粒DNA的制备、DNA的限制性酶消化、DNA的琼脂糖凝胶电泳、蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳、DNA印迹分析、RNA印迹分析、DNA连接和细菌转化。参见例如Sambrook，J.等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，NY，1989。Sambrook(参见上文)公开了核酸杂交的技术。
当用于本文时，术语“植物”是指或者全株、植物的一个部分、一种植物细胞或一组植物细胞。可以用于本发明方法的植物的类型并不受限制，包括例如乙烯敏感型和乙烯不敏感型植物；结果植物，例如杏、苹果、橙、香蕉、葡萄柚、梨、番茄、草莓、鳄梨等；蔬菜，例如胡萝卜、豌豆、莴苣、卷心菜、芜菁、马铃薯、嫩茎花椰菜、芦笋等；花，例如康乃馨、玫瑰、菊花等；以及一般而言可以吸收和表达本发明DNA分子的任何植物。所述植物可以包括各种各样倍性水平的植物，包括单倍体、双倍体、四倍体和多倍体植物。
转基因植物在本文被定义为以某种方式被遗传修饰的植物，包括但不限于已经在基因组中具有掺入的异源或同源的衰老诱导脂酶DNA或经修饰的DNA或者异源衰老诱导脂酶DNA或同源衰老诱导脂酶DNA的某些部分的植物。所述被改变的遗传物质可以编码蛋白质，包含一段调节或控制序列，或者可以是反义序列或包括反义序列，或编码相对于所述植物的内源衰老诱导脂酶DNA或mRNA序列或其部分为反义的反义RNA。“转基因”或“转基因序列”被定义为已经被掺入到转基因植物中的外源基因或部分序列。
术语“杂交”当用于本文中时，一般用来指在对于本领域技术人员是显而易见的、根据所述探针序列和靶序列的特性为合适的严格性条件下的核酸杂交。杂交和洗涤的条件是本领域众所周知的，根据所需的严格性，通过改变保温时间、温度和/或溶液的离子强度，容易达到对所述条件的判断。参见例如Sambrook，J.等，Molecular CloningALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，New York，1989。条件的选择决定于杂交序列的长度、尤其是探针序列的长度、所述核酸的相对G-C含量以及允许的错配量。当需要在具有较低互补程度的链间部分杂交时，优选低严格性条件。当需要完全互补性或接近完全互补性时，优选高严格性条件。关于典型的高严格性条件，杂交溶液含有6×S.S.C.、0.01M EDTA、1×Denhardt溶液和0.5％SDS。对于克隆化DNA片段而言，于约68℃下杂交约3-4小时，对于真核总DNA而言，杂交进行约12小时至约16小时。对于较低的严格性，将杂交温度降至低于所述双链体解链温度(TM)约12℃。已知TM随G-C含量和双链体长度以及溶液离子强度而变。
当用于本文时，术语“大致序列同一性”或“大致同源性”用来表示核苷酸序列或氨基酸序列表现出与另一核苷酸序列或氨基酸序列结构或功能大致等同。在具有大致序列同一性或大致同源性的序列之间的任何结构或功能的差异将是最小的(de minimis)；也就是说，它们将不影响所述序列在所需的应用中发挥所表明作用的能力。差异可能是由于例如不同物种中密码子选择的遗传变异所致。如果在两种或更多种序列之间有相当量的序列重叠或相似，或者即使所述序列在长度或结构上有所不同，但如果所述不同序列表现出相似的物理特性，则认为结构差异最小。这类特性包括例如在限定条件下杂交的能力；或者就蛋白质而言例如免疫交叉反应性、相似的酶活性等。
另外，如果两种核苷酸序列之间具有至少约40％、更优选至少约60％、最优选约90％的序列相似性，则两种核苷酸序列“基本互补”。如果两种氨基酸序列在所述多肽的活性部分具有至少40％、优选70％的相似性，则这两种氨基酸序列大致同源。
当用于本文中时，短语“与”DNA或RNA分子“的相应部分杂交”意思是杂交的分子例如寡核苷酸、多核苷酸或任何核苷酸序列(有义方向或反义方向)识别另一核酸分子中具有大致同样大小且与其具有足够的序列相似性以在合适条件下实现杂交的序列，并且与所述序列杂交。例如，来源于康乃馨脂酶3’编码区或非编码区的100个核苷酸长的反义分子，将分别识别拟南芥属衰老诱导脂酶基因或任何其它植物衰老诱导脂酶基因的3’编码区或非编码区内核苷酸序列的约100个核苷酸的部分并与其杂交，只要在这两种序列之间具有约70％或更高的序列相似性。人们会理解，所述“相应部分”的大小将容许杂交中有一定的错配，因此所述“相应部分”可以小于或大于与其杂交的分子，例如大或小20-30％，优选比与其杂交的分子大或小不超过约12-15％。
术语核酸(或者多核苷酸或寡核苷酸)的“功能衍生物”在本文用来指编码衰老诱导脂酶的基因或核苷酸序列的片段、变异体、同源物或类似物。功能衍生物可以保留所述衰老诱导脂酶编码DNA的功能的至少一部分，这使得它可以按照本发明应用。这样的功能可包括与天然康乃馨衰老诱导脂酶DNA或得自另一种植物的编码衰老诱导脂酶的大致同源的DNA杂交、或与其mRNA转录物杂交即以反义方向杂交，以抑制植物衰老诱导脂酶mRNA的转录和/或翻译的能力，或诸如此类的能力。
基因或DNA序列的“片段”是指所述分子的任何亚部分(subset)，例如较短的多核苷酸或寡核苷酸。“变异体”是指与完整基因或其片段大致相似的分子，例如具有一个或多个被取代核苷酸、但保留与所述特定基因杂交的能力或者编码与所述天然DNA杂交的mRNA转录物的核酸取代变异体。“同源物”是指来自一种不同的植物属或种的片段或变异体序列。“类似物”是指与所述完整分子、变异体或其片段基本相似或其作用与所述完整分子、变异体或其片段有关的非天然分子。
一种基因例如所述衰老诱导脂酶基因的所谓的“改变的表达”或“经修饰的表达”，是指所述基因的正常表达例如在未经修饰的康乃馨或其它植物中发生的表达以某种方式被改变的过程或结果。正如本文中所意指的，基因表达的改变是所述衰老诱导脂酶基因表达完全减少或部分减少，但也可以包括表达时序的改变，或者所述衰老诱导脂酶基因的表达不同于在未经修饰的植物或栽培品种中最可能正常发生的表达的另一种状态。优选的改变是与未经修饰的植物中的产量相比导致所述植物的衰老诱导脂酶产量减少的改变。
在产生按照本发明的遗传改变的植物方面，最好是根据所需的性状(一般为衰老诱导脂酶表达或产生减少)来选择各株单个小植株或单株。例如可以使用本文所述的特异性抗体，用常规免疫测定定量测定衰老诱导脂酶的表达。此外，可以用本文所述的生物化学方法，测量衰老诱导脂酶的酶活性。
为了使新插入的基因或DNA序列表达，导致所述基因或DNA序列编码的蛋白质产生，或者就反义DNA而言，为了使所述反义DNA转录，产生反义RNA分子，合适的调节元件应该相对于所述基因或DNA序列而言存在于合适的位置上并且以合适的取向存在。所述调节区可以包括一个启动子、一个5’非翻译前导序列和一个3’聚腺苷酸化序列以及增强子和其它调节序列。
可与所述衰老诱导脂酶基因结合使用从而产生所述基因的有义或反义转录物的启动子调节元件，一般而言包括任何植物启动子，更具体地讲包括组成型启动子，例如玄参花叶病毒35S启动子、双重35S启动子、花椰菜花叶病毒启动子、CaMV35S启动子或MAS启动子；或组织特异性或衰老诱导型启动子，例如康乃馨花瓣GST1启动子或拟南芥属SAG12启动子(参见例如J.C.Palaqui等，Plant Physiol.，1121447-1456(1996)；Morton等，Molecular Breeding，1123-132(1995)；Fobert等，Plant Journal，6567-577(1 994)；和Gan等，Plant Physiol.，113313(1997)，所述文献通过引用结合到本文中)。用于本发明的启动子最好是组成型启动子。
