专利名称：：分离类固醇受体的非基因引向活性和基因引向活性的方法
技术领域：
：本发明涉及类固醇信号转导领域，并且，具体披露了一种从类固醇基因引向作用中分离类固醇非基因引向作用的方法，以及用于筛选能够诱导非基因引向作用而又不会明显诱导类固醇基因引向作用或者能够诱导类固醇基因引向作用而又不会明显诱导类固醇非基因引向作用的化合物的方法。本发明还首次披露了某些类固醇能够通过与不相关的类固醇受体结合诱导非基因引向作用。
背景技术：
：由于分子结构的相似性和蛋白序列的同源性，业已将多种蛋白归入类固醇核受体超家族。所述类固醇蛋白受体家族包括至少64种已知的受体(Cell，Vol97，161-163，April16，1999)，包括雌激素受体的α和β形式(ERα和ERβ)，与受体1和受体2相关的雌激素受体(ERR-1和ERR-2)，雄激素受体(AR)，孕酮受体(PR)，视黄酸受体(以及相关的孤独受体RORα、RORβ、和RORγ)；糖皮质素受体(GR)，盐皮质素受体(MR)，维生素D受体，神经活性受体，farnesoidX受体(FXR)，肝脏X受体(LXRα和LXRβ)，甲状腺激素受体A和B(它能结合三碘甲状腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4))，COUP-TF受体，蜕皮激素受体，过氧化物酶体增殖体激活的蛋白受体(PPAR，包括PPARα、PPARγ和PPARδ)，孕烷X(PXR)，胆酸结合家族，以及嵌合受体和孤独受体。传统上业已接受的观点是，类固醇能结合细胞内受体，并在随后调节转录和蛋白合成，通常是通过能诱导基因活性的类固醇/受体复合物调节的。尽管类固醇受体主要是作为配体激活的转录因子而为众人所知，最近，业已鉴定了类固醇的多种非常快速的(例如，数秒至大约15分钟)作用，这种作用与由快速作用所产生的基因引向作用吻合。Falkenstein等最近对所观察到的类固醇激素的非基因引向作用作了综述，参见“MultipleActionsofSteroidHormones-AFocusonRapid，NongenotropicEffects”，Pharmacol.Rev52513-555，2000。还可以参见McEwen，B.S.和Alves，S.E.，Endocr.Rev.20，279-307，1999。业已将上述多种快速作用归因于雌激素或其他类固醇与推测的膜结合受体相互作用的能力(Watson等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，20，9-19，1999)。不过，目前还不清楚所述非基因引向作用是由与介导所述类固醇的转录作用的蛋白相同或是不同的蛋白介导的。另外，还完全不了解类固醇的非基因引向作用与典型受体的转录活性之间的关系。例如，Falkenstein等在他们的2000年的综述文章中认为(i)提出了所有类固醇包括相关化合物如维生素D和甲状腺激素的非基因引向类固醇效应和相关的不同受体的证据。这些即时效应的生理和临床相关性很大程度上仍不清楚....Falkenstein，etal.，page514，摘要。(ii)与基因引向类固醇作用相反，非基因引向类固醇效应主要特征是其对转录和蛋白合成的抑制不敏感，代表了其快速作用起始的最明显的实验证据(从数秒到数分钟)。这些快速效应可能通过药理特性与内源类固醇受体不同的受体介导....仅仅药理特性的区别还不足以支持非基因引向作用的不同受体蛋白假说；但是，这一重要问题在IIIB部分提及，在Falkenstein，etal.，page516中给出了经典和非经典受体蛋白参与非基因引向信号的各种证据。(iii)一系列类固醇非基因引向效应似乎通过推定的非经典膜受体介导，这些受体的药理特性与经典细胞内类固醇受体完全不同。Falkenstein，page520。(iv)简而言之，大量证据表明至少某些1α，25-(OH)2D3诱导的快速效应是通过与属于类固醇和甲状腺激素超家族的细胞内受体不同的膜受体介导的。Falkensteinetal.，page521。(v)显然，非基因引向类固醇作用的许多方面仍然需要继续深入研究，仍然缺少理解它们的关键线索。这也包括仍未完成的起始快速类固醇信号作用的推定膜受体的克隆。结合类固醇的膜蛋白有初步的发现(mPR，annexin)，但是还没有明确证明哪一种是负责快速作用的类固醇膜受体。显然，克隆到这种受体是一个显著进步，但是，应当注意的是，生理、病理定义以及类固醇作用的新方面的临床关系是另外一个极为重要的目标。这并不需要受体的克隆，当然，克隆到受体无疑会方便临床研究。Falkensteinetal.，Oage546。具体地讲，Falkenstein等引用了以下文献作为对推测的介导类固醇的非基因引向作用的独立受体的证据。(i)在缺少相应经典受体的细胞或组织(例如MR和PR剔除动物细胞)中存在非基因引向类固醇效应和经典拮抗剂的快速类固醇效应的不敏感(Falkenstein，etal.，page520)；和(ii)观察到RU-28318组单快速信号作用并不表明醛甾酮的快速效应通过经典受体介导，这是不太可能的，因为MR剔除小鼠中，醛甾酮仍然具有非基因引向活性(Falkenstein，etal.，page535)。作为一种非限定性例子，业已将六种性类固醇用于治疗骨流失，但其作用的内在机制尚不清楚。性类固醇的基因引向作用是通过核受体蛋白介导的，所述蛋白能分辨雌激素和雄激素信号转导，并且分别以性别专一性形式分布在女性和男性靶器官中。除了典型的雌激素受体(ERα)之外，很多组织能表达第二种形式的雌激素受体(ERβ)。所述类固醇与其相应的关联受体的结合，会导致所述蛋白的构象改变，这使得它能够通过与其他转录因子的蛋白-蛋白相互作用直接或间接与转录器相互作用。在过去若干年中，业已在多种类型的细胞上报导了雌激素的多种作用，这种作用表现出这样一种快速的作用方式，使得它不像是基因引向作用机制(Lieberherr，M.，B.etal.，1993，J.BoneMiner.Res.81365-1376；Aronica，S.M.etal.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA918517-8521；Endoh，H.，H.etal.，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.235-99-102；McEwen，B.S.和S.E.Alves.，1999，Endocr.Rev.20279-307；Chen，Z.etal.，1999，J.Clin.Invest.103401-406；Castoria，G.etal.，1999，EMBOJ.182500-2510；Toran-Allerand，C.D.etal.，1999，Front.Neuroendocrinol.2097-121；Norfleet，A.M.etal.，1999，Endocrinology1403805-3814)。业已将上述快速作用的很多种都归因于雌激素与ER的膜结合形式相互作用的能力(Collins，P.和C.Webb.，1999，Nat.Med.51130-1131；Pietras，R.J.和C.M.Szego.，1999，Nat.Med.51330；Razandi，M.etal.，1999，MolEndocrinol.13307-319；Norfleet，A.M.etal.，1999，Endocrinology1403805-3814；Watson，C.S.和B.Gametchu，1999，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.2209-19。不过，尚未确定该位点的确切性质和亚细胞定位，包括它是否是典型的受体或者是否定位于膜双层中，或者所述膜结构被称为小窝(Okamoto，T.，A.etal.，1998，J.Biol.Chem.2735419-5422；Schlegel，A.etal.，1999，J.Biol.Chem.27433551-33556)或胞质溶胶。ER和AR在成年人骨稳态中的作用业已在增殖的软骨细胞、成骨细胞、骨髓基质细胞(Eriksen，E.F.etal.，1988，Science241-84-86；Komm，B.S.etal.，1988Science241-81-84；Ernsr，M.etal.，1991，Mol.Endocrinol.51597-1606；Benz，D.J.etal.，1991，J.BoneMiner.Res.6531-541；Benz，D.J.etal.，1991，Endocrinology1282723-2730；Monaghan，B.A.etal.，1992，Clin.Orthop.277-280；Bellido，T.，G.etal.，1993，Endocrinology133553-562；Ben-Hur.H.，J.etal.，1993，Calcif.TissueInt.5391-96；Kusec，V.etal.，1998，JClin.Endocrinol.Metab.832421-2428；Zennedy，J.etal.，1999，Bone249-16；Nilsson，L.O.etal.，1999，JClin.Endocrinol.Metab.，84-370-373)、以及破骨细胞及其祖细胞(Oursler，M.J.etal.，1993，Ann.Med.25361-371)上令人信服地证实了ERα和ERβ或AR(雄激素受体)的受体。很显然，与再生的组织相比，成骨细胞和破骨细胞中ERα、ERβ和AR的表达水平要低至少10倍。另外，所述受体在骨细胞中不存在性别专一性分布，因为与雌性和雄性生殖器官相比，业已在来自雄性和雌性的细胞中发现了类似水平的ER或AR(Benz，D.J.etal.，1991，J.BoneMiner.Res.6531-541；Benz，D.J.etal.，1991，Endocrinology1282723-2730；Komm，B.S.etal.，1988，Science241-81-84；Braidman，I.etal.，2000，Bone26423-427)。另外，存在看上去矛盾的证据，一方面表明雌激素是雄性和雌性成体骨骼中的骨活性性类固醇，而另一方面，非芳构化的雄激素可以使雌性骨骼免受雌激素缺乏的负面影响(Riggs，B.L.etal.，1998，J.BoneMiner.Res.13763-776；VandERschueren，D.etal.，1998，Bone23391-394)。实际上，具有突变型雌激素受体雄性的骨质量的减少(Smith，E.P.etal.，1994；N.Engl.J.Med.3311056-1061)和在用雌激素治疗之后两个具有P-450芳香酶缺陷的雄性的骨质量的增加(Carani，C.etal.，1997，N.Engl.J.Med.33791-95；Bilezikian，J.P.etal.，1998，N.Engl.J.Med.339599-603)的临床观察业已表明，通过雄激素的外周芳构化所产生的雌激素对于男性的骨质量维持来说同样是重要的(Riggs，B.L.etal.，1998，J.BoneMiner.Res.13763-776)。不过，在以上所有三种情况下，在患有雌激素缺陷的年轻男性体内，尽管雄激素足够，降低的骨质量和增加了的骨标记含量，很可能是未能获得最大骨质量的结果，因为在发育期间有缺陷的骨骼生长以及这些个体从来没有经过青春期的事实——不损失骨质量，这种情况是骨质疏松的常见形式。作为对于这一观点的支持，由于在X染色体上的雄激素受体基因的突变所产生的患有彻底雄激素不敏感性的人类具有降低了的骨质量，尽管具有较高的雌激素水平(Schwartz，B.D.etal.，1999，EndrocrineSociety81stAnnualMeeting93(Abstr))。另外，包括非芳构化雄激素的诸如DHT的雄激素在体外和体内对骨细胞的生物合成活性，以及产生和死亡具有相同的作用，至少在啮齿类动物上是这样(Bellido，T.etal.，1995，J.Clin.Invest.952886-2895；Weinstein，R.S.etal.，1997，Endocrinology1384013-4021；Weinstein，R.S.和S.C.Manolagas，2000，AmJ.Med.108153-164；Weinstein，R.S.etal.，1997，Endocrinology1384013-4021；Weinstein，R.S.etal.，1999，J.Bone.Miner.Res.14S451(Abstr))；并且，更重要的是，可以防止卵巢切除女性的骨流失(VandERschueren，D.E.etal.，1992，Endocrinology1302906-2916；Tobias，J.H.etal.，1994，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.267E853-E859；Coxam，V.etal.，1996，Bone，19107-114；Lea，C.K.和A.M.Flanagan，1999，J.Endocrinol.160111-117)。到目前为止，尚不能解释为什么与生殖组织相比骨细胞只能表达少量的ER和AR，或者解释ER和AR在男性和女性骨细胞之间的性别分布的缺乏，或者解释在女性和男性体内的任一种类型的性类固醇的令人困惑的效力。由于分别被命名为αERKO和βERKO的在小鼠中ERα或ERβ剔除的模棱两可的骨骼表型，进一步扰乱了对有关任一种类固醇在女性和男性体内的性别非专一性效力，以及性类固醇受体在所述影响方面的作用的理解的状态(Couse，J.F.和K.S.Korach，1999，Endocr.Rev.20358-417)。αERKO或ERα和ERβ(双-ER-剔除小鼠-DERKO)表现出弱骨表型，其特征是在雌性和雄性上股骨长度和直径的降低，但仅仅是在股骨中骨矿物密度有可疑的少量的和局部的减少。另一方面，ERβ剔除型(βERKO)小鼠表现出较长的股骨，并且在雌性上表现出增加了的皮质骨膜周长，但在雄性上没有变化(Windahl，S.H.etal.，1999，JClin.Invest.104895-901)。不过，与野生型对照相比，体积pQCT或组织形态测定未能发现上述剔除小鼠的任何变化，这表明骨矿物密度的可疑的改变(通过DEXA表示)极有可能是较小的骨骼所导致的。重要的是，在αERKO和DERKO小鼠上的股骨长度的降低与患有性腺发育不足的患者的长骨长度的增加正相反(包括上述情形，Smith，E.P.etal.，1994，N.Engl.J.Med.3311056-1061；Carani，C.etal.，1997，N.Engl.J.Med.33791-95；Bilezikian，J.P.etal.，1998，N.Engl.J.Med.339599-603)，它会导致骺骨闭合的推迟。因此，ERKO小鼠上的微小的表型变化(如果有的话)可能与雌激素对骨骼生长的影响的伤失相关，但是它不能作为有关雌激素对青春期或成年人骨骼重塑作用的信息。业已在芳香酶缺陷(ArKO)小鼠上观察到了模棱两可的骨骼表型(Oz，O.K.etal.，2000，JBoneMiner.Res15507-514)。ArKO雄性而又不是雌性具有降低了的长骨生长。另一方面，在雌性体内具有较高的转化，但在雄性体内具有较低的转化。这一结果与雌激素是任一种性别的骨活性性类固醇的观点有很大不同。重要的是，作为以上两个男性患者之一(进行过骨骼活组织检查)，以及患有雌激素依赖型芳香酶缺陷的雄性和雌性小鼠体内作为成骨细胞数量或存活的替代，壁厚在用雌激素治疗之后能够得到纠正(VandERschueren，D.etal.，1998，Bone23391-394)。另一方面，通过破骨形成和成骨形成变化体现的转化，以及因此由细胞数量体现的转化，在雌性上是雌激素依赖型的(表现出仅次于雌激素缺陷型的预期的提高)，但在雄性上是雄激素依赖型的(表现出仅次于雄激素过量的预期的抑制作用)。类似地，雄激素抗性雄性大鼠和小鼠(睾丸雌性化的一种模型，Tfm)具有较小的骨长度，但具有正常的小梁骨体积，尽管事实上它们具有较高的雌激素浓度(由于其非功能性雄激素的芳构化所致)(Young，C.Y.etal.，1989，Endocrinology124771-775；Gaspar，M.L.etal.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA888606-8610；Murphy，L.和P.J.O′Shaughnessy，1991，J.Endocrinol.1301443-449；Uesugi，Y.etal.，1992，Anat.Rec.234541-548；VandERschueren，D.etal.，1993，J.BoneMiner.Res.8801-809)。由阿肯色大学的委托董事会申请的WO00/20007披露了一种通过服用一种化合物增加宿主骨质量的方法，所述化合物能以至少108M-1的结合常数结合雌激素α或β受体(并且在该实施方案的一方面，其中，所述化合物不是雌激素)或结合雄激素受体(在该实施方案的一方面，其中，所述化合物不是雄激素)，并且能以不超过17β-雌二醇5％的水平诱导基因转录活性，同时诱导细胞外信号调控激酶(ERK)活性的增强。WO00/20007提出了一种能保持雌激素或雄激素增强ERK活性的能力，而又不会提高雌激素或雄激素的转录活性，以便在所述雌激素或雄激素上结合一种取代基或成分，从而阻止它穿透细胞，并因此转移到细胞核以激活基因活性。McDonnell及其同事业已分离了若干种小的(11-19个氨基酸)肽，在共有ERE(雌激素反应因子)实验时能结合，这种肽能结合ER的不同位点，并且能选择性地抑制ERα，而又不是ERβ介导的转录，反之亦然(Norris，J.D.etal.