可以用常规表达系统，例如通过测量报道基因产物，例如已经导入启动子/报道基因的转基因植物的叶片、花、果实或其它组织提取物中的蛋白质或mRNA的水平，测试来自可用于本发明的启动子的表达水平。
本发明提供与编码康乃馨衰老诱导脂酶的基因互补、与编码拟南芥属衰老诱导脂酶的基因互补、或者与来自另一种植物的、在低至高严格性条件下与康乃馨或拟南芥属衰老诱导脂酶基因杂交的基因或基因片段互补的反义寡核苷酸和多核苷酸。这类反义寡核苷酸应该至少长约6个核苷酸，从而提供杂交的最低特异性，并且可以与编码衰老诱导脂酶的DNA或mRNA的一条链或其部分互补、或与基因组DNA中参与调节衰老诱导脂酶基因表达的侧翼序列互补。所述反义寡核苷酸可以大至100个核苷酸，可以在长度上延伸至和超过相对于所述反义寡核苷酸为有义的全长编码序列。所述反义寡核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA或者DNA和RNA的嵌合混合物，或者为其衍生物或修饰形式。
所述反义寡核苷酸的作用可以导致细胞中衰老诱导脂酶基因表达的改变，主要是对所述基因表达的抑制。关于反义核酸的一般性论述，参见Alberts等，Molecular Biology of the Cell，第二版，GarlandPublishing，Inc.New York，New York(1989，尤其是第195-196页，该文献通过引用结合到本文中)。
所述反义寡核苷酸可以与所述衰老诱导脂酶基因的任何部分互补。在一个实施方案中，例如，所述反义寡核苷酸可以长6-100个核苷酸，并且可以与所述衰老诱导脂酶序列的5’非编码序列或3’端互补。已知主要与5’非编码序列互补的反义寡核苷酸是编码转录因子的基因表达的有效抑制剂。Branch，M.A.，Molec.Cell Biol.，134284-4290(1993)。
优选的反义寡核苷酸与编码衰老诱导脂酶的mRNA的相应部分基本互补。例如，预期将以反义方向编码衰老诱导脂酶的全长cDNA克隆导入植物中，导致成功地改变衰老诱导脂酶基因的表达。此外，导入靶向所述衰老诱导脂酶基因特定部分的部分序列，可能同样有效。
本发明需要的最低同源性是这样的同源性，所述同源性足以引起足够的互补性，从而达到识别所述特定靶RNA或DNA并且抑制或减少其翻译或其功能，而不影响其它RNA或DNA分子的功能和其它基因的表达。虽然本发明的反义寡核苷酸包含与所述衰老诱导脂酶基因的RNA转录物的至少一部分互补的序列，但并不需要绝对的互补性，尽管优选绝对互补性。杂交的能力可取决于所述反义寡核苷酸的长度和互补性的程度。一般而言，杂交核酸越长，它可以含有的与所述衰老诱导脂酶靶序列的碱基错配则越多，而仍可形成稳定的双链体。本领域技术人员可利用标准方法来例如测定杂交的复合物的解链温度，而确定容许的错配程度。
通过从外源导入的核酸序列转录，可以在细胞内产生所述反义RNA寡核苷酸。通过用一种载体例如掺入了与合适调节元件(包括启动子)有效连接的、编码所述衰老诱导脂酶反义序列的DNA的质粒或病毒来转化或转染或感染，可以将所述反义分子传递至细胞。在所述细胞内，所述外源DNA序列被表达，产生所述衰老诱导脂酶基因的反义RNA。
载体可以是质粒，最好是质粒，或者可以是本领域已知的在植物细胞或细菌细胞中复制和表达所编码基因的病毒或其它载体。所述载体整合到染色体中，使得它可以被转录而产生所需的衰老诱导脂酶反义RNA。这类质粒或病毒载体可以用本领域标准的重组DNA技术方法来构建。例如，所述载体可以是含有在原核宿主中有功能的复制系统和按照本发明的反义寡核苷酸或多核苷酸的质粒载体。另一方面，所述载体可以是含有在农杆菌属中有功能的复制系统和按照本发明的反义寡核苷酸或多核苷酸的质粒。能够在农杆菌属中复制的质粒是本领域众所周知的。参见Miki等，Procedures for Introducing Foreign DNAInto Plants，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，B.R.Glick和J.E.Thompson编著，CRC Press(1993)，第67-83页。
按照以下方式，将所述康乃馨脂酶基因以反义方向克隆到质粒载体中。由pUC18骨架构建pCD质粒，该质粒含有得自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，后接一个多克隆位点和一个章鱼碱合酶终止序列，使用pCD质粒克隆所述康乃馨脂酶基因。通过将反义方向的所述全长康乃馨脂酶基因，亚克隆到pCd的Hind3位点和EcoR1位点中，构建pCd-脂酶(反义)质粒。同样，通过首先将康乃馨谷胱甘肽S转移酶1(GST1)启动子的PCR扩增片段(-703至+19bp)，亚克隆到pCd载体的BamH1和Sal1位点，构建pCDΔ35S-GST1-脂酶(反义)质粒。然后将全长康乃馨脂酶基因以反义方向亚克隆到所述构建体的Hind3和EcoR1位点。通过首先将康乃馨谷胱甘肽S转移酶1(GST1)启动子的PCR扩增片段(-703至+19bp)，亚克隆到pCd载体的BamH1和Sal1位点，构建另一种质粒-pGdΔ35S-GST1-GUS质粒。然后将β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)报道基因亚克隆到所述构建体的Sal1和EcoRI位点。通过首先将双重35S启动子(含有CaMV 35S启动子的串连的两个拷贝)亚克隆到pCd载体的Sma1和Hind3位点，构建pCd-35S2-脂酶(反义)质粒。然后将全长康乃馨脂酶基因以反义反向亚克隆到所述构建体的Hind3和EcoR1位点。
最好长约6-100个核苷酸并且与衰老诱导脂酶的靶序列互补的寡核苷酸，例如可以用重组核苷酸技术来制备，或者可以从单寡核苷酸或较短的寡核苷酸来合成。自动合成仪适用于化学合成本发明的寡核苷酸和多核苷酸。用于构建按照本发明的重组核苷酸分子的方法公开于Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor PreSS，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，将该文献全部结合到本文中。编码与衰老诱导脂酶序列互补的反义RNA的寡核苷酸可以采用本领域技术人员众所周知的方法来制备。在Maniatis，T.等，Molecular mechanisms in the Control of Gene expression，Nierlich等编著，Acad.Press，N.Y.(1976)中，提供了关于这类方法的细节。
在本发明的一个替代实施方案中，植物内源衰老诱导脂酶的表达的抑制是通过过量表达被导入所述植物细胞中的外源衰老诱导脂酶基因或基因片段而共同抑制的结果。在本发明的该实施方案中，将编码有义方向的衰老诱导脂酶的载体，以本文关于反义分子所述的相同方式导入到所述细胞中。所述衰老诱导脂酶最好与强组成型启动子例如玄参花叶病毒启动子或CaMV35S有效连接。
通过采用本领域已知的任何植物转化法进行DNA转化，可以制备按照本发明制备的转基因植物。植物转化方法包括直接将植物、组织或细胞与根癌农杆菌(Agrobacterium tumerfaciens)一起共同培育或直接感染(Miki等，Meth.in Plant Mol.Biol.and Biotechnology，(1993)，p.67-88)；将基因直接转移到原生质体中或原生质体摄取(Paszkowski等，EMBO J.，122717(1984))；电穿孔(Fromm等，Nature，319719(1986))；粒子轰击(Klein等，BioTechnology，6559-563(1988))；注射到幼苗或植株的分生组织中(De LaPena等，Nature，325274-276(1987))；注射到培养的细胞和组织的原生质体中(Reich等，BioTechnology，41101-1104(1986))。