，1999，Science285744-746；Chang，C.etal.，1999，Mol.CellBiol.198226-8239)。筛选方法若干种用于筛选能向类固醇受体那样起作用或者通过类固醇受体起作用的试剂的方法为本领域所公知。例如，授予Evans等的US5071773披露并要求保护用于确定一种被怀疑是激素受体的蛋白是否能刺激转录的方法，以及用于确定一种化合物是否是受体蛋白的功能性配体的方法。同样授予Evans等的US5298429披露了一种生物测定方法，用于通过分析一种化合物对能表达编码激素受体蛋白或其变体的非内源DNA和编码与一种报导基因连接的操纵性激素反应因子的DNA的培养细胞的转录的影响，确定有关化合物是否是激素受体蛋白的功能性配体。一般生物测定方法包括授予Housey的US5877007，该专利披露了一种用于化合物的生物测定方法，所述化合物能在细胞中以比对照细胞高的水平激活蛋白表达，以便由该化合物激活的蛋白能诱导所述细胞的表型改变。以美国家庭用品公司的名义申请的WO00/37681披露了用于鉴定对ERα或ERβ专一的受体调节剂的生物测定方法。所披露的测定方法使用两种细胞，其中，第一种细胞含有编码功能性ERα和响应性报导基因结构的DNA，第二种细胞含有ERE报导结构和ERβ。可以筛选化合物，以便选择性地激活或抑制在表达ERα或ERβ细胞中的转录。US5643720披露了用于筛选能结合retinoid受体以便形成能结合AP-1的复合物并抑制DNA结合的配体的方法。US5702914披露了用于确定一种化合物是否是retinoid受体的功能性配体的生物测定方法，包括在遗传学修饰过的细胞中测定一种报导基因结构的转录。US5863733披露了一种使用报导基因结构在遗传学改变过的细胞中确定一种化合物是否能专一性调节感兴趣的基因的转录活性的方法。US5563036披露了用于筛选能抑制转录因子与核酸结合的化合物的方法，包括在用测试化合物处理时检测固体基质上标记过的转录因子的存在或缺乏。US5854004披露了用于筛选能调节受体依赖性信号转导途径的化合物的方法，包括监测一种报导基因在细胞中的转录，所述细胞进行过遗传学修饰，以便含有一种报导基因，和决定肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)和二乙酰甘油的浓度改变的DNA调控序列。授予Lauffer等的US5639597披露了一种用于确定一种化合物是否是一种受体的配体的无细胞测定方法。授予Dixit的US6060238披露了一种用于筛选能抑制细胞程序死亡的试剂的方法，与牛痘细胞因子反应修饰过的A进行比较。由McDonnell等申请的US5506102披露了利用A型孕酮受体筛选类固醇细胞内介导的转录的拮抗剂的方法。US5834213披露了一种通过用与质膜受体相互作用的化学信号处理，监测转录反应的组织培养筛选系统。所述组织培养筛选系统包括一种细胞系，该细胞系含有一种膜受体，一种靶基因和一种选自类固醇受体、维生素受体和孤独受体的特殊受体。由Novalon制药公司申请的WO99/54728披露了一种根据一种测试化合物与能改变一种受体的构象的肽或核酸配体的相互作用，预测该化合物是否能调节该受体在多细胞生物中的生物学活性的方法。将所述数据与具有已知生物学活性的参考化合物的指纹进行比较。其他有关参考文献授予Labrie的US5362720；5545634；5846960和5567695披露了用于治疗或预防易感温血动物发生乳腺癌和子宫内膜癌、骨质疏松和子宫内膜异位的方法，包括服用小剂量的孕酮或具有雄激素活性和弱的雄性化活性的其他类固醇衍生物。在一种主要实施方案中，所述方法包括通过服用至少一种对雄激素受体的Ki值低于2×10-8的雄激素类固醇激活所述雄激素受体，在低于每升3.0纳摩尔的浓度下能达到由雄激素受体介导的对人乳腺癌JR-75-1细胞生长的抑制作用的半最大值，并且在低于50nM的血清浓度下没有可见的雄性化活性。其中，所述每一种雄类固醇都是以足够低的剂量服用的，以便保持累计的血清浓度低于每升50nM。授予Simpkins的US5843934声称可以给患者服用具有弱的性别相关活性的雌激素，以便延缓对雄性或雌性的骨质疏松的负面影响。934号专利没有强调如何筛选能提高骨质量的化合物，相反，却介绍了如何抑制骨流失的作用。在一种优选实施方案中，所使用的雌激素是17α-雌二醇。934号专利声称，其发明人不理解17α-雌二醇发挥细胞保护作用的机制，但是暗示它能发挥直接的保护作用(可能与通过受体作用发挥作用相反)。产生直接保护作用的一个例子是调节葡萄糖的调控(参见934号专利的第7和第8栏)。由佛罗里达大学研究基金公司所申请的WO98/22113披露了使用雌激素化合物的α或β异构体对与缺血事件相关的群体产生细胞保护作用的方法。US5859001披露了将在四环环戊菲化合物结构上具有末端苯酚基团的菲雌激素化合物用于对细胞产生神经保护作用的用途。由佛罗里达大学研究基金公司所申请的WO98/31381披露了一种增强多环酚化合物对一种细胞群体的细胞保护作用的方法，包括以下步骤使用多环酚化合物和抗氧化剂的组合物，以便获得增强的效果。所披露的一种组合是谷胱甘肽和雌激素。由阿肯色大学的委托董事会申请的WO99/61044披露了将头蛋白或头蛋白拮抗剂用作调控成骨细胞发生和破骨细胞发生的治疗剂，以便控制骨重塑的用途。同样授予阿肯色大学的委托董事会的WO22/20625披露了糖皮质素诱导的骨疾病是由于骨细胞生成和死亡速度的改变所致，并且服用糖皮质素能增强成熟的成骨细胞和骨细胞的细胞程序死亡，并降低骨生成速度和骨矿物密度。另外，授予阿肯色大学的委托董事会的WO00/19823披露了在以间歇形式给小鼠服用人副甲状腺激素1-34[hPTH(I-34)]时能在体内对成骨细胞产生抗细胞程序死亡作用。同一份专利申请还提供了牛PTH(1-34)[bPTH(I-34)]能在体外抑制糖皮质素诱导的成骨细胞和骨细胞的细胞程序死亡的证据。授予阿肯色大学的委托董事会的WO00/20625披露了服用糖皮质素年增强成熟成骨细胞和骨细胞的细胞程序死亡，并降低骨形成速度和骨矿物密度，同时伴随着在骨髓中出现缺陷型成骨细胞和破骨细胞形成。通过以上说明可以看出，尽管在朝着理解类固醇信号转导的方向上取得了显著进步，但是还缺乏对类固醇是如何介导非基因引向和基因引向作用的了解。本发明的一个目的是诱导选择性类固醇作用。本发明的另一个目的是提供一种治疗与类固醇和/或类固醇受体相关的疾病的方法。本发明的另一个目的是提供一种用于筛选能诱导选择性类固醇反应的化合物的转基因动物。本发明的再一个目的是提供一种筛选可用于诱导选择性类固醇反应的化合物的方法。发明概述本发明涉及对理解类固醇非基因引向作用的机制及其与基因引向作用的关系的基本发现。业已发现(i)类固醇非基因引向作用和基因引向作用可以通过相同的类固醇受体介导；(ii)这两种作用都是配体诱导的；(iii)非基因引向作用的发生是由于配体结合结构域的配体诱导活性所致，这种作用可能是快速并且是松散的结合；(iv)基因引向作用的发生，是由于类固醇受体的DNA结合结构域的配体诱导的活性所导致的，它通常是一种较慢的、较强的相互作用的结果；和(v)配体相互作用的非基因引向作用可以从配体相互作用的基因引向作用中分离，这样就可以实施选择性的反应。根据上述前卫发现，提供了一种从类固醇受体的类固醇基因引向作用中分离类固醇非基因引向作用的方法。在一种实施方案中，本发明包括一种用于选择性地诱导类固醇非基因引向作用的方法，该方法包括让所述受体与一种能与该受体的配体结合结构域充分相互作用的化合物接触，以便导致所述受体介导一种非基因引向作用，而又不会激活DNA-结合结构域，这样就不会产生明显的基因引向作用。在另一种实施方案中，提供了一种用于选择性地诱导类固醇基因引向作用的方法，该方法包括让所述受体与一种能充分激活所述受体的DNA受体的结合结构域的化合物接触，以便导致所述受体介导一种基因引向作用，而又不会导致显著的非基因引向作用。如果所述作用低于天然类固醇作用的10％的话，就认为这种配体不会诱导“显著的”或“实质性的作用，并且，在一种优选实施方案中，所述作用低于天然类固醇作用的5％，1％或0.1％。非基因引向活性的典型形式包括，但不限于细胞内二级信号系统、信号转导途径、蛋白激酶信号转导途径、MAP激酶信号转导途径、Src/Shc/ERK信号转导途径的激活；细胞内钙浓度的调控；分泌；细胞形态学的改变；细胞运动性；细胞骨骼重排；和细胞程序死亡。在本发明的另一方面，可以服用一种选择性诱导化合物(包括，但不限于肽或蛋白或配体拮抗剂)，所述化合物能与类固醇受体的内源或外源配体竞争所述受体上的结合位点，以便掩盖配体-结合相互作用的活性。作为一种例子，可以服用一种肽或配体拮抗剂，所述肽或配体拮抗剂能结合配体结合结构域，以便抑制配体诱导非基因引向作用。在另一种实施方案中，可以服用一种肽或配体拮抗剂，所述肽或配体拮抗剂能结合所述受体的配体结合结构域，以便抑制配体诱导基因引向作用。所述选择性诱导化合物可以通过干扰与DNA受体的相互作用或抑制受体与其他转录调节剂发生蛋白-蛋白相互作用直接或间接抑制所述类固醇受体的转录活性。另外，所述选择性诱导化合物可以作为具有至少两种成分的复合物存在，以便在所述成分混合时所述复合物能使类固醇受体的基因引向活性失活，并激活类固醇受体的非基因引向活性。在另一方面，提供了一种用于诱导类固醇受体的选择性作用的方法，该方法包括服用有效量的能通过诱导受体的构象或构型改变使所述受体的DNA结合域失活的化合物。在本发明的另一方面，提供了一种用于诱导类固醇受体的选择性作用的方法，该方法包括服用有效量的能通过诱导所述蛋白的构象或构型改变使仅由所述受体的配体结合域介导的功能失活的化合物。在另一种实施方案中，提供了一种用于筛选能诱导类固醇非基因引向作用而又不会明显诱导类固醇基因引向作用或者能够诱导类固醇基因引向作用而又不会明显诱导类固醇非基因引向作用的化合物的方法。该方法可以通过多种方式实施，包括(1)评估所述化合物适当地结合所述类固醇受体的配体结合结构域，而又不会明显激活所述类固醇受体的DNA结合结构域，或者适当地激活所述类固醇受体的DNA结合结构域，而又不会明显激活仅由所述类固醇受体的配体结合结构域介导的功能的能力；和(2)测定所述测试化合物的生物学活性，以便评估其诱导目标非基因引向作用而又不会明显诱导基因引向作用的能力，或其诱导目标基因引向作用而又不会诱导明显的非基因引向作用的能力。上述第一个步骤可以通过分子模拟完成，优选借助于计算机进行。另外，可以将仅包括配体结合结构域但缺乏功能性DNA结合结构域的所述受体的修饰形式用于确定所述测试化合物是能激活配体结合结构域或是DNA结合结构域。例如，所述修饰形式可以在转化过的细胞中表达。可以对体外培养的细胞进行遗传学改变，以便表达类固醇受体或其遗传学变体。可以使用已知技术对基因引向活性进行定量，如测定在一种测试化合物的作用下所产生的总的mRNA量或对一种或多种类固醇调控基因专一的mRNA的量。筛选可以在体内或体外进行。另外，可以将步骤1和2组合成在体外基于细胞的测定中简单地分析能选择性地诱导非基因引向或基因引向作用而又不会明显诱导其他作用的化合物。可将本发明用于选择性地实施类固醇受体家族的任何成员的反应，包括雌激素受体的α或β形式(ERα或ERβ)，与雌激素受体相关的受体1和受体2(ERR-1和ERR-2)、雄激素受体(AR)、孕酮受体(PR)、视黄酸受体(以及相关的孤独受体RORα、RORβ、和RORγ)、糖皮质素受体(GR)、盐皮质素受体(MR)、维生素D受体，神经活性受体，farnesoidX受体(FXR)，肝脏X受体(LXRα和LXRβ)，甲状腺激素受体A和B(它能结合三碘甲状腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4))，COUP-TF受体，蜕皮激素受体，过氧化物酶体增殖体激活的蛋白受体(PPAR，包括PPARα、PPARγ和PPARδ)，孕烷X(PXR)，胆酸结合家族，以及嵌合受体和孤独受体。在本发明的另一种实施方案中，业已发现类固醇可以通过与除了它的典型结合受体以外的类固醇受体相互作用诱导非基因引向作用。在本发明这一方面的一种非限定性说明中，业已发现雌激素受体(ERα和ERβ)和雄激素受体(AR)能够以类似地效力向成骨细胞和骨细胞传送抗细胞程序死亡信号，而无论结合配体是雌激素还是雄激素。另外，业已发现雌激素和雄激素作用的受体依赖型抗细胞程序死亡机制可以与所述受体的转录活性机械分离，对于成骨细胞/骨细胞来说，所述作用包括细胞外信号调控激酶(ERKs)的激活。类固醇能够利用以前被认为不相关的类固醇受体诱导非基因引向作用这一事实，现在可用以解释在本发明背景部分异常披露的发生在缺乏相应的典型受体的细胞或组织中的非基因引向类固醇作用。这样，所述类固醇是利用一种不相关的类固醇受体来介导所述非基因引向作用的。作为一种说明，通过检测在蛋白的各种结构域上具有突变的人雌激素受体克隆，业已确定了决定非基因引向作用的受体的部位(例如，抗细胞程序死亡作用)。在本文中，术语抗细胞程序死亡结构域表示所述蛋白上的在与诸如雌激素和雄激素的抗细胞程序死亡诱导配体结合之后能在成骨细胞和骨细胞上介导抗细胞程序死亡作用的部位。业已发现，雌激素受体的抗细胞程序死亡结构域位于配体结合部分(结构域E)。业已专一性地发现，当一种合成肽(αII)结合在配体结合-雌激素受体的结构域E上时(已知该结构域能有效抑制雌激素受体的转录活性)，对随后的配体结合雌激素受体的抗细胞程序死亡作用没有影响。用ERα作原型，随后研究了性类固醇受体的抗细胞程序死亡活性所需要的结构域与转录活性所需要的结构域是相同或者是不同(图3A)。为此，比较了ERα的若干种突变体对抑制细胞程序死亡的作用。业已证实所述突变体在瞬时转染到人细胞中时能产生预期的蛋白(Schodinetal.，1995；Krausetal.，1997；Ekenaetal.，1996)。业已证实，包括二聚化(D)和配体结合结构域(E)或仅包括E结构域的突变体也能产生预期的蛋白，并且缺乏转录活性。与ERα一样，缺乏完整N-末端转录激活功能(AF-1)结构域的突变体ΔA/B、或其中的丝氨酸被丙氨酸所取代的突变体(S104、106、118A)，或缺乏F结构域的突变体ΔF、或缺乏大部分DNA结合结构域(185-251号氨基酸)的突变体ΔDBD都能传送E2-结合ER的抗细胞程序死亡信号。另外，上述所有突变体都表现出减弱的或没有ERE介导的基因转录活性。LeGoff等，J.Biol.Chem.269，4458-4466；mcInerney等，J.Biol.Chem.271，24172-24178；Katzenellebogen。更令人吃惊的是，在缺少整个AF-1和DNA结合结构域(DE)的缺失突变体上保留了所述配体传送抗细胞程序死亡信号的能力；在仅包括AF-2/配体结合结构域(E)的缺失突变体上同样保留了这种能力。相反，缺乏激素结合能力的ER突变体L525A和缺乏C-末端转录激活功能(AF-2)的S554fs丧失了输送抗程序细胞死亡信号和所述蛋白的转录活性的能力。随后确定了E结构域的抗细胞程序死亡活性是否取决于它在特定亚细胞区室的定位(图3B)。通过将所述结构域与分别含有质膜或核定位序列的强化的氰荧光蛋白融合，将该结构域导向HeLa细胞的质膜或细胞核。正如通过落射荧光显微术所发现的，非导向ERα和非导向E在细胞核和细胞质中表现出类似地氰荧光分布，这表明消除ER的所有配体结合结构域不会改变其亚细胞分布。不过，结合适当的导向序列分别获得了膜或核ECFP融合蛋白的预期的亚细胞定位，从相同细胞中的氰荧光和红色荧光的分布可以看出这一点。主要将E结构域导向质膜不会改变其传递配体诱导的抗细胞程序死亡信号的能力，这种融合蛋白的抗细胞程序死亡活性与E结构域或完整长度ERα的活性相同这一实现证明了这一点。但是，截然不同的是，仅仅将E结构域导向细胞核会导致其抗细胞程序死亡活性的完全丧失。本文所提供的附图对本发明的实施例进行了说明，但不是要限定本图1是证实在体内和体外用性类固醇控制成骨细胞和骨细胞细胞程序死亡的一系列曲线图。A.在小鼠上施行卵巢切除术或睾丸切除术之后成骨细胞和骨细胞程序死亡的优势。线条是每一组4-5只动物的平均值±SD。*p＜0.05。B.用10-11M-10-6M的E2或DHT处理颅盖成骨细胞1小时，然后用促-细胞程序死亡剂表鬼臼毒吡喃葡糖苷(50μM)处理6小时。通过台盼兰染色定量死亡细胞的百分比。将在缺乏类固醇的条件下由表鬼臼毒吡喃葡糖苷诱导的细胞程序死亡设定为100％。线条表示三次重复测定的平均值±SD，E2或DHT处理过的培养物与使用用于每一种处理的独立的单向ANOVAs媒介物相比的*p＜0.05。C和D.用10-8ME2或DHT处理颅盖衍生的成骨细胞或MLO-Y4骨细胞，并通过添加表鬼臼毒吡喃葡糖苷、地塞米松(10-7M)或TNFα(1nM)诱导细胞程序死亡。按B中的方法定量死亡细胞的百分比。通过双向ANOVA分析结果。在比较每一个试剂组中的预处理和将每一种试剂与用于特定预处理的媒介物进行比较时*p＜0.05。E.用不同浓度的E2或DHT处理结合在胶原凝胶中的OB-6成骨细胞24小时。对随机挑选的视场中的总共200个细胞进行评估。在媒介物对照中，有32.3±2.5％的细胞是程序死亡的。E2或DHT处理过的培养物与将独立的单向ANOVAs用于每一种处理的媒介物相比*p＜0.05。图2是表示E2或DHT的抗细胞程序死亡作用受ER或AR拮抗剂抑制并且可以通过ER(α或β)或AR介导的一系列曲线图。A.用ER拮抗剂ICI182780(10-7M)或用AR拮抗剂氟他胺(10-7M)预处理颅盖成骨细胞30分钟，然后与10-8ME2或DHT培养1小时。然后添加表鬼臼毒吡喃葡糖苷，并按图1B所示定量程序死亡的细胞。结果以在缺乏类固醇的条件下的表鬼臼毒吡喃葡糖苷诱导的细胞程序死亡的百分比形式表示，将其设定为100％。线条表示三次重复测定的平均值±SD，通过ANOVA分析与媒介物相比*p＜0.05。B.