一般用转化法获得全株。由原生质体、愈伤组织、组织部分或外植体等再生植株。得自衰老诱导脂酶的表达被改变的再生植株的植物部分，例如叶片、花、果实、种子等，包括在本文所用的“植物”的定义中。再生植株的子代、变异体和突变体也包括在“植物”的定义中。
本发明也提供由本发明cDNA分子编码的康乃馨或拟南芥属衰老诱导脂酶蛋白、以及与针对所述康乃馨或拟南芥属蛋白的抗体起交叉反应的蛋白质。这类蛋白质具有图1所示的SEQ ID NO2中所述的氨基酸序列，与针对SEQ ID NO2所述蛋白质的抗体享有交叉反应性，具有SEQ ID NO19中所述的氨基酸序列(示于图14)或者与抗SEQ IDNO19中所述蛋白质的抗体享有交叉反应性。
康乃馨或拟南芥属衰老诱导脂酶蛋白或其功能衍生物最好是用重组技术、任选地与化学合成法联合来产生。在本发明的一个实施方案中，所述衰老诱导脂酶作为由与麦芽糖结合蛋白融合的所述衰老诱导脂酶构成的融合蛋白来表达。编码所述重组融合蛋白的克隆的表达，产生一种具有预期分子量的水解棕榈酸对硝基苯酯、磷脂和甘油三酯(这是脂酶活性的一种指标)的融合蛋白。所述重组衰老诱导脂酶蛋白在用抗康乃馨衰老诱导脂酶的抗体免疫印迹分析后，在蛋白质印迹分析中显示出一个主带。通过用蛋白酶因子Xa处理所述融合蛋白而释放的游离衰老诱导脂酶(50.2Kda)，在蛋白质印迹分析中也与所述衰老诱导脂酶抗体反应(图3)。对所述衰老诱导脂酶氨基酸序列的基序搜索，显示出存在一个可供肉豆蔻酸通过酰胺键共价连接的潜在的N-肉豆蔻酰化位点(图1)(参见Johnson等，Ann.Rev.Biochem.，63869-914(1994)；Towler等，Ann.Rev.Biochem.，5767-99(1988)；和R.J.A.Grand，Biochem.J.，258625-638(1989))。蛋白质基序搜索也表明所述康乃馨衰老诱导脂酶含有一段为保守的脂酶共有基序(表1)的序列ITFAGHSLGA(SEQ ID NO4)。得自各种各样植物的所述保守脂酶共有序列示于以下表中。
表1
本发明的衰老诱导脂酶蛋白在体外测定和原位测定中都显示出具有脂酶活性。关于体外测量，用棕榈酸对硝基苯酯和大豆磷脂(40％磷脂酰胆碱和60％的其它磷脂)作为底物，用分光光度法分别测量反应产物—对硝基苯酚和游离脂肪酸(Pencreac’h和Baratti，1996；Nixon和Chan，1979；Lin等，1983)。此外，采用Nixon和Chan(1979)和Lin等(1983)所述方法的改进方法，通过气相色谱在体外测量脂酶活性。在100μl的终体积中，反应混合物含有100mM Tris-HCl(pH 8.0)、2.5mM底物(三亚油精、大豆磷脂或二亚油酰磷脂酰胆碱)和酶蛋白(100μg)。在5％阿拉伯胶中乳化所述底物，然后将其加入到反应混合物中。为此，将底物溶于氯仿中，加入到阿拉伯胶溶液中，通过超声处理30秒进行乳化。在乳化后，用氮气流蒸发氯仿。反应于25℃进行达至多2小时的不同时间。然后提取反应混合物的脂质，通过TLC纯化游离脂肪酸，将其衍生化并通过GC定量(McKegney等，1995)。
按照Furukawa等(1983)所述并且由Tsuboi等(1996)改进的方法，原位测量脂解酰基水解酶活性。在这后一种测定中，让用编码衰老诱导脂酶的全长cDNA克隆转化的大肠杆菌，在补充有Tween 40或Tween 60(这两种物质都是长链脂肪酸酯)作为唯一碳源的基础盐培养基中生长。因此，供细菌生长用的碳仅在脂肪酸酯被脂酶水解后才可获得。发现用所述衰老诱导脂酶cDNA转化的大肠杆菌在最初的延迟期之后在Tween 40-基础盐培养基和Tween 60-基础盐培养基中生长，而未被转化的大肠杆菌对照培养物不生长，这一发现证实了所编码的重组蛋白的脂酶活性(图5)。也就是说，所述衰老诱导脂酶释放硬脂酸(Tween 60)和棕榈酸(Tween 40)，从而获得供生长用的必需的碳。
本文所述的衰老诱导脂酶蛋白的“功能衍生物”是保留所述衰老诱导脂酶活性或与衰老诱导脂酶的特异性抗体免疫的交叉反应性的至少一部分的衰老诱导脂酶的片段、变异体、类似物或化学衍生物。所述衰老诱导脂酶蛋白的片段是指所述分子的任何亚部分。变异肽可以通过直接化学合成、例如采用本领域熟知的方法进行化学合成来制备。衰老诱导脂酶的类似物是指与所述完整蛋白质或者其片段基本相似的非天然蛋白质。衰老诱导脂酶的化学衍生物含有额外的化学部分，所述化学部分通常不是肽G38或肽片段的一部分。通过使所述肽的靶氨基酸残基与能够与所选侧链或末端残基反应的有机衍生化剂反应，可以将修饰引入到所述衰老诱导脂酶肽或其片段中。
通过培养用本发明的核苷酸序列(有义方向)转化的细胞，让所述细胞合成所述蛋白质，然后从培养基或者从细胞提取物中分离所述蛋白质，所述蛋白质根据所用的克隆方案或者为游离蛋白质或者为融合蛋白，则可以生产按照本发明的衰老诱导脂酶蛋白或肽。另一方面，可以用无细胞系统生产所述蛋白质。Ranu等，Meth.Enzymol.，60459-484，(1979)。
现在已全面描述了本发明，通过参阅以下实施例，可以更容易地理解本发明，提供所述实施例是为了说明，并非用来限制本发明。
实施例1用以分离所述康乃馨脂酶cDNA的植物材料用在温室中生长和维持的康乃馨植株(Dianthus caryophllus L.cv.改良的white Sim)，来分离对应于所述衰老诱导脂酶基因的核苷酸序列。将衰老花瓣(得自不同的发育阶段)形式的花组织收集在缓冲液中，或储藏于-70℃待用。
从恰好在衰老开始之前收集的康乃馨花瓣中，分离胞质脂质颗粒。将康乃馨花瓣(25g/150ml缓冲液)于4℃在匀浆缓冲液(50mMEpps-0.25M山梨醇pH 7.4、10mM EDTA、2mM EGTA、1mM PMSF、1mM苄脒(benzamadine)、10mM氨基-正己酸和4％聚乙烯聚吡咯烷酮)中，在Omnimizer中匀浆45秒，在Polytron匀浆器中再匀浆1分钟。使匀浆通过4层干酪包布过滤，将滤液于4℃以10,000g离心20分钟。上清液以250,000g离心1小时，以分离微粒体膜。在采用Hudak和Thompson，(1997)，Physiol.Plant.，114705-713的方法进行浮选离心(floatation centrifugation)后通过收集脂质颗粒，从后微粒体上清液(post-microsomal supematant)获得所述脂质颗粒。上清液用蔗糖制成10％(w/v)的溶液，将23ml所述上清液注入到60Ti Beckman离心管中，覆盖1.5ml分离缓冲液，于4℃以305,000g离心12小时。用巴氏滴管从分离缓冲液覆盖物中取出所述颗粒。将3ml颗粒悬浮液加样至用无菌PBS(10mM磷酸钠缓冲液pH 7.5加0.85％氯化钠)平衡的Sepharose G-25柱，用无菌PBS洗脱悬浮液。洗脱出含有所述颗粒的外水体积，用Centricon-10滤器(可得自Amicon)将其浓缩至600μg的蛋白质浓度。然后用所述脂质颗粒，在接种300μg所述颗粒的兔子中产生抗体。通过蛋白质印迹分析测试血液的IgG效价。