用ERo、ERβ、AR、VDR或RXR表达载体或空载体(ev)连同Nuc-EGFP表达载体一起瞬时转染HeLa细胞。在转染之后16小时，用所标明浓度的E2、DHT或1，25-二羟基维生素D3(1，25-D3)处理细胞1小时，然后用表鬼臼毒吡喃葡糖苷处理6小时。通过检查200个-500个转染的(或荧光)细胞的细胞核形态学确定程序死亡的细胞。将在缺乏类固醇的条件下(-)培养的细胞中由表鬼臼毒吡喃葡糖苷诱导的细胞程序死亡设定为100％。结果以表鬼臼毒吡喃葡糖苷诱导的细胞程序死亡的百分比形式表示(平均值±SD)。通过ANOVA分析与在缺乏类固醇的条件下用表鬼臼毒吡喃葡糖苷处理的细胞相比*p＜0.05。图3表示ERα对E(配体结合)结构域的抗细胞程序死亡活性的定位以及通过核导向消除。A.用Nuc-EGFP和各种ERα突变体的表达载体共转染HeLa细胞，然后用10-8ME2处理1小时，接着用表鬼臼毒吡喃葡糖苷处理6小时。B.将完整长度的ERα与非导向ECFP融合(ERα-ECFP)。将ERα的E结构域与非导向ECFP(E-ECFP)、膜导向ECFP(E-Mem-ECFP)或核导向ECFP(E-Nuc-ECFP)融合。所述融合蛋白中的每一种与核导向红色荧光蛋白(Nuc-ERFP)一起在HeLa细胞中表达，并且通过落射荧光显微术分析其亚细胞分布。左侧和中间的图片表示分别用氰或红色过滤器组获得的相同细胞的显微照片；线条＝15微米。在该实验中将Nuc-ERFP用于定量细胞程序死亡，因为其发射光很容易与氰融合蛋白的发射光区分开。用10-8ME2或媒介物处理转染的细胞1小时，然后用表鬼臼毒吡喃葡糖苷处理6小时。按图2所示方法对3A和3B中的细胞程序死亡进行定量。线条表示3次重复测定的平均值±SD。通过ANOVA分析与没有用表鬼臼毒吡喃葡糖苷处理的细胞相比*p＜0.05。图4表示ER和AR的抗细胞程序死亡活性是通过Src/Shc/ERK信号转导途径介导的。A.用E2或DHT培养MLO-Y4细胞2、5或15分钟，或者用PD98059(50μM)或pp1(10μM)培养25分钟，然后用E2或DHT培养5分钟。获得细胞裂解物，并且用抗ERK1/2或抗磷酸ERK1/2(p-ERK1/2)抗体通过Western印迹分析分析蛋白。为了测定细胞程序死亡，在添加E2或DHT之前，用媒介物PD98059或PP1培养细胞30分钟。30分钟之后，添加表鬼臼毒吡喃葡糖苷，并且在6小时之后按图1B所示测定所述细胞程序死亡。B.如图1B所述，在来自Src+/+与Src-/-小鼠的胚胎成纤维细胞中比较E2或DHT对细胞程序死亡的作用。按在实验方法部分所披露的方法进行RT-PCR。C-E.用Nuc-EGFP和编码完整ERα或其E结构域的表达载体或仅用AR(C，左图)或与dnMEK(C，右图)一起转染HeLa细胞；缺乏激酶活性的Src突变体(SrcK-)，缺乏SH2结构域的Src突变体(SrcΔSH2)，或缺乏SH3结构域的Src突变体(SrcΔSH3)(D)；或使用ERα和wtShc，或dnShc突变体Y239F/Y240F/Y317F(ShcFFF)、Y317F(ShcYYF)或Y239F/Y240F(ShcFFY)(E)。线条表示三次重复测定的平均值±SD。通过ANOVA分析与在没有类固醇的条件下培养的细胞相比*p＜0.05。图5表示用肽分离ERα介导的转录与抗细胞程序死亡作用，和ERα-介导的与ERβ介导的作用。A.单独用ERα表达载体或与携带由SV40启动子启动的α-II肽与GAL4DNA结合结构域的融合体的载体一起瞬时转染HeLa细胞。另外，为了进行转录研究，用ERE-luc或IL-6-luc转染细胞；或为了进行细胞程序死亡实验用EKFP-nuc转染。线条表示三次重复测定的平均值±SD，并且示出了在媒介物(ER2-)或10-8ME2(E2+)中具有细胞程序死亡特征的转染细胞的ERE-luc的折叠刺激、IL-6-luc的折叠抑制，或百分比。通过ANOVA分析与媒介物处理的细胞相比*p＜0.05。B.单独用ERα或ERβ或与携带2X293或2XF肽的表达载体一起转染HeLa细胞。线条表示三次重复测定的活性的平均值±SD(ERE-luc、IL-6-luc、或抗细胞程序死亡)，该测定是在用所标明的受体和肽转染的细胞以及单独用受体转染的细胞中针对E2(10-8M)的反应作出的测定。将具有所述载体但没有所述肽的细胞中的E2诱导的活性确定为100％。通过ANOVA分析与仅用受体转染的细胞相比*p＜0.05。C.仅用携带GRIP肽的载体或与ERα一起转染HeLa细胞。线条表示三次重复测定的平均值±SD。通过ANOVA分析与媒介物处理过的细胞相比*p＜0.05。图6表示通过合成的配体分离ER的非基因引向活性和基因引向活性。A.对于由C3-介导的转录来说，用C3-luc和ERα转染HeLa细胞，并且用所标明浓度的estren或吡唑处理。线条表示统一化的β-半乳糖苷酶活性的相对荧光素酶单位(RLU)的平均值±SD。通过ANOVA分析与用空载体(ev)转染的细胞相比p＜0.05。按例1B所述方法在颅盖衍生的成骨细胞中评估estren和吡唑的抗细胞程序死亡活性。通过ANOVA分析与用表鬼臼毒吡喃葡糖苷处理的细胞相比*p＜0.05。B.用所标明浓度的不同配体培养MLO-Y4细胞5分钟，并且按例4A所述方法评估ERK磷酸化。图7表示用于配体诱导的抗细胞程序死亡与性类固醇受体的典型基因引向活性分离的推荐模型。三幅草图表示在与配体相互作用之前和之后受体蛋白的构象状态，所述相互作用是实现基因引向或抗细胞程序死亡反应所必须的。失活的未连接的受体在中间用灰色表示。在右侧用兰色示出了由与配体的相互作用诱导的构象改变，这种配体优选能诱导转录活性(例如，图6中的吡唑)。在左侧用紫红色示出了通过与一种配体相互作用诱导的构象改变，所述配体优选能诱导所述配体的抗细胞程序死亡活性(例如，图6中的estren)。绿色圆圈和绿色菱形表示两种配体；请注意与结合位点的完全或不完全结合。两种不同类型的配体对受体的结合(ka)和解离(kd)速度通过不同宽度和长度的箭头表示。当然，诸如E2的配体能诱导两种构象。尽管在所述抗细胞程序死亡模型上，示出了受体和Src之间的直接接触，还可以通过接头蛋白连接这两种分子之间的相互作用。在底部示出了向基因引向构象发展(兰色线)或向抗细胞程序死亡构象发展(紫红色线)的处在失活的未连接状态的受体蛋白(虚线)的相应的能量水平。在能量示意图中的不连续的垂直轴线用于表示大于这两种活性之间所需要的能量差异量的量。图8是为了由Dox诱导αII和293肽的表达而同时导入同一只小鼠的两种转基因结构的示意图。图9A是表示用于Cre重组酶的成骨细胞专一性表达的Dox诱导型系统的产生和功能鉴定。通过由OC-2启动子操纵的Cre激活ROSA26基因座。“SA”表示用原始ROSA26基因座的剪接受体位点。图9B是表示在体外Dox诱导的Cre表达激活的凝胶。用Tet-OG2-Cre结构瞬时转染Ob-6细胞，然后用0.5毫克/毫升Dox或媒介物处理24小时。收获细胞，并且通过RT-PCR分析评估Cre表达。泳道1含有大小标记。泳道2表示用空的媒介物和Dox处理的细胞。泳道3表示含有OG-2-rt-A-Cre，但不含Dox的细胞。泳道4表示含有OG-2-rt-A-Cre和Dox的细胞。泳道4含有用Dox诱导的OG-2-rt-A-Cre质粒。图10是表示将氟氧外显子3导向含有小鼠ERα基因的外显子3和4的86kb的基因引向基因座的示意图。发明详述本发明涉及对理解类固醇非基因引向作用的机制及其与基因引向作用的关系的基本发现。业已发现(i)类固醇非基因引向作用和基因引向作用可以通过相同的类固醇受体介导；(ii)这两种作用都是配体诱导的；(iii)非基因引向作用的发生是由于配体结合结构域的配体诱导活性所致，这种作用可能是快速并且是松散的结合；(iv)基因引向作用的发生，是由于类固醇受体的DNA结合结构域的配体诱导的活性所导致的，它通常是一种较慢的、较强的相互作用的结果；和(v)配体相互作用的非基因引向作用可以从配体相互作用的基因引向作用中分离，这样就可以实施选择性的反应。根据上述前卫发现，提供了一种从类固醇受体的类固醇基因引向作用中分离类固醇非基因引向作用的方法。在一种实施方案中，本发明包括一种用于选择性地诱导类固醇非基因引向作用的方法，该方法包括让所述受体与一种能与该受体的配体结合结构域充分相互作用的化合物接触，以便导致所述受体介导一种非基因引向作用，而又不会激活DNA-结合结构域，这样就不会产生明显的基因引向作用。在另一种实施方案中，提供了一种用于选择性地诱导类固醇基因引向作用的方法，该方法包括让所述受体与一种能充分激活所述受体的DNA受体的结合结构域的化合物接触，而又不会激活其配体结合结构域，以便诱导非基因引向作用。在本文所披露的本发明全部的一个方面，所述受体不是雌激素受体，或者不是孕酮受体。I.定义本文所说的雌激素化合物表示具有发情激素生理学活性的四环类固醇化合物，或其结合的和酯化的衍生物，或具有相同化学组成和结构但不具有其活性形式的生物学活性的衍生物，因为它具有与活性形式不同的立体化学。雌激素的非限定性例子包括溴帕雌烯、氯烯雌醚、己二烯雌酚、表美雌醇、马烯雌酮、烟丙雌二醇、estropipate、炔雌醇、磷雌酚、hydroxyesetrone、美雌醇、雌二醇、雌三醇、结合的和酯化的雌激素、雌酮、聚雌二醇、普罗雌烯、奎雌醇、炔雌醚、己烯雌酚和折仑诺。本文所说的雄激素化合物表示可以在睾丸或肾上腺皮质中产生的四环类固醇化合物，或能起到调节男性第二性征作用的合成激素，或其具有相同化学组成和结构但不具有其活性形式的生物学活性的衍生物，因为它具有与活性形式不同的立体化学。非限定性例子包括勃地酮、氯司替勃、达那唑、曲他雄酮、环硫雄醇、乙雌烯醇、氟甲睾酮、甲酰勃龙、夫拉扎勃、美雄烷、美睾酮、美雄酮、美替诺龙、甲睾酮、南诺龙、诺乙雄龙、羟勃龙、羟甲烯龙、普拉睾酮、奎勃龙、雄诺龙、司坦唑、睾酮和去甲雄三烯醇酮。众所周知，雌激素和雄激素具有手性碳，因此可以表现出多种立体化学构型。例如，通常17β羟基雌激素具有生物学活性，而17α羟基雌激素对性征的影响非常小(并且能诱导很少的激素样基因转录激活)。对于本说明书来说，包括生物学活性或生物学失活或较少活性结构在内的任何立体化学构型都可以使用，只要该化合物满足本发明的特殊项目的标准就行。来自Steraloids公司(WiltonH.H.)的题为“类固醇”的目录，提供了超过3000种类固醇的清单，其中具有多种雌激素和雄激素衍生物。该目录可以通过与所述公司联系获得，并且目前还可以通过互联网获得http//www.steraloids.com.。人们可以从该文库中挑选和购买化合物，这些化合物都可以通过商业渠道获得，因此能方便地得到并且用于本发明中进行评估。本文所说的术语“类固醇”表示能结合一种传统上被称为“蛋白的核激素受体家族”的任何配体。根据本发明的发现，现在已经了解到所述受体不一定是核的，并且，实际上当它位于细胞核外面或位于细胞膜上时，可以诱导非基因引向作用，并且也许可以在细胞核中诱导非基因引向作用。所述核受体家族的每一个成员的名称披露于Cell，97161-163，1999中，并且再现于下面的表中。该文献的作者是核受体命名委员会。通过分析人基因组和蛋白组证实，现在已知在人蛋白家族中有至少60个成员，有关内容发表在Nature409860-921，2000上。该文献的作者是国际人类基因组测序协会。在一种实施方案中，所述受体具有锌指和配体结合结构域，正如在Nature上面发表的文章所提到的。表1.核受体的推荐命名<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="825">亚家族和组NR/基因常用名保藏号1A1B1C1D1E1F1G1H1I1J1K2A2B2C2D2E2F3A3B3C4A5A5B6A0A0BNR1A1NR1A2NR1B1NR1B2NR1B3NR1C1NR1C2NR1C3NR1D1NR1D2NR1D3NR1E1NR1F1NR1F2NR1F3NR1F4NR1G1NR1H1NR1H2NR1H3NR1H4NR1I1NR1I2NR1I3NR1I4NR1J1NR1K1NR2A1NR2A2NR2A3NR2A4NR2B1NR2B2NR2B3NR2B4NR2C1NR2C2NR2D1NR2E1NR2E2NR2F1NR2F2NR2F3NR2F4NR2F5NR2F6NR3A1NR3A2NR3B1NR3B2NR3C1NR3C2NR3C3NR3C4NR4A1NR4A2NR4A3NR4A4NR5A1NR5A2NR5A3NR5B1NR6A1NR0A1NR0A2NR0A3NR0A4NR0A5NR0B1NR0B2TRα，c-erbA-1，THRATRβ，c-erbA-2，THRBRARαRARβ，HAPRARγ，RARDPPARαPPARβ，NUC1，PPARδ，EAARPPARγREVERBα，EAR1，EAR1AREVERBβ，EAR1β，BD73，RVR，HZF2E75E78，DR-78RORα，RZRαRORβ，RZRβRORγ，TORHR3，DHR3，MHR3，GHR3，CNR3，CHR3CNR14ECRUR，OR-1，NER1，RIP15，LXRβRLD1，LXR，LXRαFXR，RIP14，HRR1VDRONR1，PXR，SXR，BXRMB67，CAR1，CARαCAR2，CARβDHR96NHR1HNF4HNF4GHNF4BDHNF4，HNF4DRXRARXRB，H-2RIIBP，RCoR-1RXRGUSP，Ultraspiracle，2C1，CF1TR2，TR2-11TR4，TAK1DHR78TLL，TLX，XTLLTLL，TaillessCOUP-TFI，COUPTFA，EAR3，SVP44COUP-TFII，COUPTFB，ARP1，SVP40SVP，COUP-TFCOUP-TFIII，COUPTFGSVP46EAR2ERαERβERR1，ERRαERR2，ERRαGRMRPRARNGFIB，TR3，N10，NUR77，NAK1NURR1，NOT，RNR1，HZF-3，TINORNOR1，MINORDHR38，NGFIBCNR8，C48D5SFI，ELP，FTZ-F1，AD4BPLRH1，xFF1rA，xFF1rB，FFLR，PHR，FTFFTZ-F1DHR39，FTZF1BGCNF1，RTRKNI，KnirpsKNRL，KnirpsrelatedEGON，Embryonicgonad，EAGLEODR7TrithoraxDAX1，AHCHSHPM24748X04707X06538Y00291M57707L02932L07592L40904M24898L31785X51548U01087U04897Y08639U16997M90806U13075U13074M74078U07132U22662U09416J03258X75163Z30425AF00932U36792U19360X76930Z49826Z49827U70874X52773M84820X66225X52591M29960L27586U36791S72373M34639X12795M64497M28863X63092X70300X12794X03635U57439X51416X51417X02225M16801M15716M20132L13740X75918D38530U36762U13076D88155U93553M63711L06423U14666X13331X14153X16631U16708M31617S74720L76571</table></tables>注其中，各组包括在脊椎动物中具有常见的共生同源关系的高度相关的基因(例如，RARA、RARB和RARG)。由于不同的启动子使用或剪接、或不同的翻译起始而由相同基因产生的不同基因产物保留了术语同种型。一般，类固醇受体具有高度可变的N-末端反式激活结构域(NT-TAD)，随后是由两个锌指组成的高度保守的DNA结合结构域(DBD)，该结构域包括一个铰链区以及一个中度保守的C-末端配体结合结构域(CT-LBD)。所述部分要么已经对靶类固醇受体进行了作图，或者可以用已知技术方便地作图。术语“骨质量”表示骨矿物的质量，并且通常是通过复式能量X射线吸收测定(DEXA)测定的。术语“骨强度”表示对机械力的抗性，并且可以通过已知方法测定，包括脊椎压迫强度或长骨的三点弯曲。术语“骨品质”表示没有非矿物化的骨基质过渡积累的正常胶原取向，并且可以通过任何已知方法测定，包括未脱钙骨骼的组织形态学测定。术语“骨抗再吸收剂”表示能够通过抑制重塑或破骨细胞活性和/或寿命，抑制骨再吸收的化合物。术语“骨质稀少”表示低于一定阈值的骨质量，它会损害结构的完整性。本文所使用的术语“嵌合体”表示通过融合两种不同受体的遗传学序列产生的DNA链。类固醇受体由DNA结合结构域和配体结合结构域组成。在所述嵌合受体中，DNA结合结构域由来自一种受体的遗传密码组成，而配体结合结构域由来自另一种受体的遗传密码组成。将这两种结构域融合成嵌合受体。所述结构域可以来自不同的物种，或者来自相同物种的不同受体。本文所使用的术语“孤独受体”表示具有大约69种受体的家族，业已通过氨基酸序列同源性鉴定了这些受体。孤独受体具有在DNA结合结构域上高度保守的氨基酸序列，并且具有位于该受体的配体结合结构域上的共有序列。它们之所以被称为孤独受体，是因为尚未鉴定到能直接激活该家族任何成员的配体。孤独受体的一个例子是鸡卵白蛋白上游启动子转录因子(COUP-TF)。在本文中，术语“代谢性骨病”、“畸形骨病”或“牙病”被定义为以骨骼和/或牙齿的骨质量降低和/或结构破坏为特征的病症。在本文中，术语“细胞程序死亡”表示按程序发生的细胞死亡，通过形态学标准和末端尿苷脱氧核苷转移酶缺口末端标记(TUNEL)染色检测其特征是细胞核分裂和细胞收缩。在本文中，术语“宿主”表示含有任何类固醇受体的细胞或动物。在本文中，术语“转基因”表示通过人工方法插入动物基因组，特别是活的哺乳动物的细胞中的或者是将要插入的遗传学材料。“转基因动物”表示具有作为染色体外因子存在于其细胞的一部分中或稳定整合到其种系DNA中(即整合在其大部分或所有细胞的基因引向序列中)的非内源(即异源)核酸序列的非人动物，通常是哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)。通过对诸如所述宿主动物的胚胎或胚胎干细胞进行遗传学操作，将异源核酸导入所述转基因动物的种系中。“结构”表示为了表达特定核苷酸序列或为了用于构建其他重组核苷酸序列而制备的重组核酸，通常为重组DNA。“可操作地连接”表示以这样的方式连接一种DNA序列和一种调控序列，以便当合适的分子(例如，转录激活蛋白)结合在所述调控序列上之后就能进行基因表达。“可操作地插入”表示将感兴趣的核苷酸序列放置在靠近一种能指导所导入的感兴趣的核苷酸序列转录和翻译的核苷酸序列位置上(即有利于诸如由APP序列所编码的多肽产生)。“信号转导途径响应转录控制单位”表示一种调控DNA序列，当转录激活蛋白响应信号转导途径的激活而结合在所述调控序列上时可以进行基因表达，所述转导途径包括，但不限于MAPK、κB细胞的核因子(NFκB)、JNK、AP-1、p38K、PKA、PKC、PI3-K或NFAT信号转导途径。可以通过所述信号转导途径上的蛋白激酶将信号转导途径响应转录控制单位的转录激活蛋白磷酸化，以便所述激活蛋白能够结合在DNA调控序列上。典型的信号转导途径响应转录控制单位包括，但不限于血清响应元件、激活蛋白1、cAMP响应元件、E-框DNA结合元件、E2FDNA结合元件、糖皮质素响应元件、热激响应元件、干扰素γ激活序列、干扰素刺激的响应元件、活化T细胞的核因子、κB细胞的核因子、p53响应元件、Rb响应元件、和STAT3响应元件。在本文中，术语“报导基因”表示在被一种测试化合物或化学信号激活转录之后能产生蛋白的多种基因中的任意一种。测定该蛋白，以便确定转录的效果。报导基因可操作地与一种启动子连接，该启动子受诸如雌激素响应元件之类的类固醇响应元件的控制。“类固醇受体的非基因引向活性”表示仅快速激活所述受体的配体结合结构域，而没有必要激活该受体的DNA结合结构域或者与附属的转录调节物相互作用。“类固醇受体的基因引向活性”表示转录的配体依赖型调控，这种调控对转录和翻译抑制剂敏感。“与类固醇受体相关的疾病”表示由类固醇或类固醇受体的异常的高浓度或低浓度、可利用性，突变或其他失衡引起的，或以此为特征的任何人类或动物失调、症状、或疾病。“异常高”表示足以表现出生理学、生物化学、物理学、精神或心理学作用的高出正常水平以上的任何差异。“异常低”表示足以表现出生理学、生物化学、物理学、精神或心理学作用的低于正常水平的任何差异。在一种优选实施方案中，与类固醇受体相关的疾病是这样一种疾病，其中，额外的类固醇转录活性是不需要的，如绝经后的女性所患的疾病。与类固醇受体相关的疾病可能与能表达类固醇激素受体的任何细胞、组织、器官或系统相关。II.选择性诱导类固醇响应的方法根据上述前卫发现，提供了一种从类固醇受体的类固醇基因引向作用中分离类固醇非基因引向作用的方法。在一种实施方案中，本发明包括一种用于选择性地诱导类固醇非基因引向作用的方法，该方法包括让所述受体与一种能与该受体的配体结合结构域充分相互作用的化合物接触，以便导致所述受体介导一种非基因引向作用，而又不会激活DNA-结合结构域，这样就不会产生明显的基因引向作用。在另一种实施方案中，提供了一种用于选择性地诱导类固醇基因引向作用的方法，该方法包括让所述受体与一种能充分激活所述受体的DNA受体的结合结构域的化合物接触，以便导致所述受体介导一种基因引向作用，而又不会导致显著的非基因引向作用。如果所述作用低于天然类固醇作用的10％的话，就认为这种配体不会诱导“显著的”或“实质性的作用，并且，在一种优选实施方案中，所述作用低于天然类固醇作用的5％，1％或0.1％。非基因引向活性的典型形式包括，但不限于细胞内二级信号系统、信号转导途径、蛋白激酶信号转导途径、MAP激酶信号转导途径、Src/Shc/ERK信号转导途径的激活；细胞内钙浓度的调控；分泌；细胞形态学的改变；细胞运动性；细胞骨骼重排；和细胞程序死亡。在本发明的另一方面，可以服用一种选择性诱导化合物(包括，但不限于肽或蛋白或配体拮抗剂)，所述化合物能与类固醇受体的内源或外源配体竞争所述受体上的结合位点，以便掩盖配体-结合相互作用的活性。作为一种例子，可以服用一种肽或配体拮抗剂，所述肽或配体拮抗剂能结合配体结合结构域，以便抑制配体诱导非基因引向作用。在另一种实施方案中，可以服用一种肽或配体拮抗剂，所述肽或配体拮抗剂能结合所述受体的配体结合结构域，以便抑制配体诱导基因引向作用。所述选择性诱导化合物可以通过干扰与DNA受体的相互作用或抑制受体与其他转录调节剂发生蛋白-蛋白相互作用直接或间接抑制所述类固醇受体的转录活性。另外，所述选择性诱导化合物可以作为具有至少两种成分的复合物存在，以便在所述成分混合时所述复合物能使类固醇受体的基因引向活性失活，并激活类固醇受体的非基因引向活性。在另一方面，提供了一种用于诱导类固醇受体的选择性作用的方法，该方法包括服用有效量的能通过诱导受体的构象或构型改变使所述受体的DNA结合域失活的化合物。在本发明的另一方面，提供了一种用于诱导类固醇受体的选择性作用的方法，该方法包括服用有效量的能通过诱导所述蛋白的构象或构型改变使仅由所述受体的配体结合域介导的功能失活的化合物。在本文中，术语构象改变表示所述受体三维结构的改变。术语构型改变蛋白结构的化学改变。可将本发明用于选择性地实施类固醇受体家族的任何成员的反应，包括在本文的表1中所列举的类固醇受体，特别是雌激素受体的α或β形式(ERα或ERβ)，与雌激素受体相关的受体1和受体2(ERR-1和ERR-2)、雄激素受体(AR)、孕酮受体(PR)、视黄酸受体(以及相关的孤独受体RORα、RORβ、和RORγ)、糖皮质素受体(GR)、盐皮质素受体(MR)、维生素D受体，神经活性受体，farnesoidX受体(FXR)，肝脏X受体(LXRα和LXRβ)，甲状腺激素受体A和B(它能结合三碘甲状腺原氨酸(T3)和甲状腺素(T4))，COUP-TF受体，蜕皮激素受体，过氧化物酶体增殖体激活的蛋白受体(PPAR，包括PPARα、PPARγ和PPARδ)，孕烷X(PXR)，胆酸结合家族，以及嵌合受体和孤独受体。III.由类固醇通过不相关的受体诱导非基因引向作用在本发明的另一种实施方案中，业已发现类固醇可以通过与除了它的典型结合受体以外的类固醇受体相互作用诱导非基因引向作用。在本文中，术语“不相关的受体”表示所述载体通过它不能诱导基因引向作用的受体。因此，尚不知道载体通过不相关的受体起作用，因为，根据定义，它不能通过不相关的受体诱导基因引向作用，并且对于细胞非基因引向作用也不十分清楚。因此，本发明包括一种选择性地诱导类固醇受体的非基因引向作用的方法，包括让所述受体与一种不相关的类固醇接触，它能充分结合并激活所述类固醇配体结合结构域的功能，以便获得需要的效果。本发明所提供的筛选方法中的任意一种方法都可用于确定一种特定的类固醇是否能通过以前被认为是不相关的类固醇受体诱导定向非基因引向作用。在本发明这一方面的一种非限定性说明中，业已发现雌激素受体(ERα和ERβ)和雄激素受体(AR)能够以类似地效力向成骨细胞和骨细胞传送抗细胞程序死亡信号，而无论结合配体是雌激素还是雄激素。另外，业已发现雌激素和雄激素作用的受体依赖型抗细胞程序死亡机制可以与所述受体的转录活性机械分离，对于成骨细胞/骨细胞来说，所述作用包括细胞外信号调控激酶(ERKs)的激活。类固醇能够利用以前被认为不相关的类固醇受体诱导非基因引向作用这一事实，现在可用以解释在本发明背景部分异常披露的发生在缺乏相应的典型受体的细胞或组织中的非基因引向类固醇作用。这样，所述类固醇是利用一种不相关的类固醇受体来介导所述非基因引向作用的(当然所述作用根本就不是受体介导的情况除外)。IV.用于筛选一种化合物的选择性诱导类固醇响应能力的方法提供了一种用于筛选能诱导类固醇非基因引向作用而又不会明显诱导类固醇基因引向作用或者能够诱导类固醇基因引向作用而又不会明显诱导类固醇非基因引向作用的化合物的方法。该方法可以通过多种方式实施，包括(1)评估所述化合物适当地结合所述类固醇受体的配体结合结构域，而又不会明显激活所述类固醇受体的DNA结合结构域，或者适当地激活所述类固醇受体的DNA结合结构域，而又不会明显激活仅由所述类固醇受体的配体结合结构域介导的功能的能力；和(2)测定所述测试化合物的生物学活性，以便评估其诱导目标非基因引向作用而又不会明显诱导基因引向作用的能力，或其诱导目标基因引向作用而又不会诱导明显的非基因引向作用的能力。上述第一个步骤可以通过分子模拟完成，优选借助于计算机进行。另外，可以将仅包括配体结合结构域但缺乏功能性DNA结合结构域的所述受体的修饰形式用于确定所述测试化合物是能激活配体结合结构域或是DNA结合结构域。例如，所述修饰形式可以在转化过的细胞中表达。可以对体外培养的细胞进行遗传学改变，以便表达类固醇受体或其遗传学变体。可以使用已知技术对基因引向活性进行定量，如测定在一种测试化合物的作用下所产生的总的mRNA量或对一种或多种类固醇调控基因专一的mRNA的量。筛选可以在体内或体外进行。另外，可以将步骤1和2组合成在体外基于细胞的测定中简单地分析能选择性地诱导非基因引向或基因引向作用而又不会明显诱导其他作用的化合物。本发明的另一种实施方案是一种制备组织培养筛选系统的方法，该方法包括以下步骤将组织培养细胞系生长到达到合适的铺满度，通常达到大约50％的铺满度；用一种特定受体的合适的表达质粒和对所述特性受体有反应的靶基因的表达质粒转染所述组织培养物；让转染过的细胞与一种测试化合物接触；并且随后测定所述测试化合物对所述靶基因表达的影响，以便确定该化合物是否能诱导基因引向作用。在本实施方案的一个方面，还评估了所述化合物是否诱导了需要的非基因引向反应。作为本实施方案的一种非限定性例子，让所述细胞与促-细胞程序死亡剂接触；测定与所述测试化合物接触的程序死亡的转染细胞的数量；并且选择能抑制细胞程序死亡，而又不会明显诱导所述靶基因转录的化合物。在本文所披露的筛选方法中，组织培养细胞系可以缺乏正在测试其生物学活性的受体。在这种情况下，可以通过用具有编码所缺乏的受体的cDNA或编码所述缺陷型受体的嵌合体的质粒转染所述细胞系添加所缺乏的受体。还可以通过转染添加所述受体的响应元件。所述受体响应增强DNA因子是从相应于该系统所使用的特定受体的相应因子中筛选的。基础启动子包括含有能够结合RNA聚合酶II的“TATA”因子的最低启动子序列，并且是从常用因子中选择的任一种。例如，胸苷激酶启动子、卵白蛋白启动子和MMTVLTR。报导基因可以是从多种基因中选择的任意一种，其中，蛋白产物是容易分析或检测的。本领域技术人员可以理解的是，所述蛋白可以通过热值测定，荧光；免疫化学，化学或放射化学方法方便地分析。另外，所述报导基因可以是嵌合基因。可以使用的各种报导基因的例子包括细菌酶氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、肽激素、生长因子和嵌合蛋白。在所述优选实施方案中，使用能产生非天然蛋白的基因。例如，将CAT用于哺乳动物系统，因为它不是哺乳动物细胞正常存在的酶，并且容易分析。因此，可以利用CAT在组织培养细胞中的受体依赖型激活，鉴定能与所述受体直接或间接相互作用以便激活一种基因的转录的化合物。在另一种实施方案中，提供了一种用于筛选用来治疗与类固醇受体相关的疾病或失调的化合物的方法(i)让表达一种天然或人工类固醇受体的细胞与一种测试化合物接触；(ii)评估所述化合物是否能激活所述类固醇受体的非基因引向活性，包括但不限于细胞内二级信号系统、信号转导途径、蛋白激酶信号转导途径、MAP激酶信号转导途径、Src/Shc/ERK信号转导途径；细胞内钙浓度的调控；分泌、细胞形态学的改变；细胞运动性；细胞骨骼重排；或细胞程序死亡；(iii)测定由所述测试化合物所诱导的转录水平；和(iv)选择能激活所述类固醇受体的非基因引向活性而又不会明显激活所述类固醇受体的基因引向活性的化合物。“明显激活”类固醇受体的基因引向活性表示所激活的转录超过由天然类固醇受体诱导的转录10％，并且优选低于5、2、1或0.1％。在另一种实施方案中，提供了一种用于筛选用来治疗与性类固醇受体相关的疾病或失调的化合物的方法(i)让表达一种天然或人工性类固醇受体的细胞与一种测试化合物单独接触或与促-细胞程序死亡剂组合接触；(ii)评估所述化合物是否能激活所述类固醇受体的非基因引向活性，例如，信号转导途径，如蛋白激酶信号转导途径、MAP激酶信号转导途径、或一般为能抑制细胞程序死亡的机制；(iii)测定由所述测试化合物所诱导的转录水平；(iv)测定所述测试化合物是否能抑制与测试化合物单独接触或与前细胞程序死亡剂组合接触的细胞的程序死亡；和(v)选择能激活所述类固醇受体的非基因引向活性而又不会明显激活所述类固醇受体的基因引向活性的化合物。在另一方面，提供了一种用于筛选可用来治疗骨病或增加骨质量的化合物的方法，该方法包括使用在本文中进一步披露的方法或已知方法，评估一种化合物是否能激活雌激素或雄激素受体的抗细胞程序死亡结构域，而又不会明显激活所述受体的DNA结合结构域。在一种优选实施方案中，所述类固醇激素受体蛋白是由内源DNA表达的。在另一种实施方案中，所述受体序列可以是人的、非人的或嵌合的。所说的嵌合体表示所得到的序列包括来自至少两种不同来源的序列的混合物。另外，可以对所述受体进行遗传学改变，以便缺失、添加或修饰特定序列。在另一种实施方案中，通过使用编码可操作地连接于一种报导基因上的可操作的激素响应元件的非内源DNA序列，测定类固醇激素受体的DNA结合结构域的激活。测定转录水平的方法为本领域所公知，并且包括mRNA的机械分离和定量，以及更复杂的方法。例如，可以通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)对mRNA的产生进行定量。在操作适当时，可以利用RT-PCR检测产量极低的转录物，并且可以在数量很小的原材料中鉴定RNA。试剂和RT-PCR试剂盒可以通过商业渠道获得。因此，可以方便地监测内源mRNA水平，以便评估一种化合物对转录水平的影响。在本发明的其他实施方案中，不能通过分析由于测试化合物与类固醇受体的相互作用而导致的化合物的外观或物理特征的改变筛选化合物。另外，可以通过DNA微排列分析，测定基因的表达。简单地讲，将长的双链互补DNA或寡核苷酸形式的核酸涂在显微镜载玻片上，使用机器操纵的销或固相化学合成进行涂片。可以在每一个载玻片上涂上数万至数十万个独立的核酸斑点。然后将放射性或荧光标记的样品(探针)DNA加样到所述载玻片上，并且在经过适当的时间和若干个洗涤步骤之后，使用显微镜或扫描仪检测杂交的探针核酸。如果所述载玻片上每一个斑点的核酸的性质是已知的，就可以通过在所述载玻片的斑点位置上存在的一种信号检测所述样品中的相应的核酸。使用这种方法，仅用几小时时间，就可以同时测定数千个基因的表达水平。在另一种实施方案中，可以通过以下方法筛选具有特定的非基因引向信号转导能力的激活剂(i)让能表达天然或人工类固醇受体的细胞与一种测试化合物接触；(ii)测定与所述测试化合物接触的细胞中的ERK激活的量；(iii)测定与所述测试化合物接触的细胞中的转录量；(iv)筛选和天然类固醇接触的细胞的转录水平相比表现出ERK激活和最低转录水平的与所述化合物接触的细胞。在一种优选实施方案中，所述化合物是通过一种高处理量组合筛选鉴定的，该筛选方法能利用SRE-SEAP结构(负结果)和C3(补体3)转录(正结果)同时检测ERK激活。所述SRE-SEAP分析通过测定转录因子(Elk-1/SRF)检测MAPK/JNK信号转导途径的激活——诱导位于单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)启动子上游的血清响应元件(SRE)的激活，所述启动子能启动分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的表达。该分析可以像用于体内MEK1或MEKK1分析的试剂盒一样通过商业渠道获得。一般，在转染24小时之后，用含有大约0.2％血清的培养基更换含有血清的培养基。在大约0.2％的血清中培养细胞24小时，并再次进行分析。对照样品仅用媒介物进行处理。本发明的另一种实施方案是一种用于鉴定能够激活非基因引向受体活性而又不会明显激活基因引向受体活性的测试化合物或化学信号的分析方法，该方法包括以下步骤在合适的培养基中生长组织培养筛选系统，其中，该组织培养筛选系统的细胞系含有一种具有至少一种鉴定的非基因引向活性的类固醇受体；将一种测试化合物或化学信号添加到所述培养基中，并且测定转录量和非基因引向活性量。本领域技术人员可以理解的是，培养基的选择取决于细胞系的选择，并且可以是适合所述细胞系的本领域已知的任何在化学上确定的量。可以通过瞬时或稳定转染添加所述受体和报导基因。在另一种实施方案中，提供了一种用于筛选一种类固醇受体的选择性配体的方法，包括以下步骤(i)在细胞培养基中培养细胞，其中，所述细胞能天然或人工表达一种类固醇受体；(ii)让所述细胞与一种测试化合物接触；(iii)测定所述测试化合物是否能激活所述类固醇受体的非基因引向活性；(iv)测定所述测试化合物是否能激活所述类固醇受体的基因引向活性；(v)选择能激活所述类固醇受体的非基因引向活性而又不会明显激活所述类固醇受体的基因引向活性的化合物。在一种实施方案中，所述细胞系是OB-6，而所述非基因引向活性可以通过评估所述测试化合物是否能抑制细胞程序死亡测定。细胞程序死亡可以通过本领域公知的技术评估。例如，可以用定位于细胞核中的绿色荧光蛋白转染细胞，以便有利于评估与细胞程序死亡相关的细胞核形态学的改变。还可以通过以下方法测定细胞程序死亡末端尿苷脱氧核苷转移酶缺口末端标记、原位末端标记、Hoechst染色、或评估caspase-3活性。另外，还可以通过测定是否业已激活了一种信号转导途径，优选Src/Shc/ERK信号转导途径评估非基因引向活性。