信使RNA(mRNA)的分离基本上按照Chomczynski和Sachi，Anal.Biochem.，162156-159(1987)所述的方法，从阶段I、II、III或IV的康乃馨花中分离总RNA。简而言之，将15g花瓣组织在液氮中冷冻，在含有4M硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠pH 7.0、0.5％十二烷基肌酸钠(sarkosyl)和0.1M β-巯基乙醇的缓冲液中匀浆30秒。将150ml水饱和的苯酚、30ml氯仿和15ml 2M NaOAc pH 4.0加入到匀浆样品中。将样品以10,000g离心10分钟，取出水层，用150ml异丙醇从中沉淀出核酸。样品以5,000g离心10分钟，并用30ml 4M LiCl洗涤沉淀1次，用30ml氯仿抽提，然后用30ml含有0.2M NaOAc pH 5.0的异丙醇沉淀。将RNA溶于DEPC处理的水中，并储藏于-70℃。
用可得自Promega的PolyA+序列段mRNA分离系统(PolyA+tractmRNA Isolation System)，从总RNA中分离PolyA+mRNA。用PolyA+mRNA作为模板，以便使用可得自Stratagene(La Jolla，Calif.)的ZAPExpresscDNA合成系统进行cDNA合成。
康乃馨花瓣cDNA文库的筛选将用从阶段IV康乃馨花瓣分离的mRNA制备的cDNA文库，稀释至大约5×106PFU/ml，用脂质颗粒抗血清对其进行免疫筛选。用ExAssistHelper Phage/SOLR菌株系统回收阳性cDNA克隆，并且将其在pBluescript噬菌粒(Stratagene)中再环化。也用32P标记的19个碱基对的探针(5’-ACCTACTAGGTTCCGCGTC-3’)(SEQ ID NO5)筛选阶段III康乃馨花瓣cDNA文库。从噬菌体中切下阳性cDNA克隆，用生产商的说明中的方法，将其于pBK-CMV(Stratagene)噬菌粒中再环化。将全长cDNA(1.53kb片段)插入到pBK-CMV载体中。
拟南芥属叶片cDNA文库的筛选通过筛选拟南芥属衰老叶片cDNA文库，分离出一个得自拟南芥的衰老诱导脂酶基因的全长cDNA克隆(1338bp)。用来筛选所述文库的探针是采用衰老叶片文库作为模板通过PCR而获得的。根据GenBank中存在的基因组序列(U93215)设计所述PCR引物。正向引物具有序列5’ATG TCT AGA GAA GAT ATT GCG CGG CGA 3’(SEQID NO20)，而反向引物具有序列5’GAT GAG CTC GAC GGA GCTGAG AGA GAT G 3’(SEQ ID NO21)。将PCR产物亚克隆到Bluescript中供测序用。所用的PCR产物的核苷酸序列和氨基酸序列示于图14中。
质粒DNA的分离、DNA测序用Sambrook等描述的碱裂解法(参见上文)来分离质粒DNA。用双脱氧测序法对全长阳性cDNA克隆进行测序。Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，745463-5467。编译可读框，并用BLAST搜索(GenBank，Bethesda，MD)进行分析，用BCM Search LauncherMultiple SequenceAlignments Pattern-Induced Multiple Alignment Method(参见F.Corpet，Nuc.Acids Res.，1610881-10890，(1987))，得到5种同源性最高的蛋白质与所述编码的基因的推导氨基酸序列的序列比对。用MultiFinder鉴定所述推导氨基酸序列中存在的功能基序。
作为融合蛋白的脂酶的表达用EcoRI和XbaI消化含有全长康乃馨衰老诱导脂酶的噬菌粒pBK-CMV，释放出1.53Kb脂酶片段，将所述片段亚克隆到经EcoRI和XbaI消化的融合载体pMalc(New England BioLabs)中。含有所述衰老诱导脂酶的pMalc载体命名为pMLip，用该载体转化大肠杆菌BL-21(DE3)细胞。
如Sambrook等(参见上文)和Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，Green Pubilishing Associates and Wiley Interscience，New York，(1987)，16.4.1-16.4.3中所述，分离并纯化由pMLip编码的融合蛋白(所述衰老诱导脂酶和麦芽糖结合蛋白的融合体)。简而言之，将用pMLip转化的大肠杆菌BL-21细胞重悬于3ml/g裂解缓冲液(50mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl和1mM EDTA)中，所述裂解缓冲液含有每克细胞8μl 50mM PMSF和80μl 20mg/ml溶菌酶，于室温振荡孵育20分钟。然后加入80μl 5％脱氧胆酸和40单位的DNA酶I，将细胞于室温振荡直至细胞完全裂解。通过离心沉淀细胞碎片，将细胞片碎重悬于2倍体积的裂解缓冲液加8M尿素和0.1mM PMSF中。1小时后，加入7倍体积的缓冲液(50mM KH2PO4、1mM EDTA和50mM NaCl，pH 7.0)以中和悬浮液。用HCl调节细胞悬浮液的pH至pH8.0，然后沉淀细胞碎片。让上清液对20mM Tris缓冲液pH 8.0、100mMNaCl和1mM EDTA于4℃透析过夜。用直链淀粉柱(可得自NewEngland BioLab)纯化麦芽糖结合蛋白-脂酶融合产物(Malip)。用蛋白酶因子Xa(1μg/100μg融合蛋白)切割含有所述融合蛋白的流分，以从融合产物中分离脂酶。通过SDS PAGE凝胶电泳和蛋白质印迹分析所述融合蛋白和经切割的脂酶。用由pMalc编码的麦芽糖结合蛋白作为对照。结果示于图3中。
康乃馨RNA的RNA印迹杂交将10μg从阶段I、II、III、IV的花分离的总RNA在1％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离，并固定于尼龙膜上。运用随机引物试剂盒(Boehringer Mannheim)以32P-dCTP标记所述1.53Kb EcoRI-XbaI脂酶片段，用所述标记片段来探测所述滤膜(7×107cpm)。滤膜用1×SSC、0.1％SDS于室温洗涤1次，用0.2×SSC、0.1％SDS于65℃洗涤3次。将滤膜干燥，并于-70℃对X光胶片曝光过夜。结果示于图4中。
拟南芥属RNA的RNA印迹杂交将10μg从生长2周、3周、4周、5周和6周的拟南芥属叶片中分离的总RNA在1％变性甲醛琼脂糖凝胶上分离，并固定于尼龙膜上。运用随机引物试剂盒(Boehringer Mannheim)以32P-dCTP标记全长拟南芥属衰老诱导脂酶基因，用该标记片段来探测所述滤膜(7×107cpm)。滤膜用1×SSC、0.1％SDS于室温洗涤1次，用0.2×SSC、0.1％SDS于65℃洗涤3次。将滤膜干燥，并于-70℃对X光胶片曝光过夜。
基因组DNA的分离和DNA印迹杂交将新鲜切下的康乃馨花瓣在液氮中冷冻，研磨成粉末，并用抽提缓冲液(0.1M Tris，pH 8.2、50mM EDTA、0.1M NaCl、2％ SDS和0.1mg/ml蛋白酶K)匀浆(2ml/g)，以分离基因组DNA。让匀浆材料于37℃温育10分钟，然后用苯酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)抽提。用NaOAc和异丙醇沉淀DNA。将DNA沉淀溶于1×TE pH 8.0中，再用苯酚抽提，再沉淀，并重悬于1×TE pH 8.0中。
基因组DNA分别用限制性内切核酸酶(Bam HI、XbaI、XhoI、EcoRI、HindIII和SalI)消化，并将经消化的DNA在1％琼脂糖凝胶上分级分离。将经分离的DNA吸印到尼龙膜上，用32P-dCTP标记1.53Kb脂酶片段进行杂交。杂交和洗涤在高严格性条件(68℃)(6×SSC，2×Denhardt试剂，0.1％SDS)以及低严格性条件(于42℃杂交和洗涤)(6×SSC，5×Denhardt试剂，0.1％SDS)下进行。结果示于图6中。正如可以观察到的，脂酶cDNA探针仅检测到一种基因组片段，表明康乃馨脂酶基因为单拷贝基因。
脂酶的酶测定使用棕榈酸对硝基苯酯和大豆磷脂作为外源底物，通过分光光度法分析所述纯化的脂酶融合蛋白的脂解酰基水解酶活性。对于用作对照的单独的麦芽糖结合蛋白，用磷脂作为底物，没有可检测的脂酶活性(表2)。当用棕榈酸对硝基苯酯作为底物并使用单独的麦芽糖结合蛋白时，可检测到少量的对硝基苯酚-预测的脂酶反应产物，反映出棕榈酸对硝基苯酯的商业制剂中的对硝基苯酚的本底水平(表2)。然而，在存在纯化的脂酶融合蛋白的情况下，明显有表现为游离脂肪酸从磷脂中释放以及对硝基苯酚从棕榈酸对硝基苯酯中释放的强脂酶活性(表2)。
表2在大肠杆菌中表达并且通过直链淀粉柱色谱纯化的、麦芽糖结合蛋白和脂酶的融合蛋白的脂解酰基水解酶活性的分光光度计测量结果。
使用两种底物-棕榈酸对硝基苯酯和大豆磷脂。
活性以所生成的产物(来自棕榈酸对硝基苯酯的对硝基苯酚和来自大豆磷脂的游离脂肪酸)来表示。
显示了n＝3重复测定的平均值±SE。
产物蛋白质种类pNPP 游离脂肪酸对硝基苯酚(nmol/mg蛋白/min)(nmol/mg/min)麦芽糖结合蛋白0.71±0.02ND*脂酶融合蛋白 12.01±1.81 46.75±1.24*ND，不可检测在其它实验中，通过气相色谱分析脂酶融合蛋白的酶活性，气相色谱是一种能够定量和鉴定从所述底物释放的游离脂肪酸的技术。用三亚油精、大豆磷脂和二亚油酰磷脂酰胆碱作为底物，在通过气相色谱分析之前，通过薄层色谱纯化脱酯化的脂肪酸。与分光光度测定(表2)一致，用大豆磷脂或二亚油酰磷脂酰胆碱没有检测到单独的麦芽糖结合蛋白的脂酶活性，表明这些底物基本上没有脱酯化的脂肪酸(表3)。然而，当用脂酶融合蛋白作为酶源时，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸从大豆磷脂提取物中脱酯化，并且亚油酸从二亚油酰磷脂酰胆碱中脱酯化(表3)。与磷脂底物相反，在三亚油精中存在可检测水平的游离亚油酸，但游离亚油酸的水平在脂酶融合蛋白存在时显著升高，表明所述脂酶也能够使脂肪酸从甘油三酯中脱酯化(表3)。
表3在大肠杆菌中表达并且通过直链淀粉柱色谱纯化的、麦芽糖结合蛋白和脂酶的融合蛋白的脂解酰基水解酶活性的GC测量结果产物(μg/mg蛋白)1底物 麦芽糖脂酶结合蛋白 融合蛋白三亚油精2亚油酸(18∶2)15.9±0.7533.4±1.58大豆磷脂3棕榈酸(16∶0)ND44.80硬脂酸(18∶0)ND9.68亚油酸(18∶2)ND5.80二亚油酰 亚油酸(18∶2)ND20.00磷脂酰胆碱31让反应进行2小时，在此期间反应并非连续线性的。
2显示了n＝3重复测定的平均值±SE。
3一次实验4不可检测如Tsuboi等，Infect.Immunol.，642936-2940(1996)；Wang等，Biotech.，9741-746(1995)；和G.Sierra，J.Microbiol.and Serol.，2315-22(1957)中所述，在体内测量通过在大肠杆菌中表达脂酶cDNA而获得的所述蛋白质的脂酶活性。将用pMal转化的大肠杆菌BL-21细胞的一个单菌落和另一个用pMLip转化的大肠杆菌BL-21菌落接种到基础盐培养基(pH 7.0)中，所述培养基含有(g/L)K2HPO4(4.3)、KH2PO4(3.4)、(NH4)2SO4(2.0)、MgCl2(0.16)、MnCl2·4H2O(0.001)、FeSO4·7H2O(0.0006)、CaCl2·2H2O(0.026)和NaMoO4·2H2O(0.002)。以1％的浓度加入底物-Tween 40(聚氧乙烯脱水山梨醇一棕榈酸酯)或Tween 60(聚氧乙烯脱水山梨醇一硬脂酸酯)。通过测量600nm的吸光度，监测细菌细胞于37℃振荡下的生长情况(图5)。正如在图5中可以见到的，用pMLip转化的大肠杆菌细胞在最初的延迟期后能够在补充Tween 40/Tween 60的基础培养基中生长。然而，用pMal转化的大肠杆菌细胞在补充Tween的培养基中不生长。
实施例2康乃馨衰老诱导脂酶基因的乙烯诱导阶段II的康乃馨花和康乃馨插条在密封室中用0.5ppm乙烯处理15小时。如下所述，从乙烯处理的阶段II花瓣中和经处理的插条的叶片中、以及从未经处理的康乃馨花和插条的花和叶片中提取RNA。
拟南芥属植物在密封室中用50μM乙烯利处理1天、2天或3天。如下从乙烯利处理的植物叶片中提取RNA。
在液氮中研磨花或叶片(1朵花或5g叶片)。将研磨的粉末与30ml胍缓冲液(4M异硫氰酸胍、2.5mM NaOAc pH 8.5、0.8％β-巯基乙醇)混合。使混合物通过4层干酪包布过滤，并于4℃以10,000g离心30分钟。然后将上清液以26,000g进行氯化铯密度梯度离心达20小时。沉淀的DNA用75％乙醇冲洗，重悬于600μl DEPC处理过的水中，用0.75ml 95％乙醇和30μl 3M NaOAc于-70℃沉淀RNA。10μg的康乃馨RNA或拟南芥属RNA在1.2％变性甲醛琼脂糖凝胶上分级分离，然后转移到尼龙膜上。用随机引发的32P-dCTP标记的全长康乃馨脂酶cDNA(SEQ ID NO1)于4℃探测含有康乃馨RNA的膜过夜。用随机引发的32P-dCTP标记的全长拟南芥属脂酶cDNA来于42℃探测含有拟南芥属RNA的膜过夜。然后，所述膜用含有0.1％ SDS的1×SSC于室温洗涤一次达15分钟，然后用含有0.1％ SDS的0.2×SSC于65℃洗涤3次，每次15分钟。将膜于-70℃对X光胶片曝光过夜。
结果示于图9(康乃馨)和图16(拟南芥属；第1泳道，1天处理；第2泳道，2天处理；第3泳道，3天处理)。正如可以见到的，乙烯利在花和/或叶片中诱导康乃馨脂酶和拟南芥属脂酶的转录。
实施例3用康乃馨脂酶引物产生番茄PCR产物采用根据康乃馨衰老诱导脂酶序列设计的一对寡核苷酸引物，通过嵌套式PCR，产生从番茄叶片获得的番茄基因组DNA的衰老诱导脂酶的部分长度序列。5’引物为一种19聚体，其序列为5’-CTCTAGACTATGAGTGGGT(SEQ ID NO7)；3’引物为一种18聚体，其序列为CGACTGGCACAACCTCCA-3’(SEQ ID NO8)。采用番茄基因组DNA，如下进行聚合酶链式反应反应组分基因组DNA100ngdNTP(各10mM) 1μlMgCl2(5mM)+10x缓冲液5μl引物1和引物2(各20μM 0.5μlTaq DNA聚合酶1.25U反应体积 50μl反应参数94℃3分钟94℃/1分钟、48℃/1分钟、72℃/2分钟，45个循环72℃15分钟。
通过PCR获得的番茄部分长度序列具有核苷酸序列SEQ ID NO6(图10)和图10所示的推导氨基酸序列。所述部分长度序列含有一个在两个编码序列之间插入的内含子(图10，小写字母)。所述番茄序列含有保守的脂酶共有序列-ITFTGHSLGA(SEQ ID NO3)。
所述番茄序列与康乃馨衰老诱导脂酶序列有53.4％的序列同一性，与拟南芥属脂酶有43.5％的序列同一性，拟南芥属脂酶与所述康乃馨序列有44.3％的序列同一性。