可以用非基因引向活性标记转染细胞，优选使用血清响应元件/分泌型碱性磷酸酶(SRE-SEAP)结构，以便所诱导的所述血清响应元件的激活，能启动分泌型碱性磷酸酶的表达。所述SRE-SEAP结构是通过分析转录因子(Elk-1/SRF)，检测MAPK/JNK信号转导途径的激活。可以用本领域公知的技术评估基因引向活性的水平。在优选实施方案中，可以分离与一种测试化合物接触的类固醇受体，并且与相当于与特定类固醇受体结合的类固醇响应元件的核酸序列混合。所述类固醇-测试化合物复合物与所述响应元件序列结合的缺乏，表明所述测试化合物不会影响基因引向活性。本领域普通技术人员可以理解的是，可以将未标记过的类固醇或未标记过的响应元件固定在一种固相上，然后根据需要将标记过的类固醇或标记过的响应元件添加到所述固相上。在存在所述测试化合物的条件下，在所述固相上的所述标记的检测，表明所述测试化合物-受体复合物不会结合核酸，因此不会影响基因引向活性。另外，可以将所述类固醇受体-测试化合物复合物用于与已知核转录因子的结合测定，所述转录因子包括，但不限于AP-1、NFκB、SRC-1等。类固醇受体-测试化合物与转录因子结合的缺乏，表明所述测试化合物不会抑制基因引向活性。本发明的其他实施方案包括使用多种转染剂的筛选方法，以便可以用类固醇受体，用于检测基因引向活性的诱导型报导基因质粒；或用于检测非基因引向活性的诱导型报导基因质粒选择性地转染细胞。所述类固醇受体具有转录活性，这样它就可以诱导一种或多种报导基因的表达。通过在用一种测试化合物处理转染过的细胞时监测报导基因表达的变化，筛选能对基因引向或基因引向活性产生所需影响的化合物。例如，第一种报导基因活性可以具有位于报导基因上游的响应元件，以便转染过的类固醇受体能编码一种与所述类固醇响应元件相互作用以便诱导所述报导基因表达的蛋白。所述细胞可以是单一、双重或三重转染体，或者是任何其他的多重转染体。在另一种实施方案中，提供了一种筛选能诱导非基因引向活性的类固醇受体的配体的方法，该方法包括以下步骤(a)让一种细胞与一种测试化合物接触，其中，所述细胞业已用以下成分转染过i)编码功能性类固醇受体或类固醇受体的遗传学变体的DNA序列，其中，所述类固醇受体具有转录活性；ii)响应元件报导基因结构；和iii)血清响应元件-报导基因结构；(b)测定所述测试化合物对所述响应元件-报导基因结构转录的影响；(c)测定所述测试化合物对血清响应元件-报导基因结构转录的影响；和(d)选择能激活所述血清响应元件-报导基因结构的转录而又不会明显激活ERE-报导基因结构转录的化合物。本领域技术人员可以理解的是，本发明可以用除了含有多重转化体的单一细胞系之外的多种细胞系实施。在一种实施方案中，提供了一种筛选治疗与类固醇受体相关的疾病的化合物的方法；提供了用转录活性类固醇受体和对所述类固醇受体有转录响应的第一种报导基因结构转染的第一种细胞系；提供了用所述转录活性类固醇受体和第二种报导基因结构转染过的第二种细胞系，其中，所述第二种报导基因结构的转录，表明了非基因引向活性的激活，优选信号转导途径的激活；测定所述测试化合物对所述第一和第二种报导基因结构转录的影响；和选择能诱导第二种报导基因激活而又不会明显激活第一种报导基因结构转录的化合物。在本发明的另一种实施方案中，提供了一种筛选能有效治疗与类固醇受体相关的疾病或失调的化合物的方法，包括给一种宿主，优选哺乳动物，最优选小鼠服用一种测试化合物；测定所述化合物对目标非基因引向作用的影响；测定所述化合物对由所述类固醇受体调控的基因转录的影响；和筛选能介导非基因引向作用而又不会明显激活类固醇调控的基因的转录的化合物。可以通过在服用所述测试化合物之后从所述宿主细胞中获得骨细胞，利用TUNEL或Hoechst染色评估骨细胞的细胞程序死亡。另外，可以用骨组织形态学直接和精确地分析测试化合物对骨组织的作用。组织学样品通常是通过骨活组织检查获得的。还可以通过测定所述测试化合物对骨质量或骨强度的影响，评估所述测试化合物对骨细胞细胞程序死亡的影响。骨质量可以用DEXA或外周定量计算断层摄影(pQCT)评估。可以通过生物化学检测测定骨强度。可以通过测定一种测试化合物对向子宫活性或乳腺活性的作用评估类固醇调控基因转录的激活。本领域普通技术人员可以理解的是，本发明的筛选方法还可用于鉴定能激活基因引向类固醇受体活性而又不会激活非基因引向类固醇活性的化合物。在需要类固醇受体的非基因引向活性而不需要基因引向活性时，可以使用所述化合物。因此，可以将所述化合物用于治疗与类固醇或类固醇受体相关的疾病和失调，其中，需要类固醇的基因引向活性，而不需要非基因引向活性。因此，在一种实施方案中，提供了一种用于筛选用来治疗与类固醇受体相关的疾病或失调的化合物的方法，在一种实施方案中，所述疾病是与性类固醇受体相关的疾病(i)让一种能表达天然或非天然类固醇受体，在一种实施方案中是性类固醇受体的细胞与一种测试化合物接触；(ii)评估所述化合物是否能激活所述类固醇受体的非基因引向活性；(iii)测定由所述测试化合物诱导的转录水平；和(iv)筛选能激活所述类固醇受体的基因引向活性而又不会明显激活所述类固醇受体的非基因引向活性的化合物。明显激活类固醇受体的非基因引向活性，表示激活了二级信使的系统，以便由所述二级信使系统在所述细胞中诱导非基因引向生物学反应。典型的生物学反应有化学级联反应，包括，但不限于由磷酸化、形态学改变、分泌、增殖、DNA合成、蛋白合成、和细胞骨骼重排所诱导的反应。V.使用能诱导选择性类固醇受体活性化合物的方法满足本文所提出的标准的活性化合物可用于治疗多种医学症状。另外，因为已知包括性类固醇受体在内的类固醇受体能在哺乳动物体内的多种组织中表达，包括，但不限于神经组织、肌肉组织、骨组织、血液、生殖组织，可将本发明的活性化合物用于治疗所述组织或其他组织的目标疾病，其中，所述疾病与类固醇的基因引向或非基因引向作用相关。在一种特定实施方案中，可将所述活性化合物用于治疗心血管疾病。例如，可以将具有松弛大动脉和小动脉中的平滑肌的非基因引向类固醇活性的化合物用于调节血管反应性和交感神经平衡。通过本发明鉴定的活性化合物可以对多种类固醇受体产生活性，并且对每一种类固醇受体具有不同的作用。例如，一种活性化合物能够抑制一种类固醇受体的基因引向活性，而又不会抑制另一种类固醇受体的基因引向活性。类似地，可以抑制类固醇受体的非基因引向活性，同时又激活另一种类固醇激素受体的非基因引向活性。还可将本发明的活性化合物用于治疗包括非胰岛素依赖型糖尿病在内的内分泌疾病，以及用于调节免疫系统。已知T细胞能表达类固醇受体，并且可将所述活性化合物用于治疗增殖性和传染性疾病。还可将所述活性化合物用于治疗神经疾病，包括癫痫、焦虑、抑郁、失眠、周期性偏头痛、记忆损伤和药物依赖性。可以将所述活性化合物用作包括人在内的宿主的骨合成代谢制剂，为了从事诸如运动或体力劳动的艰苦的体力活动目的而强化骨骼，并且用于强化没有出现骨质疏松，但可能会在将来出现骨质疏松的人或其他宿主的骨骼，因为所述宿主属于会发生这种疾病的危险人群。骨合成代谢制剂在人体上的其他用途包括治疗宿主，包括具有天然瘦小或异常脆弱骨骼，包括脆弱的牙齿的人，具有发生骨分解疾病的遗传学倾向的人，或畸形骨病，如关节退化、不连合骨折、由糖尿病引起的畸形问题、移植体周炎、对骨嫁接、移植物反应较差，或骨折。还可将所述化合物用于提高用于体力劳动和用于诸如竞赛的运动的马和狗的骨质量。还可将所述化合物用于提高被用于肉类生产的鸡和火鸡的骨质量，以便提高易加工性。代表性分解骨病有绝经后骨质疏松、男性和女性的老年性骨质疏松、糖皮质素诱导的骨质疏松、不运动诱导的骨质疏松、失重诱导的骨质疏松(如在太空飞行时)、移植后骨质疏松、转移性骨质疏松、自发性骨质疏松、青少年骨质疏松、Paget’s病、骨形成不全、慢性副甲状腺机能亢进、甲状腺机能亢进、类风湿关节炎、Gorham-Stout病、McCune-Albright综合症和各种癌症或多发性骨髓瘤的溶骨转移瘤。畸形骨病的特征是骨质量的减少、普通骨骼脆性、关节退化、不连合骨折、由糖尿病引起的畸形和牙齿问题，移植体周炎、对骨嫁接/移植物/骨替代材料的反应较差、牙周疾病，以及骨骼老化及其后果。按照本文所提供的标准筛选的化合物，还可用于在以低骨质量和较高的骨脆症为特征的疾病中增加骨质量和/或预防骨折。还可将所述化合物用于治疗骨病状态，其中，所述骨病的成骨发生减弱，如老年性骨质疏松和糖皮质素诱导的骨质疏松——特别是成长中的儿童和青少年，在此期间，对骨重塑的干扰是有害的。另外，本领域普通技术人员可以理解的是，通过本发明鉴定的化合物可用于治疗疾病状态，其中，一般类固醇治疗是理想的，优选性类固醇治疗。可以通过类固醇治疗的症状包括炎症、关节炎、红斑狼疮、器官移植、癌症、癫痫、焦虑、抑郁、失眠、周期性偏头痛、记忆损伤、和药物依赖性、免疫失调、和心血管疾病。由本发明方法筛选的化合物优于现存的类固醇治疗剂，因为所筛选的化合物能启动类固醇激素受体途径的信号转导机制及其优点，而又不会诱导转录，从而抑制了与现有类固醇治疗相关的不利的副作用。与现有性类固醇治疗相关的副作用的例子包括不希望的第二性征，包括女性的多毛症和男性的女性型乳房等。具有不同转录活性和抗细胞程序死亡活性水平的化合物，可用于治疗不同的症状或疾病，并且，本领域普通技术人员可以用本领域公知的和本文所披露的方法方便地确定治疗特定疾病所需要的一种化合物的转录和抗细胞程序死亡活性的水平。在其他实施方案中，可以选择能激活一种类固醇受体的基因引向活性而又不会激活所述类固醇受体的非基因引向活性的活性化合物。在需要类固醇受体的非基因引向活性时，使用这种活性化合物是有利的。VI.试剂盒本发明的另一种实施方案是一种用于测定类固醇受体依赖型非基因引向活性的试剂盒，包括具有一种稳定转染的细胞系的容器，其中，所述细胞系包括一种类固醇响应报导基因结构，一种用于评估非基因引向类固醇基因活性激活的装置，和一种类固醇受体。所述试剂盒还可以包括一种细胞系，其中，该细胞系包括所述类固醇受体、报导基因结构中的至少一种作为表达质粒。在一种非限定性例子中，17β-雌二醇是ERK激活和C3转录的正化合物对照。可以将吡唑用作ERK激活的负对照，并且将estren用作C3转录的负对照。选择与17β-雌二醇相比具有强的SRE-SEAP活性但具有弱的或缺乏C3-Luc活性的化合物。所述筛选标准可以包括根据ERK激活相对C3转录的比例对感兴趣的化合物进行分类。VII.转基因动物在本发明的另一种实施方案中，提供了转基因非人动物，其中包括编码至少一种类固醇受体拮抗剂的诱导型转基因，例如，ER肽拮抗剂，如肽F6、αII、或293，并且优选编码两个拷贝的所述肽。在一种实施方案中，所述转基因的诱导会抑制所述受体的基因引向和非基因引向作用。在另一种实施方案中，所述一个或两个转基因的诱导会抑制一种类固醇受体的转录活性。可以将具有至少一种诱导型类固醇受体专一性拮抗剂的转基因非人动物，优选小鼠用于筛选治疗疾病的化合物，这种化合物能通过所述受体专一性起作用。在一种实施方案中，提供了一种用于筛选能选择性地诱导受体响应的化合物的方法，包括(i)在含有至少一种诱导型受体拮抗剂转基因的转基因动物中诱导至少一种受体拮抗剂的表达；(ii)给所述转基因动物服用一种测试化合物；(iii)测定步骤(ii)的动物体内的非基因引向作用的程度；(iv)测定步骤(ii)的动物体内的转录水平；和(v)筛选在服用了所述测试化合物的转基因动物体内诱导非基因引向作用而又不会明显增强转录作用的化合物。转基因动物的生产为本领域所公知。授予Lee等的US6025539披露了一种IL-5转基因小鼠和用于生产转基因小鼠的方法，并且该专利被以全文形式收作本文参考。本领域普通技术人员可以理解的是，诱导型转基因可以是细胞、组织或器官专一性的。在一种实施方案中，所述转基因受由肌动蛋白启动子驱动的反向四环素阻抑物/四环素-ON系统的操纵，并且披露于以下文献中Gossen，M.etal.，1993，TrendsBiochemSci18471-475；和GossenM.etal.，1995，Science268-1766-1769。在一种更具体的实施方案中，提供了一种用于筛选能选择性地诱导受体响应的化合物的方法，包括(i)在含有至少一种诱导型ER拮抗剂转基因的转基因动物中诱导至少一种ER拮抗剂的表达；(ii)给所述转基因动物服用一种测试化合物；(iii)测定步骤(ii)的动物体内的正在发生细胞程序死亡的成骨细胞或破骨细胞的数量；(iv)测定步骤(ii)的动物体内的转录水平；和(v)筛选在服用了所述测试化合物的转基因动物体内能抑制细胞程序死亡而又不会明显增强转录作用的化合物。所述反向四环素阻抑物(rTetR或TET-ON)系统利用了四环素阻抑物(TetR)-操纵子-四环素(Tc)相互作用、单纯疱疹病毒(HSV)-VP16转录激活结构域和四环素(Tc)的高度专一性。在所述常规(TET-OFF)系统中，Tc操纵的反式激活物(tTA——TetR和VP16蛋白的激活结构域之间的融合物)能刺激基因表达，正如在HeLa细胞中通过报导基因分析所证实的。Tc能抑制tTA与一种基本启动子的tet操纵子(tetO)上游结合，并因此关闭tTA依赖型表达。不过，所述TET-ON系统采用了经过修饰的rtTA反式激活物，如Tc或其多西环素衍生物(Tox)，它能诱导而不是破坏VP16与所述操纵子的结合。所述TET-ON系统克服了在长时间接触四环素之后有可能对真核细胞造成的任何潜在的毒性作用。在另一种实施方案中，提供了一种具有一种可诱导失活的类固醇受体的转基因非人动物。在一种实施方案中，披露了一种转基因动物，其中，仅使成骨和骨细胞中的性类固醇受体失活。所述Cre/loxP二元重组系统是用于制备这种转基因动物的优选方法。所鉴定的转基因动物可以以针对Dox的作用启动Cre表达的能力为特征。在另一种实施方案中，提供了一种转基因动物，其中，可以对所述类固醇受体基因的特定外显子进行诱导型剪接，以便产生专一性类固醇受体缺失。在一种例子中，对ERα基因的外显子3或外显子4进行诱导型剪接，以便产生在ERα基因上具有外显子3或外显子4或这两种外显子的缺失的转基因动物。在本发明的另一方面，提供了一种骨病的非人转基因动物模型。所述转基因动物在所述转基因上可以是杂合的或纯合的，并且可以具有一个或多个转基因。所述转基因能够可操作地连接于诱导型启动子上。在本发明的另一方面，提供了一种转基因动物，该动物包括一种性类固醇受体，所述类固醇受体(i)包括一个DNA结合结构域，它在接触雌激素或雄激素时不会介导基因引向性别作用；(ii)含有一种配体结合结构域，它在接触雌激素或雄激素时不会诱导对成骨细胞或骨细胞的抗细胞程序死亡作用；或(iii)同时含有(i)或(ii)。在另一方面，将至少一种多核苷酸用作转基因，以便抑制雌激素受体而不是雄激素受体的基因引向活性和抗细胞程序死亡活性。例如，用2XF6作转基因，能够抑制雌激素受体的活性，但可以保留通过雄激素受体发挥作用的雌激素或雄激素的抗细胞程序死亡活性。VIII.组合治疗在本发明的一个方面，可以给一种宿主服用与第二种药用制剂组合的本文所披露的一种活性化合物，以便治疗包括骨病在内的与类固醇或类固醇受体相关的疾病或失调。就骨病而言，所述第二种药用制剂可以是骨抗再吸收剂、第二种骨质量合成代谢剂、抗氧化剂、饮食添加剂、或能加强所述化合物对骨结构、强度、密度或质量产生的有利作用的任何其他制剂。用于治疗骨质疏松的十种药物中的任一种都可以与所述主要活性制剂组合使用，包括合成代谢类固醇、磷酸氢盐、降钙素、雌激素或孕酮、抗雌激素，如雷洛昔芬或他莫昔芬、副甲状腺激素(PTH)、氟化物、维生素D或其衍生物、或钙制剂。用于组合的合适制剂的非限定性例子包括，但不限于阿仑特罗酸(alendronicacid)，氯曲磷酸二钠、羟乙二磷酸二钠，甲撑二磷酸二氢二钠，羟甲二磷酸二钠，氨羟二磷酸二钠，neridronicacid，risedronicacid，teriparatideacetate，tiludronicacid，异丙氧黄酮，碳酸氢钾、孕激素类，thiazide，硝酸镓，NSAIDS，普卡霉素，氢氧化铝，乙酸钙，碳酸钙，钙，碳酸镁和硫糖铝。还可将诸如谷胱甘肽或其他抗氧化剂的还原制剂用于和本发明的任何化合物组合。在本文中，术语抗氧化剂表示能在生理学条件下抑制可氧化的化合物发生氧化作用的物质。在一种实施方案中，如果一种化合物能够在体外还原内源氧基团，就认为该化合物是本文所述的抗氧化剂。可以在氧合条件下向细胞提取物中添加所述抗氧化剂，并且评估对一种可氧化化合物的作用。作为非限定性例子，抗氧化剂能清除氧、超氧化物阴离子、过氧化氢、超氧化物基团、脂氧化物基团、羟基基团，或者与反应性金属结合，以便抑制对脂类、蛋白、核酸等的氧化破坏。在本发明的另一方面，可以给一种宿主与第二种药用制剂组合服用本文所披露的活性化合物之一，以便治疗与类固醇受体相关的疾病。所述第二种药用制剂可以是类固醇、性类固醇、修饰过的类固醇、修饰过的性类固醇、抗生素、抗氧化剂、食品添加剂、或能增强所述活性化合物对与类固醇受体相关的疾病的有利作用的任何其他制剂。IX.药用组合物可以以有效的用量服用按照本文详细披露的筛选的能够诱导选择性类固醇作用的化合物或其可以药用的盐，以便治疗本文所披露的任何症状，所述化合物可选择性地存在于可以药用的载体或稀释剂中。所述活性材料可以通过用于系统性、局部或以表面输送的任何合适的途径服用，例如，口服、肠胃外服用、静脉内服用、真皮内服用、皮下服用、含服、鼻腔内服用、吸入、阴道、直肠或局部使用，所述活性材料可以是液体或固体形式的。服用本发明化合物的方法可以是通过特定剂量或通过受控制的释放媒介物服用。服用所述活性化合物的优选方法是口服。口服组合物通常包括一种惰性稀释剂或一种可食用的载体。可以将所述活性化合物包在明胶胶囊中或者压缩成片剂。为了用于治疗性口服使用，可以将所述化合物与赋形剂结合，并以片剂、锭剂或胶囊形式使用。还可以包括药理学上兼容的结合剂和/或佐剂材料作为该组合物的组成部分。所述片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有下列成分中的任意一种或具有类似性质的化合物粘接剂，如微晶纤维素、黄蓍胶、或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；滑动剂，如胶体二氧化硅；增甜剂，如蔗糖或糖精；和/或芳香剂，如薄荷，水杨酸甲酯或橙香剂。当所述剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它可以含有诸如脂肪油类的液体载体。另外，剂量单位形式可以含有能够改变该剂量单位的物理形式的多种其他材料，例如糖衣，虫胶，或其他肠衣剂。所述化合物可以作为酏剂、悬浮液、糖浆、干胶片、或口香糖等的成分服用。除了活性化合物之外，糖浆可以含有蔗糖作为增甜剂，并且含有某些防腐剂、染料和着色剂和芳香剂。所述化合物或其可以药用的衍生物或盐还可以与不会妨碍预期作用的其他活性材料混合，或者与能补充所述预期作用的材料混合，如典型的雌激素，如17β-雌二醇或乙炔基雌二醇；磷酸氢盐，如阿仑特罗，羟乙二酸，氨羟二磷酸二钠，risedronate，tiludronate，zoledronate，cimadronate，氯屈磷酸，ibandronate，olpadronate，neridronate，EB-1053；来源于鲑鱼、鳗鱼或人类的降钙素；以及抗氧化剂，如谷胱甘肽、抗坏血酸或亚磷酸氢钠。用于肠胃外、真皮内、皮下、或局部使用的溶液或悬浮液可以包括以下成分无菌稀释剂，如用于注射的水、盐水溶液、固定油类、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苄醇或羟苯甲酸甲酯；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)；诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐的缓冲剂，和用于调节渗透力的制剂，如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以包装在用玻璃或塑料制成的安培瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。如果通过静脉内途径服用的话，优选的载体是生理盐水或磷酸缓冲的盐溶液(PBS)。在一种优选实施方案中，所述活性化合物是用能防止该化合物从体内迅速清除的载体制备的，如控制释放制剂，包括置入物或微型胶囊化输送系统。可以使用可生物降解的、生物兼容性聚合物，如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备所述制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。脂质体悬浮液(含有由单克隆抗体导向至特定细胞的表面抗原的脂质体)也是可以药用的载体。脂质体悬浮液可以按照本领域技术人员所公知的方法制备，例如，披露于US4522811中的方法(该专利被以全文形式收作本文参考)。例如，脂质体制剂可以通过以下方法制备将合适的脂类(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷酯酰胆碱、花生四烯酰磷酯酰胆碱和/或胆类固醇)溶解在无机溶剂中，然后蒸发掉该无机溶剂，在容器表面留下干燥脂类的薄膜。然后将所述活性化合物或其一磷酸、二磷酸和/或三磷酸衍生物导入所述容器。然后用手摇晃所述容器，以便释放容器侧面上的脂类材料，并分散脂类凝聚物，从而形成脂质体悬浮液。所述剂量和剂量方案取决于所述分解性骨病的性质，特定活性化合物的特征，例如，其治疗指数，患者，患者的病史和其他因素。所服用的非基因引向雌激素样信号传导化合物的激活物的数量，通常在每千克患者体重大约1pg-大约10毫克范围内。继续所述方案，以便优化治疗效果，同时平衡治疗的负面影响。参见Remington’sPharmaceuticalScience，17thEd.，1990，MarkPublishingCo.，Easton，Penn.；和Goodman和Gilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics8thEd.，1990，PergamonPress。为了肠胃外服用，最常见的是将所述活性化合物制备成与可以药用的肠胃外媒介物结合的可注射的单位剂量形式(溶液、悬浮液、乳液)。所述媒介物优选是无毒和非治疗性的。所述媒介物的例子有水、盐水、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液；和5％人血清白蛋白。还可以使用诸如固定油类和油酸乙酯的无水媒介物。可以将脂质体用作载体。所述媒介物可以含有诸如能提高等渗性和化学稳定性的微量添加剂，例如缓冲剂和防腐剂。通常还可以大约10pg/毫升-大约10毫克/毫升的浓度将非基因引向雌激素样信号传导化合物激活物掺入所述媒介物。所述化合物在所述药用组合物中的浓度取决于所述药物的吸收、失活和外泌速度，以及本领域技术人员已知的其他因素。应当指出的是，剂量值还可以随着需要缓解的症状的严重程度而改变。另外，所述活性成分可以一次服用，或者分成多个较小的剂量以不同的时间间隔服用。还应当理解的是，对于任何特定患者来说，具体的剂量方案应当根据个体的需要和复杂或监督该组合物服用的人员的专业判断而随时调整，并且本文所提供的浓度范围仅仅是代表性的，而不是要限定要求保护的组合物的范围或应用。X.说明性实施例提供以下实施例是为了说明本发明的各种实施方案，而不是要以任何方式限定本发明。A.雌激素和雄激素能通过细胞因子的转录调控调节破骨细胞发生；并且通过减弱间质祖细胞自我更新调节成骨细胞生成。雌激素和雄激素还可对成熟骨细胞的寿命发挥影响对破骨细胞的前-细胞程序死亡作用，但对成骨细胞和骨细胞产生抗细胞程序死亡作用。后一种作用是通过“非基因引向”，但仍然是受体依赖型的作用机制介导的，并且可以从机制上与转录活性分离。性类固醇对成骨细胞和骨细胞的有效的抗细胞程序死亡作用是通过受体依赖型机制介导的，并且需要通过激活Src和Shc激酶进行ERKs的磷酸化。另外，在HeLa细胞上获得的结果表明，ERα、ERβ或AR能够以相同的效率传递抗细胞程序死亡信号，而无论所述配体是雌激素还是雄激素。用ERα作代表，业已发现该蛋白的AF-1功能、DNA结合、F和二聚化的结构域对于雌激素的抗细胞程序死亡作用来说是无关紧要的。相反，所述作用需要所述蛋白的位于E结构域内的部分。因此，雌激素受体的抗细胞程序死亡活性位于所述蛋白上的部位，必然不同于决定配体激活受体的基因引向作用的部位，并且可以与之分离。还披露了通过将所述蛋白导向细胞核使ER传送抗细胞程序死亡信号的能力丧失的证据。其他文献报导了核孤独受体TR3和ER的生物学作用独立于其在细胞核中的转录活性(Li，H.etal.，2000，Science289，1159-1164；Simoncini，T.etal.，2000，Nature407，538-541)。另外，Migliiaccio等(Migliiaccio，A.etal.，2000，EMBOJ.19，5406-5417)证实了ER或AR能在前列腺癌细胞中与Src共同免疫沉淀。与ER的抗细胞程序死亡活性需要Src的SH2结构域的发现吻合，尽管AR需要SH3结构域，Migliiaccio等还证实了ER与与Src的SH2相互作用，而AR与Src的SH3结构域相互作用。本发明的结果(图2和4)明显的不同发现是拮抗剂之间的相互干扰，更重要的是关联配体之间的相互干扰——在Migliiaccio的研究中没有提出过的问题——不取决于ER与AR的复合，因为通过异源配体抑制细胞程序死亡可以在仅用一种类固醇受体转染的细胞中得到验证。包括Src和ERKs在内的MAP激酶信号传导途径的若干成员集中在小窝——特化的膜内陷中，它富含支架蛋白小窝蛋白-1和区室化的信号转导(Okamoto，T.etal.，1998，J.Biol.Chem.273，5419-5422)。小窝存在于包括人和小鼠成骨细胞在内的多种类型的细胞中(Solomon，K.R.etal.，2000，J.BoneMiner.Res.15，2391-2401；Solomon，K.R.etal.，2000，J.BoneMiner.Res.15，2380-2390)。最近业已证实ERα能够与小窝蛋白-1共同免疫沉淀(Schlegel，A.etal.，1999，J.Biol.Chem.274，33551-33556)。业已将ERα的亚群体与小泡蛋白和eNOS——由雌激素通过非基因引向作用机制激活的酶共同定位于小泡中(Chambliss，K.L.etal.，2000，Circ.Res.87，E44-E52)。雌激素和雄激素的抗细胞程序死亡作用对性类固醇受体的依赖性以及在将该蛋白导向所述膜时保留了ER的E结构域的抗细胞程序死亡信号，但在将其导向细胞核时丧失这种信号的证据表明，所述作用是通过与细胞质膜结合的所述类型受体的一部分介导的，所述载体可能存在于小窝中。这种联系得到了所述现象对Src、Shc和ERKs的共同依赖性的发现的支持。本文所披露的资料第一次证实了可以将一种类固醇受体的非基因引向活性与该转录因子的基因引向活性功能性分离；并且，这一目的可以通过使用合成的类固醇或非类固醇化合物实现。尽管业已使用性类固醇说明了本发明，本领域普通技术人员可以理解的是，本发明可应用于所有类固醇激素，包括雌激素、孕酮、雄激素、糖皮质素和盐皮质素，以便从基因引向活性中分离非基因引向活性。同样，本说明书首次披露了使用能通过性类固醇受体发挥抑制细胞程序死亡的作用而又不会诱导转录的化合物治疗骨病的新疗法。在一种实施方案中，配体诱导的两种活性的分离是不同构象状态的结果，所述构象状态是通过受体蛋白与其配体的物理结合而形成的，所述结合是实现基因引向和抗细胞程序死亡响应所需要的(图7)。由于性类固醇受体出现在除了生殖组织之外的诸如骨骼和大脑的很多组织中，通过本发明筛选的化合物可用于治疗与能表达性类固醇受体的组织或器官相关的症状。业已发现性类固醇受体的典型组织包括，但不限于脑垂体和下丘脑组织，肌肉组织，血细胞，血管，和结肠黏膜。在分子相互作用和细胞事件水平上，基因引向响应是一种相对长期的事件，因此被认为需要典型的配体-受体相互作用，这种相互作用涉及到在结合穴中与所述激素的精密配合，以便产生具有足够稳定性和寿命的复合物，以便实施多种蛋白-蛋白和蛋白-核酸相互作用和酶促激活，所述相互作用是重塑染色质结构以及实现基因转录速度改变所必须的(图7，右侧远处的复合物)。形成这种稳定的、寿命长的配体-受体复合物的需要，对配体结构提出了严格要求，导致了众所周知的专一性和独特的药理学，它是以雌激素和雄激素的典型基因引向作用为特征的。相反，支持非基因引向抗细胞程序死亡响应的ERK激活是非常迅速的，并且可以通过由更多的瞬时配体-受体复合物所采用的发育不全的或范围更广的构象而实现(图7，左侧远处的复合物)。所述瞬时物质的形成可能仅仅需要所述配体与所述受体的短暂结合，因此，是由配体结合速度决定的，而不是由结合速度与解离速度的比例决定的，后者决定了通过传统结合亲和测定所评估的配体的亲和力。因为配体结合速度远远大于解离速度(BindalR.D.etal.，1987；JSteroidBiochem.28，361-370；RaynaudJP，etal.，1978，CancerRes.38，3044-3050)，这种短期复合物的形成在很大程度上表现出松弛的结构专一性和效力/亲和力等级，正如在抗细胞程序死亡响应中所证实的。配体诱导的快速响应可能表现出与长期响应不同级别的效力的想法具有有趣的先例。在雌激素刺激未成熟大鼠子宫之后的时间进程中，诸如雌二醇和二甲基己烯雌酚的短期作用雌激素与诸如雌二醇和二乙基己烯雌酚的长期作用雌激素在诱导诸如水吸收和早期RNA合成的早期反应中具有同等的效力，但是它们在诱导诸如DNA合成和子宫生长的后期反应方面远远不及长期作用雌激素有效(KatzenellenbozenBS，etal.，1979，Prog.Horm.Res35，259-300；KatzenellenbozenBS，etal.，1978，Mol.CellEndocrinol.10，103-113)。事实上，创造术语“受阻碍的雌激素”是为了说明在短期和长期反应之间在效力上的这种特征性改变。这种差别是由于需要由配体连续和长期地对受体的占据，以便诱导长期反应，而瞬时占据就足以诱导短期反应。与本研究中所披露的事件在生物学关系上更远，但与时间规模更贴切的是酶“缓慢、紧密结合的抑制剂”的概念(Szedlacsek，S.E.，1995，MethodsEnzymol.249，144-180；Morrison，J.F.，1988，Adv.Enzymol.Relat.Areas.Mol.Biol.61，201-301)。在多种场合下，可以用多种配体快速并有效地抑制酶，其中只有很少一些会缓慢发展成更稳定的复合物。因此，快速形成的、最初的酶-抑制剂(快速-松散)复合物验证了在本文所证实的非基因引向响应中的松散的专一性，而缓慢-紧密的复合物在传统认可的基因引向活性所需要的性别专一性稳定复合物方面具有其作用。与性类固醇对成骨细胞和骨细胞的体外抗细胞程序死亡作用吻合。雌激素或雄激素的丧失会缩短两种性别的性腺切除小鼠的成骨细胞和骨细胞的寿命。以前业已在大鼠和人体上证实了在雌激素丧失之后骨细胞细胞程序死亡的增加(Noble，B.S.和Reeve，J.，2000，Mol.CellEndocrinol.159，7-13)，并且，与雌激素对破骨细胞的前-细胞程序死亡作用及其在雌激素缺乏时寿命的延长相反(Hughes，D.E.etal.，1996，Nat.Med.2，1132-1136；Kameda，T.etal.，1997，J.Exp.Med.186，489-495)。成骨细胞工作寿命的缩短和骨再吸收细胞的工作寿命的延长，可能在一定程度上导致了在性类固醇丧失之后骨再吸收和形成之间的不平衡。另外，骨细胞程序死亡的加强可以通过损坏骨细胞/小管机械传感网络进一步削弱骨骼(Manolagas，S.C.，2000，Endocr.Rev.21，115-137)。实际上，雌激素的信号和机械张力的信号似乎能够整合在骨骼中，因为与内皮细胞一样，骨细胞主要是通过剪切张力和对雌激素的响应调控的，并且还能对ERK激活的张力作出反应。用合成配体实现的性类固醇的非基因引向活性和基因引向活性的分离，提供了一种从不希望的性类固醇作用中分离需要的性类固醇作用的新方法，因此，提供了改进的药物治疗剂。具体地讲，与组织专一性配体(SERMs)或典型雌激素或雄激素不同的ERs或AR的机制专一性配体，是用于控制骨质稀少状态的优选类型的药物治疗剂(与抗再吸收相反，它是真正的合成代谢的，并且是性别中性的。B.小鼠。喂养4个月大的雌性Swiss-Webster小鼠或5个月大的雄性SAMRI小鼠，并且按照实验室动物护理和使用NIH指南使用。对小鼠进行假手术，或者进行双侧卵巢切除或睾丸切除。在4或3周之后，分别宰杀雌性或雄性小鼠，并且取出腰部脊椎。非脱钙骨切片上的程序死亡的成骨细胞和骨细胞的定量。按以前所披露的方法(Weinstein，R.S.etal.，1998，J.Clin.Invest.102，274-282；Jilka，R.L.etal.，1999，J.Clin.Invest.104，439-446)使用KlenowFragEL检测试剂盒(Oncogene)通过TUNEL染色，检测未脱钙的塑料包埋的脊椎切片(L1-L5)上的程序死亡的成骨细胞和骨细胞。在用作每一个骨切片的内部正对照的生长培养皿的底部观察到了TUNEL阳性肥大软骨细胞。细胞培养物。通过用胶原酶消化从新生的鼠颅盖上获得成骨细胞，在含有10％FBS的αMEM中培养2-3天，用胰蛋白酶EDTA重新悬浮，并且冷冻待用。在添加了2.5％FBS、2.5％小牛血清的不含酚红的αMEM中培养MLO-Y4骨细胞(Kato，Y.etal.，1997，J.BoneMiner.Res.12，2014-2023)。并且在用I型胶原包衣的平板上培养。在添加了5％FBS的不含酚红的αMEM中培养OB-6成骨细胞(Lecka-Czernik，B.etal.，1999，JCellBiochem.74，357-371)。在添加了10％FBS、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸钠的不含酚红的MEM中培养HeLa细胞。在体外定量程序死亡的细胞。按照以前所披露的方法，通过台盼兰染色或通过直接观察细胞核形态学改变(用于转染过的HeLa细胞)定量程序死亡的细胞(Plotkin，L.etal.，1999，J.Clin.Invest.104，1363-1374；Jilka，R.L.etal.，1998，J.BoneMiner.Res.13，793-802；Jilka，R.L.etal.，1999，J.BoneMiner.Res.104，439-446)。在后一种方法中，通过用含有核定位序列(EGFP-nuc或ERFP-nuc)的强化荧光蛋白(绿色或红色)共转染铺平板在玻璃盖玻片上的细胞，有利于观察细胞核的固缩或分解。用3.7％的甲醛固定，然后通过测定200-500个转染过的(荧光)细胞中的细胞核形态学，测定细胞程序死亡的百分比。固缩测定。大体上按以前所披露的方法在I型胶原凝胶上培养OB-6成骨细胞(3.3×105/毫升)(Klein，C.E.etal.，1991，J.CellBiol.115，1427-1436)。在形成凝胶之后，用小铲将其从孔的底部分离，并且用0.5毫升含有10％FBS、200μM抗坏血酸以及媒介物(0.1％乙醇)或类固醇的αMEM覆盖。在固定之后，切出10微米的切片，并且通过TUNEL染色定量程序死亡的细胞。Western印迹分析。通过免疫吸印分析ERK1/2的磷酸化状态，使用识别酪氨酸磷酸化ERK1/2的小鼠单克隆抗体或识别总ETK1/2的兔多克隆抗体，然后用与辣根过氧化物酶结合的抗小鼠或抗兔抗体培养(SantaCruzBiotechnology)。