实施例4低温对番茄植物中细胞膜完整性的影响将番茄植株于7℃至8℃冷藏48小时，然后恢复至室温达24小时。通过测量电解质渗漏的量(μMho)，评价低温对叶片的影响。
具体地说，切下1g叶片组织置于50ml试管中，用蒸馏水快速冲洗，并加入40ml去离子水。给试管加盖，于室温旋转24小时。以6小时和24小时的间隔，记录对照叶片组织和低温损伤叶片组织的、反映电解质渗漏的电导率(μMho)读数。从图11中可明显看出，在低温损伤叶片组织中，在重新温热期间发生反映膜损伤的电解质渗漏。得自冷藏番茄叶片的RNA的RNA印迹分析从15g未经冷藏的番茄植株叶片(对照)和经冷藏并已经恢复至室温达0小时、6小时和24小时的番茄植株的叶片中，提取总RNA。RNA提取如实施例3中所述方法进行。将10μg得自每种样品的RNA在1.2％变性甲醛凝胶上分离，并转移至尼龙膜上。所述膜用32P-dCTP标记的探针(SEQ ID NO3)探测，然后在与实施例3所述的相同条件下洗涤。结果示于图12中。
正如可以从放射自显影照片(图12B)中见到的，冷藏诱导番茄脂酶基因的表达，并且基因诱导模式与低温损伤叶片中电解质渗漏增加相关(图11)。
实施例5表达反义反向的衰老诱导脂酶基因的转基因植物的产生用含有在双重35S启动子调节下以反义方向表达的全长拟南芥属衰老诱导脂酶基因的二元载体pKYLX71转化农杆菌。通过真空过滤，用这些农杆菌转化拟南芥属植株，用氨苄青霉素选择得自所产生的T0植株的转化种子。
在温室条件下培育T1植株与野生型拟南芥属植株。在规定时间内观察转基因植株和野生型植株之间叶片大小、植株总体大小、种子产量和叶片衰老的差异。差异描述于图17、1 8、19和20中。
实施例6转基因植物中衰老诱导脂酶的产生减少将从4周龄拟南芥属野生型植株叶片和如实施例5所述制备的相应转基因植物的叶片中分离的总蛋白质转移至尼龙膜上，用针对拟南芥属衰老诱导脂酶蛋白产生的抗体来探测。蛋白质印迹示于图21中(第1泳道和第2泳道加载9μg蛋白质，而第3泳道和第4泳道加载18μg蛋白质)。在转基因植株中所述衰老诱导脂酶的表达减少。
序列表<110>Thompson，John E.
Wang，Tzann-WeiHudak，KatalinHong，Yuwen<120>编码植物脂酶的DNA、转基因植物和控制植物衰老的方法<130>10799/14<140>PCT/US01/19385<141>2001-06-19<150>09/610,104<151>2000-07-05<150>09/597,774<151>2000-06-09<160>21<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1537<212>DNA<213>康乃馨(Dianthus caryophyllus)<400>1gcacgagcca ttccaaaact ccttacacca ctcaaaacta ttccaacatg gctgcagaag 60cccaaccttt aggcctctca aagcccggcc caacatggcc cgaactcctc gggtccaacg 120cttgggccgg gctactaaac ccgctcaacg atgagctccg tgagctcctc ctacgctgcg 180gggacttctg ccaggtgaca tacgacacct tcataaacga ccagaactcg tcctactgcg 240gcagcagccg ctacgggaag gcggacctac ttcataagac cgccttcccg gggggcgcag 300accggtttga cgtggtggcg tacttgtacg ccactgcgaa ggtcagcgtc ccagaggcgt 360ttctgctgaa gtcgaggtcg agggagaagt gggataggga atcgaattgg attgggtatg 420tcgtggtgtc gaatgacgag acgagtcggg tggcgggacg aagggaggtg tatgtggtgt 480ggagagggac ttgtagggat tatgagtggg ttgatgttct tggtgctcaa cttgagtctg 540ctcatccttt gttacgcact caacaaacta ctcatgttga aaaggtggaa aatgaggaaa 600agaagagcat tcataaatca agttggtacg actgtttcaa tatcaaccta ctaggttccg 660cgtccaaaga caaaggaaaa ggaagcgacg acgacgatga tgacgacccc aaagtgatgc 720aaggttggat gacaatatac acatcggagg atcccaaatc acccttcaca aaactaagtg 780caagaacaca acttcagacc aaactcaaac aactaatgac aaaatacaaa gacgaaaccc 840taagcataac attcgccggt cacagcctag gcgcgacact atcagtcgtg agcgccttcg 900acatagtgga gaatctcacg accgagatcc cagtcacggc cgtggtcttc gggtgcccaa 960aagtaggcaa caaaaaattc caacaactct tcgactcgta cccaaaccta aatgtcctcc 1020atgtaaggaa tgtcatcgac ctgatccctc tgtatcccgt gaaactcatg ggttacgtga 1080acataggaat cgagctggag atcgactcga ggaagtcgac ctttctaaag gactcgaaaa 1140acccgagtga ttggcataat ttgcaagcaa tattgcatgt tgtaagtggt tggcatgggg 1200ttaaggggga gtttaaggtt gtaaataaga gaagtgttgc attggttaat aagtcatgtg 1260attttcttaa ggaagaatgt ttggttcctc cagcttggtg ggttgtgcag aacaaaggga 1320tggttttgaa taaggatggt gagtgggttt tggctcctcc tgaggaagat cctactcctg 1380aatttgattg ataatatttc atcatgtttt atatttttat aaattttact aaatttacat 1440gacaatttat gggactaagt tacttattta tatgtttatt atatttgaaa tgtgttttaa 1500gttacataaa attgcaatta gttttaaaaa aaaaaaa 1537<210>2<211>447<212>PRT<213>康乃馨(Dianthus caryophyllus)<400>2Met Ala Ala Glu Ala Gln Pro Leu Gly Leu Ser Lys Pro Gly Pro Thr1 5 10 15Trp Pro Glu Leu Leu Gly Ser Asn Ala Trp Ala Gly Leu Leu Asn Pro20 25 30Leu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Leu Leu Leu Arg Cys Gly Asp