DNA结构。用具有2.25kb的人IL-6启动子，3个拷贝的卵黄生成素ERE序列，或启动萤火虫荧光素酶基因的补体3启动子(分别为IL-6-luc，ERE-1uc，和C3-luc)的报导质粒，分析所述类固醇的转录作用。以前业已披露了具有由SV40启动子启动的αII或两个拷贝的293(2×293)或两个拷贝的F6(2×F6)或与GAL4DNA结合结构域融合的GRIP的ER肽拮抗剂的表达质粒(Norris，J.D.etal.，1999，Science285，744-746)。所述肽的序列披露于被以全文形式收作本文参考的以下文献中Changetal.，1999，Mol.Cell.Bio.198226-8239。肽αII的序列是SSLTSRDFGSWYASR(SEQIDNO1)。肽293的序列是SSIKDFPNLISLLSR(SEQIDNO2)。肽F6的序列是GHEPLTLLERLLMDDKQAV(SEQIDNO3)。GRIP的序列是HSRLHDSKGQTKLLQLLTTKSDQMEPSPLPSSLSDTNKDSTGSLPGPGSTHGTSLKEKHKILHRLLQDSSSPVDLAKLTAEATGKELSQESSSTAPGSEVTVKQEPASPKKKENALLRYLLDKDDTKDIGLPE(SEQIDNO4)。类似地，早先业已报导了ERα突变体ΔA/B；S104、106、118A；ΔF；S554fs；ΔDBD；或L525A的表达质粒(Schodin，D.J.etal.，1995，JBiol.Chem.270，31163-31171；Ekena，K.etal.，1996，JBiol.Chem.271，20053-20059；Montano，M.M.etal.，1995，Mol.Endocrinol.9，814-825；Montano，M.M.和Katzenellenbogen，B.S.，，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94，2581-2586；McInerney，E.M.和Katzenellenbogen，B.S.，1996，JBiol.Chem.271，24172-24178；LeGoffetal.，1994，JBiol.Chem.269，4458-4466；Wrenn，C.K.和Katzenellenbogen，B.S.1993，JBiol.Chem.268，24089-24098；Ince，B.A.etal.，1993，JBiol.Chem.268，14026-14032)。为了构建ERα的DE和E突变体，通过PCR分别扩增来自ERα的263-553号氨基酸和333-553号氨基酸。正向引物含有SalI的限制位点和ERβKozak序列，而反向引物含有BamHI的限制位点。将扩增的PCR产物亚克隆到pCMV的SalI/BamHI限制位点上。通过PCR扩增ERα制备ERα-ECFP、E-ECFP、E-Nuc-ECFP和E-Mem-ECFP结构，分别使用以下引物对5’-GCCGCTAGCACCATGACCATGACCCTCCAC-3’(SEQIDNO5)和5’-GCCACCGGTCTGACTGTGGCAGGGAAACC-3’(SEQIDNO6)或5’-GCCGCTAGCACCATGAAGAACAGCCTGGCCTTG-3’(SEQIDNO7)和5’-GCCACCGGTCTAGTGGGCGCATGTAGGCG-3’(SEQIDNO8)。用NheI和AgeI消化PCR产物，并插入合适的ECFP载体的相同位点上。为了制备E-Mem-ECFP，将E克隆到Mem-ECFP载体(Clontech)上，所述载体具有神经调节蛋白的N-末端的20个氨基酸，它含有指导半胱氨酸3和4的翻译后棕榈酰化的信号，由它将融合蛋白导向细胞质膜。为了制备E-Nuc-ECFP，将E克隆到Nuc-ECFP载体(Clontech)上，它具有与ECFP-C-末端融合的3个拷贝的猴病毒40大T-抗原的核定位信号。为了制备ERα-ECFP和E-ECFP，通过BglII/BamHI消化将所述核定位信号从Nuc-ECFP载体上消除，并且重新连接，以便制备ECFP。然后将ERα或E的PCR产物连接到ECFP的NheI/AgeI位点上。通过测序证实所有PCR扩增片段的完整序列。编码SrcASH3、SrcASH2和SrcK295M(SrcK-)的cDNA是由耶鲁大学的WilliamC.Home馈赠的(Zhang，Z.etal.，2000，J.Biol.Chem.275479-486)。Wt或Shc突变体是由弗吉尼亚大学K.S.Ravichandran博士提供的(Walk，S.S.etal.，1998，Eur.J.Immunol.28，2265-2275)。dnMEK是由科罗拉多大学的N.G.Ahn博士提供的(Mansour，S.J.etal.，1994，Science，265，966-970)。瞬时转染。以5×104/平方厘米的密度将HeLa细胞铺平板，并且在16-24小时之后通过脂转染胺(LifeTechnologiesInc)用总共3微克量的DNA转染。在培养4-6小时之后，用含有10％活性炭剥离的血清的新鲜培养基取代所述转染混合物，并且开始处理。按以前所披露的方进行IL-6分析(Pottratz，S.T.etal.，1994，J.Clin.Invest.93，944-950)。对于ERE或C3-介导的转录来说，用E2处理转染过的细胞，并且在24小时之后测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性。胚胎成纤维细胞中的ERs和AR的RT-PCR分析。所使用的引物是Erα(350bp)5’-TCTGCCAAGGAGACTCGCTACTGT-3’(SEQIDNO9)和5’-CTTGGCCAAAGGTTGGCAGC-3’(SEQIDNO10)；ERβ(162bp)5’-GAAGTGCCAGCGAGCAGGTG-3’(SEQIDNO11)和5’-TGCTGGGACGGCTCACTAGCACAT-3’(SEQIDNO12)；AR(615bp)5’-TGTGTGGAAATAGATGGG-3’(SEQIDNO13)和5’-TACATGTGGTCAAGTGGG-3’(SEQIDNO14)；β肌动蛋白(200bp)5’-TGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCTG-3’(SEQIDNO15)和5’-GTGCCACCAGACAGCACTGTGTTG-3’(SEQIDNO16)。统计学分析。在建立数据的方差和正常分布的平衡之后，使用学生-t检验评估骨细胞程序死亡的体内变化，评估各组(n＝4-5)之间的显著差异。通过ANOVA分析体外细胞程序死亡测定的数据，并且用学生-Neuman-Keuls方法估算平均值之间的差异的显著水平。为了确定类固醇作用是否取决于所使用的前细胞程序死亡剂，通过双向ANOVA分析图1C和1D中的数据，其中，两种变量是前细胞程序死亡剂(媒介物、地塞米松、表鬼臼毒吡喃葡糖苷和TNFα)和预处理剂(媒介物、E2和DHT)。然后，用Bonferroni方法估算预处理剂组合之间的差异的显著性。例1在体内和体外通过雌激素和雄激素调节成骨细胞和骨细胞的程序死亡与假手术的对照相比，卵巢切除或睾丸切除小鼠的脊椎成骨颅盖细胞程序死亡提高了10倍和8.3倍，而骨细胞程序死亡提高了4倍和3.5倍(图1A)。在服用了17β-雌二醇(E2)的卵巢切除的小鼠上抑制了这种改变(资料未发表)。为了说明这种作用的机制，将原代颅盖细胞培养物和骨细胞系用作体外模型。E2或5α-二氢睾酮(DHT)能以剂量依赖形式在颅盖细胞中抑制表鬼臼毒吡喃葡糖苷诱导的细胞程序死亡，最大作用出现在10-9-10-8M浓度下(图1B)；用MLO-Y4细胞获得了相同结果(未发表)。在用下面三种不同的前细胞程序死亡刺激物中的任一种诱导时，E2或DHT能抑制颅盖衍生的鼠成骨细胞(图1C)或骨细胞系MLO-Y4(图1D)的细胞程序死亡表鬼臼毒吡喃葡糖苷、地塞米松或TNFα；以及Fas-Fas配体(未发表)。在体内控制成骨细胞和骨细胞的细胞程序死亡倾向的信号是未知的。不过，有大量的证据表明细胞与其基质的相互作用，特别是胶原-整联蛋白相互作用，是决定细胞存活或启动由细胞程序死亡实现的自杀过程的重要的体内原因。这种现象被称为固缩(Frisch，S.M.andRuoslahti，E.，1997，Curr.Opin.CellBiol.9，701-706)。因此，使用骨髓产生的成骨细胞系(OB-6)研究了性类固醇对固缩的作用，所述细胞是在I型胶原凝胶中培养的(图5E)。在该系统中，在胶原网络收缩期间，整联蛋白信号传导的丧失导致了细胞程序死亡。对于其他前程序细胞死亡信号来说，E2或DHT能在低至10-11M的浓度下以剂量依赖型方式缓解固缩。例2ER(α或β)或AR能以相同的效率传递抗细胞程序死亡信号，而无论配体是雌激素还是雄激素。雌激素受体拮抗剂ICIl82780或雄激素受体拮抗剂氟他胺能在颅盖细胞中抑制E2和DHT的抗细胞程序死亡作用，强烈地表明所述性类固醇的作用是通过ER和AR介导的。不过，令人吃惊的是，E2的抗细胞程序死亡作用还能由氟他胺消除，而DHT的作用能由ICI182780消除(图2A)。与该意外的结果吻合的是，其他人以前业已证实包括ICI182780在内的抗激素能与多种类型的类固醇受体相互作用(Nawaz，Z.，1999，CancerRes.59，372-376)。为了确定E2和DHT的抗细胞程序死亡作用对ER和AR的依赖性，并且剖析在用所述拮抗剂获得的意外结果中每一种受体的作用，用不能表达ER或AR的HeLa细胞进行研究。在该实验中，用含有核定位序列(EGFP-nuc)的强化绿色荧光蛋白和ERα、ERβ或AR表达结构或空载体对照(图2B)瞬时转染HeLa细胞。E2或DHT(10-12M-10-8M)对用不含受体的载体(空载体，ev)转染的细胞中由表鬼臼毒吡喃葡糖苷诱导的细胞程序死亡没有作用。不过，对于用ER(α或β)或AR转染的，但是没有维生素D受体(VDR)或retinoidX受体(RXR)的HeLa细胞来说，E2或DHT能以剂量依赖形式在相同的浓度范围内抑制细胞程序死亡。有趣的是，1，25(OH)2D3能抑制用VDR或RXR转染的HeLa细胞，而不是用ERs或AR转染的HeLa细胞。通过用地塞米松诱导细胞程序死亡获得了相同结果。与在用成骨细胞的一级培养物进行的实验相同，ICI182780或氟他胺能破坏E2或DHT在HeLa细胞中的作用，而无论HeLa细胞是用ERα还是AR转染的(资料未发表)。以上结果清楚地确定了雌激素的抗细胞程序死亡作用需要ER(α或β)或AR。另外，以上资料表明，决定性类固醇的非基因引向作用的受体确实是典型的受体蛋白，即能介导雌激素或雄激素的生殖功能的蛋白，而不是其他蛋白。更重要的是，以上发现证实典型的ERs和AR的某些作用是性别非专一性的。最近，业已在乳腺癌细胞中发现了雄激素对ER的转录调控和雌激素对AR的转录调控(Maggiolini，M.etal.，1999，CancerRes.594864-4869)，但是，这种现象可以通过特殊受体共激活物在某些细胞中的表达来解释(Yeh，S.etal.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA955527-5532)。本文所提供的结果第一次证实了典型的ERs和AR的非转录作用是性别非专一性的。由雌激素或雄激素通过ER或AR进行的性别非专一性信号传导似乎导致了任一种类型的性类固醇在女性和男性的成年骨骼中的作用和ER的模棱两可的骨骼表型或在啮齿类动物和人体上的芳香酶缺失或突变。例3ERα的抗细胞程序死亡活性位于E(配体结合)结构域，并且需要所述蛋白的细胞核外定位用ERα作原型，确定了性类固醇受体的抗细胞程序死亡活性所需要的结构域是否与转录活性所需要的结构域相同(图3A)。比较了ERα的几种突变体对抑制细胞程序死亡的作用。以前业已披露了所述突变体中的某一些，并且业已证实在瞬时转染到诸如用于本发明研究的HeLa细胞的人类细胞中时能产生预期的蛋白(Schodin，D.J.etal.，1995，J.Biol.Chem.270，31163-31171；Kraus，W.L.etal.，1997，JSteroidBiochem.Mol.Biol.63，175-188；Ekena，K.etal.，1996，J.Biol.Chem.271，20053-20059；Ekena，K.etal.，1997，J.Biol.Chem.272，5069-5075；Montanoetal.，1995，Mol.Endocrinol.9，814-825)。在没有公开的实验中，业已发现包括DE或E结构域的突变体也能产生预期的蛋白，并且缺乏转录活性。与ERα一样，缺乏完整的N-末端转录激活功能(AF-1)结构域的突变体ΔA/B，或其中的丝氨酸104、106和118被丙氨酸(S104、106、118A)所取代的突变体，或缺乏羧基末端的完整F结构域的突变体ΔF，或缺乏DNA结合结构域的一部分(185-251号氨基酸)的突变体ΔDBD能够传递E2结合的ER抗细胞程序死亡信号。另外，所有这些突变体都表现出减弱了的或没有ERE介导的基因转录活性(Montano，M.M.andKatzenellenbogen，B.S.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94，2581-2586；LeGoff，P.etal.，1994，J.Biol.Chem.269，4458-4466；McInerney，E.M.和Katzenellenbogen，B.S.，1996，J.Biol.Chem.271，24172-24178；Montanoetal.，1995，Mol.Endocrinol.9，814-825)。更令人吃惊的是，在缺少完整的AF-1和DNA结合结构域(DE)的缺失突变体上保留了所述配体传递抗细胞程序死亡信号的能力；并且在仅包括AF-2/配体结合结构域(E)的缺失突变体上也保持了这种能力。相反，缺乏激素结合能力ER突变体L525A(Ekenaetal.，1997，J.Biol.Chem.272，5069-5075)和缺失C-末端转录激活功能(AF-2)的突变体S554fs(Schodinetal.，1995，J.Biol.Chem.270，31163-31171；Inceetal.，1993，J.Biol.Chem.268，14026-14032；WrennandKatzenellenbogen，1993，J.Biol.Chem.268，24089-24098)丧失了传递抗细胞程序死亡信号和所述蛋白的转录活性的能力(Ekena，K.etal.，1996，J.Biol.Chem.271，20053-20059；Schodinetal.，1995，J.Biol.Chem.270，31163-31171)。以上结果表明，ER的“抗细胞程序死亡”结构域位于该蛋白的配体结合区(结构域E)，并且其抗细胞程序死亡活性可能不需要某些N-末端A/B结构域位点的磷酸化，这些位点对于ER的转录活性来说是重要的。然后确定了E结构域的抗细胞程序死亡活性是否取决于其在特定亚细胞区室中的定位(图3B)。通过将E结构域分别与含有细胞质膜或细胞核定位序列的强化氰荧光蛋白融合，将E结构域导向HeLa细胞的细胞质膜或细胞核。正如通过落射荧光显微术所发现的，非导向的ERα和非导向的E在细胞质的核中表现出氰荧光的类似分布，这表明消除ER的除了配体结合结构域之外的所有部分不会改变该蛋白的亚细胞分布。不过，通过比较氰荧光和红色荧光在相同细胞中的分布可以看出，通过结合合适的导向序列，可以分别实现膜或核ECFP融合蛋白的预期的亚细胞定位。主要将E结构域导向质膜不会改变其传递配体诱导的抗细胞程序死亡的信号，这种蛋白的抗细胞程序死亡活性与完整长度ERα的E结构域的抗细胞程序死亡活性相同证实了这一点，但是明显不同的是，仅仅将E结构域导向细胞核会导致其抗细胞程序死亡活性的完全丧失。例4ER和R的抗细胞程序死亡活性是通过Src/Shc/ERK信号传导途径介导的E2或DHT能在MLO-Y4细胞中迅速并且瞬时加强ERKs的磷酸化，最大作用出现在第5分钟，并且在第15分钟恢复到本底水平(图4A)。用鼠颅盖成骨细胞再现了相同的结果(未发表)。通过ERKs、PD9809和UO126磷酸化的专一性抑制剂；以及Src家族的酪氨酸激酶抑制剂PP1能抑制E2或DHT诱导的ERK磷酸化(未发表)。另外，PD98059和PP1能完全抑制E2和DHT的抗细胞程序死亡作用，这表明ERK磷酸化和Src激酶活性是两种性类固醇的抗细胞程序死亡作用所必需的。通过以下发现提供了有关Src激酶在性类固醇的抗细胞程序死亡方面的重要作用的确凿证据。与Src+/+野生型对照不同，还缺乏yes和Fyn的源于Src-/-小鼠的ER和AR表达胚胎成纤维细胞(Sorinaoetal.，1991，Cell，64693-702)对E2或DHT的抗细胞程序死亡作用没有反应(图4B)。在HeLa细胞中证实了E2或DHT的抗细胞程序死亡作用对性类固醇受体(ER或AR)以及对Src/ERK信号传导途径激活的共同依赖性(图4C和D)。PD58059或显性负(dn)MEK-一种决定ERKs磷酸化的激酶的共转染，抑制了E2或DHT在用ERα或AR转染过的HeLa细胞中的作用(图4C)。类似地，在用ERα或AR转染的以及用缺乏激酶活性(SrcK)的Src突变体共转染的HeLa细胞中抑制了E2或DHT的作用(图4D)。更令人吃惊的是，缺乏SH2结构域的Src突变体(SrcASH2)抑制了配体激活ERα的抗细胞程序死亡活性，而没有抑制AR的活性。相反，缺乏SH3结构域(SrcASH3)的Src突变体抑制了AR的抗细胞程序死亡活性，而不能抑制ER的活性。