Phe Cys35 40 45Gln Val Thr Tyr Asp Thr Phe Ile Asn Asp Gln Asn Ser Ser Tyr Cys50 55 60Gly Ser Ser Arg Tyr Glu Lys Ala Asp Leu Leu His Lys Thr Ala Phe65 70 75 80Pro Gly Gly Ala Asp Arg Phe Asp Val Val Ala Tyr Leu Tyr Ala Thr85 90 95Ala Lys Val Ser Val Pro Glu Ala Phe Leu Leu Lys Ser Arg Ser Arg100 105 110Glu Lys Trp Asp Arg Glu Ser Asn Trp Ile Gly Tyr Val Val Val Ser115 120 125Asn Asp Glu Thr Ser Arg Val Ala Gly Arg Arg Glu Val Tyr Val Val130 135 140Trp Arg Gly Thr Cys Arg Asp Tyr Glu Trp Val Asp Val Leu Gly Ala145 150 155 160Gln Leu Glu Ser Ala His Pro Leu Leu Arg Thr Gln Gln Thr Thr His
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agt cac aag aac tta aag 672Gly Asn Lys Glu Phe Arg Asp Glu Val Met Ser His Lys Asn Leu Lys210 215 220atc ctc cat gta agg aac acg att gat ctc tta act cga tac cca ggg 720Ile Leu His Val Arg Asn Thr Ile Asp Leu Leu Thr Arg Tyr Pro Gly225 230 235 240gga ctt tta ggg tat gtg gac ata gga ata aac ttt gtg atc gat aca 768Gly Leu Leu Gly Tyr Val Asp Ile Gly Ile Asn Phe Val Ile Asp Thr245 250 255aag aag tca ccg ttc cta agc gat tca agg aat cca ggg gat tgg cat 816Lys Lys Ser Pro Phe Leu Ser Asp Ser Arg Asn Pro Gly Asp Trp His260 265 270aat ctt cag gcg atg tta cat gtt gta gct gga tgg aat ggg aag aaa 864Asn Leu Gln Ala Met Leu His Val Val Ala Gly Trp Asn Gly Lys Lys275 280 285gga gag ttt aaa ctg atg gtt aag aga agt att gca tta gtg aac aag 912Gly Glu Phe Lys Leu Met Val Lys Arg Ser Ile Ala Leu Val Asn Lys290 295 300tca tgc gag ttc ttg aaa gct gag tgt ttg gtg cca gga tct tgg tgg 960Ser Cys Glu Phe Leu Lys Ala Glu Cys Leu Val Pro Gly Ser Trp Trp305 310 315 320gta gag aag aac aaa gga ctg atc aag aac gaa 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权利要求
1.一种编码衰老诱导脂酶的分离的DNA分子或其与SEQ IDNO1、SEQ ID NO18杂交或与这两者杂交的功能衍生物，其中所述DNA分子在低严格性条件下与SEQ ID NO1、SEQ ID NO18杂交或与这两者杂交。
2.权利要求1的分离DNA分子，其中所述DNA分子具有SEQ IDNO1的核苷酸序列。
3.权利要求1的分离DNA分子，其中所述分离DNA分子含有SEQ ID NO4的核苷酸序列。
4.权利要求1的分离DNA分子，其中所述DNA分子具有SEQ IDNO18的核苷酸序列。
5.一种分离的衰老诱导脂酶或其功能衍生物，所述分离的衰老诱导脂酶由在低严格性条件下与SEQ ID NO1、SEQ ID NO18杂交或与这两者杂交的核苷酸序列所编码。
6.权利要求5的衰老诱导脂酶，其中所述脂酶具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO19的氨基酸序列。
7.一种用于转化植物细胞的载体，所述载体包含(a)反义核苷酸序列，所述反义核苷酸序列(1)与编码衰老诱导脂酶的DNA分子的一条链的一个相应部分基本互补，其中所述编码衰老诱导脂酶的DNA在低严格性条件下与SEQ ID NO1、SEQ IDNO18或这两者杂交，或者(2)与所述编码衰老诱导脂酶的DNA分子所编码的RNA序列的一个相应部分基本互补；和(b)调节序列，所述调节序列与所述反义核苷酸序列有效连接，使得所述反义核苷酸序列在其转化的植物细胞中表达。
8.权利要求7的载体，其中所述调节序列包含一个启动子和一个转录终止区。
9.权利要求7的载体，其中所述调节序列包含一个组成型启动子。
10.权利要求7的载体，其中所述调节序列包含一个植物组织特异性启动子。
11.权利要求7的载体，其中所述调节序列包含一个植物衰老诱导型启动子。
12.权利要求7的载体，其中所述调节序列包含一个病毒启动子。
13.权利要求7的载体，其中所述调节序列包含一个组成型启动子。
14.一种编码RNA分子的反义寡核苷酸或多核苷酸，所述RNA分子与植物衰老诱导脂酶基因的RNA转录物的一个相应部分基本互补，其中所述植物基因在低严格性条件下与SEQ ID NO1、SEQ IDNO18或这两者杂交。
15.权利要求14的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中所述寡核苷酸或多核苷酸包含约6个至约100个核苷酸。
16.权利要求14的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中所述植物基因的编码区具有核苷酸序列SEQ ID NO1。
17.权利要求14的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中所述植物基因的编码区具有核苷酸序列SEQ ID NO18。
18.权利要求14的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中所述植物基因为一种康乃馨基因。
19.权利要求14的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中所述植物基因为一种拟南芥属(Arabidopsis)基因。
20.权利要求14的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中所述植物基因为一种番茄基因。
21.权利要求14的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中所述植物基因为一种嫩荚菜豆基因。
22.权利要求14的反义寡核苷酸或多核苷酸，其中所述反义寡核苷酸或多核苷酸与所述RNA转录物5’非编码区的一个相应部分基本互补。
23.一种载体，所述载体包含(a)一种编码衰老诱导脂酶的DNA分子，其中所述DNA分子在低严格性条件下与SEQ ID NO1、SEQ ID NO18或这两者杂交；和(b)调节序列，所述调节序列与所述DNA分子有效连接，使得所述DNA分子在其转化的植物细胞中表达。
24.一种用权利要求23的载体转化的细菌细胞。
25.一种用权利要求7的载体转化的植物细胞。
26.一种从用权利要求7的载体转化的植物细胞产生的植物及其子代。
27.一种权利要求26的植物、植物部分或植物子代。
28.一种抑制植物中内源衰老诱导脂酶表达的方法，所述方法包括(1)使一种载体整合到所述植物的基因组中，所述载体包含(A)反义核苷酸序列，所述核苷酸序列(i)与编码所述内源衰老诱导脂酶的DNA分子的一条链的一个相应部分基本互补，其中所述编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子与SEQ ID NO1、SEQ ID NO18或这两者杂交，或(ii)与由所述内源衰老诱导脂酶基因所编码的RNA序列的相应部分基本互补；和(B)调节序列，所述调节序列与所述反义核苷酸序列有效连接，使得所述反义核苷酸序列得以表达；和(2)培育所述植物，从而使所述反义核苷酸序列转录，并且所述转录物与所述RNA序列结合，从而抑制所述衰老诱导脂酶基因的表达。
29.权利要求28的方法，其中所述反义寡核苷酸或多核苷酸与之基本互补的所述DNA的相应部分或者所述RNA的相应部分包含5’非编码序列。
30.权利要求28的方法，其中所述抑制导致所述植物的衰老被改变。
31.权利要求28的方法，其中所述抑制导致所述植物对环境胁迫诱导的衰老的抗性增强。
32.权利要求28的方法，其中所述抑制导致所述植物的生物量增加。
33.权利要求28的方法，其中所述抑制导致所述植物的种子产量增加。
34.权利要求28的方法，其中所述调节序列包含一个在所述植物中有活性的组成型启动子。
35.权利要求28的方法，其中所述调节序列包含一个双重35S启动子。
36.权利要求28的方法，其中所述调节序列包含一个在所述植物中有活性的组织特异性启动子。
37.权利要求28的方法，其中所述调节序列包含一个在所述植物中有活性的衰老诱导型启动子。
38.权利要求28的方法，其中所述植物选自结果植物、开花植物、蔬菜、农作物和森林树种。
39.权利要求28的方法，其中所述植物为番茄。
40.权利要求28的方法，其中所述植物为康乃馨。
41.一种抑制植物细胞中一种或多种内源衰老诱导脂酶基因表达的方法，所述方法包括(1)使一种载体整合到所述植物的至少一种细胞的基因组中，所述载体包含(A)一种编码外源衰老诱导脂酶的分离的DNA分子或其与SEQ ID NO1、SEQ ID NO18或这两者杂交的功能衍生物，其中所述DNA分子在低严格性条件下与SEQID NO1、SEQ ID NO18或这两者杂交；和(B)调节序列，所述调节序列与所述DNA分子有效连接，使得由所述DNA分子编码的外源衰老诱导脂酶得以表达；和(2)培育所述植物，从而使所述DNA分子过量表达，并且所述一种或多种内源衰老诱导脂酶基因被外源衰老诱导脂酶所抑制。
42.权利要求41的方法，其中所述调节序列包含一种组成型启动子。
43.一种改变植物中年龄相关衰老和环境胁迫相关衰老的方法，所述方法包括(1)使一种载体整合到所述植物的基因组中，所述载体包含(A)反义核苷酸序列，所述反义核苷酸序列(i)与编码所述内源衰老诱导脂酶的DNA分子的一条链的一个相应部分基本互补，其中所述编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子与SEQ ID NO1、SEQ ID NO18或这两者杂交，或(ii)与由所述内源衰老诱导脂酶基因所编码的RNA序列的至少一个部分基本互补；和(B)调节序列，所述调节序列与所述反义核苷酸序列有效连接，使得所述反义核苷酸序列得以表达；和(2)培育所述植物，从而使所述反义核苷酸序列转录，并且所述转录物与所述RNA序列结合，从而抑制所述衰老诱导脂酶基因的表达。
44.一种转基因植物细胞，所述细胞包含一种权利要求7的载体。
45.一种转基因植物细胞，所述细胞包含一种权利要求23的载体。
46.一种质粒，所述质粒包含一种在原核宿主中有功能的复制系统和一种权利要求14的反义寡核苷酸或多核苷酸。
47.一种质粒，所述质粒包含一种在农杆菌属(Agrobacterium)中有功能的复制系统和一种权利要求14的反义寡核苷酸或多核苷酸。
48.一种植物及其子代，其中所述植物来源于衰老诱导脂酶的表达被抑制或减少的细胞，所述细胞包含权利要求7的载体。
49.一种植物及其子代，其中所述植物得自衰老诱导脂酶的表达被抑制或减少的细胞，其中所述细胞通过下述步骤产生(1)使一种载体整合到所述细胞的基因组中，所述载体包含(A)反义核苷酸序列，所述反义核苷酸序列(i)与编码所述内源衰老诱导脂酶的DNA分子的一条链的一个相应部分基本互补，其中所述编码内源衰老诱导脂酶的DNA分子与SEQ ID NO1、SEQ ID NO18或这两者杂交，或(ii)与由所述内源衰老诱导脂酶基因所编码的RNA序列的一个相应部分基本互补；和(B)调节序列，所述调节序列与所述反义核苷酸序列有效连接，使得所述反义核苷酸序列得以表达；和(2)培育所述植物，从而使所述反义核苷酸序列转录，并且所述转录物与所述RNA序列结合，从而抑制所述衰老诱导脂酶基因的表达。
50.权利要求49的植物及其子代，其中所述植物为番茄。
51.权利要求49的植物及其子代，其中所述植物为康乃馨。
52.一种抑制种子老化的方法，所述方法包括(1)使一种载体整合到植物的基因组中，所述载体包含(A)反义核苷酸序列，所述反义核苷酸序列(i)与编码内源老化诱导脂酶的DNA分子的一条链的一个相应部分基本互补，其中编码所述内源老化诱导脂酶的DNA与SEQ ID NO1、SEQ ID NO18或这两者杂交，或(ii)与从编码内源老化诱导脂酶的DNA分子转录的RNA序列的一个相应部分基本互补；和(B)调节序列，所述调节序列与所述反义核苷酸序列有效连接；和(2)培育所述植物，从而使所述反义核苷酸序列转录，并且所述转录物与所述RNA序列结合，从而抑制所述老化诱导脂酶基因的表达。
53.一种增加植物种子产量的方法，所述方法包括(1)使一种载体整合到所述植物的基因组中，所述载体包含(A)反义核苷酸序列，所述反义核苷酸序列(i)与编码内源老化诱导脂酶的DNA分子的一条链的一个相应部分基本互补，其中编码所述内源老化诱导脂酶的DNA与SEQ ID NO1、SEQ ID NO18或这两者杂交，或(ii)与从编码内源老化诱导脂酶基因的DNA分子转录的RNA序列的一个相应部分基本互补；和(B)调节序列，所述调节序列与所述反义核苷酸序列有效连接；和(2)培育所述植物，从而使所述反义核苷酸序列转录，并且所述转录物与所述RNA序列结合，从而抑制所述老化诱导脂酶基因的表达。
全文摘要
通过使编码衰老诱导的脂酶的基因或基因片段以反义取向整合到植物基因组中，实现调节植物中衰老的表达。鉴定出康乃馨和拟南芥属编码衰老诱导的脂酶的基因，并用所述核苷酸序列来改变转基因植物的衰老。
文档编号C12N15/09GK1484705SQ01814288
公开日2004年3月24日 申请日期2001年6月19日 优先权日2000年6月19日
发明者J·E·汤普森, T·-W·王, K·胡达克, Y·洪, J E 汤普森, ね, 锟 申请人:森尼斯科技术公司