类似地，通过显性负Shc突变体抑制了E2或DHT激活的ERα的抗细胞程序死亡活性，在所述突变体中，作为Shc磷酸化的主要位点的所有三个酪氨酸或仅仅是其中的第三个(Y239、Y240和Y317)被苯丙氨酸所取代。不过，当酪氨酸239和240发生突变，而317没有突变时，所述受体的抗细胞程序死亡活性不受影响(图4E)。与ER的E结构域对于它的抗细胞程序死亡活性来说是足够的证据吻合(图3)，在用该结构域、PD098059、dnMEK、SrcK转染的HeLa细胞中，SrcASH2或SrcASH3具有完全相同的作用，就如同在用完整长度ERα转染的HeLa细胞中的作用一样(图4C和D)。例5用肽拮抗剂分离ERα的转录活性和抗细胞程序死亡活性McDonell和同事业已分离了几种类型的小的(11-19个氨基酸)肽，在对共有ERE(雌激素响应元件)进行测定时，所述肽能结合配体-激活的ER的结合区位点，并且能选择性地抑制ERα，而不是ERβ-介导的转录，反之亦然(Norrisetal.，1999，Science285744-746；Changetal.，1999，Mol.CellBiol.198226-8239)。检验了所述肽抑制E2的抗细胞程序死亡作用的活性(图5)。在上述实验的同时，用HeLa细胞检验了所述肽抑制转录的能力，HeLa细胞是用ERE启动的荧光素酶结构(ERE-Luc)或IL-6启动子启动的荧光素酶(IL-6-Luc)转染的。所述肽被命名为αII，其序列为SSLTSRDFGSWYASR(SEQIDNO1)，它能结合ERα的配体结合结构域，抑制E2诱导的ERE-Luc转录的加强(图5A)。类似地，所述肽能抑制E2诱导的IL-6转录的减弱-由ER和其他转录因子之间的蛋白-蛋白相互作用介导的转录调控的一种范例。不过，αII肽不影响E2的抗细胞程序死亡作用。在用HEK293替代HeLa细胞进行的实验中获得了相同结果(未发表)。研究了ERβ-专一性肽(293)，以及能与ERα和ERβ相互作用的肽(F6)(图5B)。对于上述实验来说，用ERE或IL-6荧光素酶结构以及ERα或ERβ转染HeLa细胞。293能抑制E2对在具有ERβ的细胞中ERE和IL-6启动子的转录作用，但不能抑制具有ERα细胞中的转录作用。另一方面，F6能抑制E2对在具有ERα和ERβ的细胞中ERE或IL-6的转录作用。更重要的是，与αII不同，它不能影响ERα的抗细胞程序死亡活性(并且正如ERβ所预期的，因为αII对ERα专一)，293能抑制ERβ的抗细胞程序死亡活性，但对ERα的抗细胞程序死亡活性没有影响。F6能抑制ERα和ERβ的抗细胞程序死亡活性，以及抑制ERE和IL-6的转录。以上结果证实了每一种肽能结合并抑制AF-2结合穴的不同位点的证据(Norris，J.D.etal.，1999，Science285744-746；Chang，C.etal.，1999，Mol.CellBiol.198226-8239)。另外，以上资料还表明抑制αII结合的位点，并且仅仅是抑制该位点，不会影响“抗细胞程序死亡”活性，即使能有效抑制ERα的转录抑制活性也是如此。所述肽在抑制ERα或ERβ的转录和/或抗细胞程序死亡活性方面的专一性的验证支持了这样的论点即所述配体激活的受体的抗细胞程序死亡活性取决于受体蛋白的片段的独特位点，所述位点通常被称为“抗细胞程序死亡结构域”。ER的转录活性在很大程度上受它与特定共激活物的影响，大部分共激活物含有被称为核受体框的保守的LXXLL基序(McKennaetal.，1999，Endocri.Rev.20，321-344)。肽GRIP能抑制ER与GRIP-1的相互作用，它是所述共激活物之一(Chang，C.etal.，1999，Mol.CellBiol.198226-8239)。GRIP肽含有来自共激活物GRIP-1的中央三个拷贝的LXXLL基序。所述部分的核苷酸序列是CACAGCCGGCTGCATGACAGCAAAGGGCAGACCAAACTCCTGCAGCTGCTGACCACCAAGTCCGACCAGATGGAGCCTTCACCCTTGCCCAGCTCCTTGTCGGACACAAACAAGGACTCAACAGGGAGCTTGCCTGGGCCTGGGTCCACGCATGGCACCTCGCTCAAGGAGAAGCATAAGATTTTGCACAGACTCTTACAGGACAGCAGTTCCCCTGTGGACTTGGCCAAGCTGACAGCAGAAGCCACAGGCAAAGAGCTGAGCCAGGAGTCCAGCAGCACAGCTCCTGGGTCGGAAGTGACTGTCAAACAGGAGCCAGCGAGCCCCAAGAAGAAAGAGAATGCACTACTGCGCTATTTGCTC当这种肽与ERα共转染到HeLa细胞中时，它不会影响ER的抗细胞程序死亡活性(图5C)。这进一步地表明由配体激活的受体的抗细胞程序死亡活性独立于作为核转录因子的这种蛋白的功能。例6用合成的配体能分离ERα的转录活性及其非基因引向活性比较了各种配体对C3基因的转录的作用，及其对原代颅盖细胞的抗细胞程序死亡作用，所述C3基因在其启动子中含有通过雌激素以典型方式调控的ERE。如图6A所示，被证实不具有转录活性的estren表现出有效的抗细胞程序死亡作用。另一方面，具有有效转录活性的吡唑具有很小的抗细胞程序死亡作用。这两种化合物的相对抗细胞程序死亡效力与其诱导ERK磷酸化的能力相关(图6B)。例7用肽F6作转基因的转基因动物为了剖析ERs的作用和AR的作用在体内对雌激素或雄激素的骨保护作用的相对贡献，可以比较野生型卵巢切除小鼠和具有编码拮抗2XF6的ERs肽的四环素诱导型转基因的小鼠的成骨细胞形成和破骨细胞形成，成骨细胞和破骨细胞细胞程序死亡，骨质量和骨强度。雌激素能通过ERα或ERβ或AR发挥抗细胞程序死亡作用，并且同样有效和具有相同的效力。另外，使用拮抗2XF6的选择性ER肽可以抑制ERα或ERβ介导的作用(图5B)。通过使用2XF6作转基因，可以保留通过AR发挥的雌激素或雄激素活性，同时抑制通过ERα和ERβ发挥的所述类固醇的活性。正如Gossen，M.等所披露的(1993，Trends.Biochem.Sci.18471-475，和GossenM.etal.，1995，Science2681766-1769)，通过将所述转基因置于由肌动蛋白启动子启动的TETON系统的控制之下，可以避免诸如很有可能混淆ERKO小鼠的结果的发育问题。所述反向四环素阻抑物(rTetR或TET-ON)系统利用了TetR-操纵子-四环素(Tc)相互作用、单纯疱疹病毒(HSV)-VP16转录激活结构域和四环素(Tc)的高度专一性。在所述常规(TET-OFF)系统中，Tc操纵的反式激活物(tTA——TetR和VP16蛋白的激活结构域之间的融合物)能刺激基因表达，正如在HeLa细胞中通过报导基因分析所证实的。证实在报导基因表达水平上的刺激效率提高了105倍。Tc能抑制tTA与一种基本启动子的tet操纵子(tetO)上游结合，并因此关闭tTA依赖型表达。不过，所述TET-ON系统采用了经过修饰的rtTA反式激活物，如Tc或其多西环素衍生物(Tox)，它能诱导而不是破坏VP16与所述操纵子的结合。所述TET-ON系统克服了在长时间接触四环素之后有可能对真核细胞造成的任何潜在的毒性作用。将两种结构导入相同的小鼠，以便进行Dox诱导的所述肽的表达。在第一种结构上，编码rtTA(包括rTETR和VP16激活结构域)的基因受肌动蛋白启动子的控制，以便进行普遍表达。业已将该启动子成功地应用于指导人胎盘碱性磷酸酶基因在转基因小鼠中普遍表达(DePrimo，S.E.etal.，1996，Transgenic.Res.5459-466)。将人生长激素(hGh)第一内含子区及其核定位信号(NLS)和聚腺苷酸化位点(polyA)克隆在所述肌动蛋白-rtTA结构下游，以便产生转录稳定性和最佳的蛋白表达水平。在第二种结构上，将具有tetO序列和最低启动子的四环素响应元件(TRE)置于GAL4DBD2XF6-hGh-poly(A)框上游。将两个拷贝的2XF6肽用于GAL4DNA结合结构域-2XF6肽融合体中，因为在抑制ERs的转录活性和抗细胞程序死亡活性方面，两个拷贝比一个拷贝更有效。将具有共整合结构的转基因小鼠生长到成年，然后用溶解在饮用水中的Dox处理。在缺乏多西环素(DOX)反式激活物的情况下，所述第一种结构受到了抑制，不能与tetO序列结合。一旦添加了多西环素，所述反式激活物就能识别存在于TRE中的并且受肌动蛋白启动子控制的目标tetO序列，并且启动所述肽序列的转录激活作用。制备用于显微注射的DNA结构按照标准亚克隆技术制备肌动蛋白-rtTA-poly(A)和TREGAL4DBD2XF6-hGh-poly(A)DNA结构。以上两种结构的每一种都需要多个克隆步骤。通过序列分析证实所述最终结构的每一个步骤，并且通过监测其抑制ERs针对Dox处理的活性的能力，确定其在HeLa细胞的瞬时转染体中的功能。转基因小鼠的制备和鉴定将肌动蛋白-rtTA-poly(A)和TREGAL4DBD2XF6-hGh-poly(A)DNA结构从其相应的载体上切除，并显微注射到受精的小鼠卵子中。让卵子达到双细胞期，并且重新植入假怀孕饲养小鼠的输卵管中。通过尾部DNAPCR筛选所产生的同窝崽，寻找肌动蛋白-rtTA-poly(A)和TREGAL4DBD2XF6-hGh-poly(A)转基因的共整合。为了研究以上两种DNA框是整合到宿主基因组的相同位点或是相似位点，让母鼠与C57BL6小鼠交配，并筛选其后代的转基因传递。在通过上述PCR方法进行尾部DNA筛选之后，选择以上两种结构为阳性的转基因同窝崽作进一步的鉴定。通过对尾部基因引向DNA的Southern印迹分析证实每一种整合转基因的DNA序列的完整性，并且和与每一种转基因的5’和3’末端同源的探针杂交。小鼠体内转基因表达的特征分析所鉴定的转基因动物(被称为Tet-F6)的特征是根据Dox启动F6肽表达的能力。按照文献中披露的方法(Ray，P.etal.，1997，J.Clin.Invest.1002501-2511)，用普通的水或添加了0.5毫克/毫升Dpox的水饲养双重转基因同窝崽不同的时间。该方法评估了通过用Dox处理小鼠以便诱导F6肽表达所需要的最低时间量。在添加Dox之前和之后第2、4、6天宰杀小鼠，并收获组织。从颅盖、股骨、脊椎骨、子宫、乳腺、和诸如肝脏、肺、肾、脾、大脑的多种软组织中提取总mRNA，并通过Nothern印迹分析评估F6肽表达。用相同的方法证实取消所述双转基因小鼠的饮用水中的Dox会导致肽产生的终止。评估所述肽抑制雌激素诱导的转录作用的能力让双转基因小鼠与ERE-lacZ转基因小鼠杂交。当三重转基因同窝崽生长到成年时，向饮用水中添加Dox，以便诱导并保持肽表达至少48小时。为了证实ER介导的转录受到了抑制，在用每克体重20纳克的E2处理之后24小时将动物宰杀，并且测定子宫、乳腺、股骨和脊椎骨中的LacZ活性。一旦在ERE-lacZ转基因小鼠中证实了肽的表达和ER转录的抑制，就用WT小鼠和Tet-F6小鼠确定所述抑制的直接证据，对假手术或卵巢切除小鼠进行诱导，以便在成年期表达F6至少28天。在手术之后，所有的组都以每克体重20纳克的剂量用E2处理28天。在28天的处理期之后，宰杀小鼠，并且分离子宫和乳腺。从所述组织中提取总RNA，并且筛选乳铁蛋白——由雌激素通过典型的ERE结合进行转录调控的基因的表达。已知在WT小鼠中，在相同的实验条件下，子宫中的乳铁蛋白mRNA提高了大约5倍。根据乳铁蛋白表达在Tet-F6动物中的缺乏，但在接受雌二醇的卵巢切除WT对照体中不缺乏，直接证实了ER肽拮抗剂的功能效用。骨骼表型的分析用E2(20纳克/克体重)或DHT(20纳克/克体重)或媒介物处理4个月大的雌性Tet-F6小鼠，以便启动转基因表达4-6周时间。将媒介物或类固醇处理的Tet-F6小鼠的骨骼表型与野生型动物进行比较，野生型动物在4个月大时进行卵巢切除，并且在卵巢切除之后，在不用或用E2或DHT处理的条件下再维持4-6周。在启动所述转基因或卵巢切除之后，通过每周1次进行体内DEXA分析，评估Tet-F6和野生型动物的骨质量。在所述4-6周时间结束时，宰杀两组动物，并进行以下测定a)整体和子宫和乳腺重量，b)长骨的长度和骨膜和骨内膜之间的宽度，c)在骨髓细胞的来自体内的培养物中成骨细胞形成和破骨细胞形成，d)在脊椎骨切片中成骨细胞/骨细胞和破骨细胞程序死亡的倾向，e)通过动态组织形态学测定确定的骨形成和再吸收速度，和f)脊椎骨的压缩强度。在宰杀动物进行动态组织形态学分析前8天和2天，通过腹膜内注射服用30纳克/克体重的盐酸土霉素。必须指出是，TET-ON系统对四环素的敏感性比对多西环素的敏感性低100-1000倍。另外，业已发现，服用多西环素(0.5毫克/毫升饮用水)对骨重塑没有作用，并且不会影响在注射(s.c)0.5毫克四环素之后，在网状骨中形成的四环素标记的观察。因此，这种操作应当不会影响所述转基因的表达，在此阶段所述转基因业已由多西环素启动。例8用αII和293作为转基因的转基因动物可以用类似方法制备具有编码两种ER肽拮抗剂αII+2X293(在此之前被称为Tet-肽)的四环素诱导型转基因的转基因小鼠。用αII+2X293作为转基因，可以保留通过ERα实现的非基因引向活性，但是可以抑制通过ERα和ERβ实现的转录活性和ERβ的非基因引向活性。293肽能抑制Erβ的转录活性和非转录活性，但是对ERα的转录活性和非转录活性没有作用。构建两种结构，并且同时导入同一只小鼠，用于进行Dox诱导的所述肽的表达(图8)。在第一种结构上，编码rtTA的基因(包括rTetR和VP16激活结构域)受肌动蛋白启动子的控制，以便进行普遍表达。将人生长激素(hGh)第一个内含子区及其核定位信号(NLS)和聚腺苷酸化位点(polyA)克隆到肌动蛋白-rtTA结构下游，以便产生转录物稳定性和最佳蛋白表达水平。在第二种结构上，将具有tetO序列和最低启动子的四环素响应元件(TRE)于置GAL4DBDαII-IRES-GFP2X293-hGh-poly(A)框上游。在该框中，GAL4DNA结合结构域αII肽融合体将内部核糖体进入位点(IRES，它能够从一种mRNA上翻译两个开放开放读框)连接到两个拷贝的293肽上，所述肽将与绿色荧光蛋白基因(GFP)融合。使用两个拷贝的293肽的原因是，初步的实验业已证实，在抑制ERβ的转录活性和抗细胞程序活性方面，两个拷贝比一个拷贝更有效。αII和X293肽中的每一种与不同的蛋白融合，而不是与相同的GAL4DBD融合，以避免在相同的GAL4DBD片段之间发生重组事件的可能性。另外，将GFP整合到GAL4DBDαII-IRES-GFP2X293-hGh-poly(A)框上，以便提供一种筛选肽表达的简单方法。让具有共整合结构的转基因小鼠生长到成年，然后用溶解在饮用水中的多西环素处理。在缺乏多西环素的条件下，第一种结构上的反式激活物与tetO序列的结合受到抑制。一旦添加了多西环素，反式激活物就能识别存在于TRE上，并且受肌动蛋白启动子控制的目标tetO序列，从而启动所述肽序列的转录激活作用。制备用于显微注射的DNA结构按照标准亚克隆技术制备肌动蛋白-rtTA-polyA和TRE-GAL4DBDαII-IRES-GFP2X293-hGh-poly(A)DNA结构。通过序列分析证实所述最终结构的完整性，并且通过监测其抑制ERα和ERβ的转录活性和ERβ的抗细胞程序死亡活性的能力，确定其在HeLa细胞的瞬时转染体中的功能。转基因小鼠的制备和鉴定将肌动蛋白-rtTA-polyA和TRE-GAL4DBDαII-IRES-GFP2X293-hGh-poly(A)DNA结构从其相应的载体上切除，并且显微注射到受精的小鼠卵子中。让卵子达到双细胞期，并且重新植入假怀孕饲养小鼠的输卵管中。通过尾部DNAPCR筛选所产生的同窝崽，寻找肌动蛋白-rtTA-poly(A)和TRE-GAL4DBDαII-IRES-GFP2X293-hGh-poly(A)转基因的共整合。为了研究以上两种DNA框是整合到宿主基因组的相同位点或是相似位点，让母鼠与C57BL6小鼠交配，并筛选其后代的转基因传递。在通过上述PCR方法进行尾部DNA筛选之后，选择以上两种结构为阳性的转基因同窝崽作进一步的鉴定。通过对尾部基因引向DNA的Southern印迹分析证实每一种整合转基因的DNA序列的完整性，并且和与每一种转基因的5’和3’末端同源的探针杂交。小鼠体内转基因表达的特征分析所鉴定的转基因动物的特征是根据Dox启动αII和293肽表达的能力。用普通的水或添加了0.5毫克/毫升Dox的水饲养双重转基因同窝崽不同的时间。该方法评估了通过用Dox处理小鼠以便诱导αII和293肽表达所需要的最低时间量。在添加Dox之前和之后第2、4、6天宰杀小鼠，并收获组织。从颅盖、股骨、脊椎骨、子宫、乳腺、和诸如肝脏、肺、肾、脾、大脑的多种软组织中提取总mRNA，并通过Northern印迹分析评估αII和293肽表达。用相同的方法证实取消所述双转基因小鼠的饮用水中的Dox会导致肽产生的终止。评估所述肽抑制雌激素诱导的转录作用的能力为了在Tet肽动物中测定雌激素转录活性的选择抑制作用，采用了两种方法。首先，让双转基因小鼠与ERE-lacZ转基因小鼠杂交。当三重转基因同窝崽生长到成年时，向饮用水中添加Dox，以便诱导并保持肽表达至少48小时。为了证实ER介导的转录受到了抑制，在用每克体重20纳克的E2处理之后24小时将动物宰杀，并且测定子宫、乳腺、股骨和脊椎骨中的LacZ活性。为了直接证实对ER-介导的转录的抑制，诱导WT小鼠和Tet-小鼠在成年期表达所述肽至少28天，然后进行假手术或卵巢切除。在手术之后，所有的组都以每克体重20纳克的剂量用E2处理28天。在28天的处理期之后，宰杀小鼠，并且分离子宫和乳腺。从所述组织中提取总RNA，并且筛选乳铁蛋白——由雌激素通过典型的ERE结合进行转录调控的基因的表达。已知在WT小鼠中，在相同的实验条件下，子宫中的乳铁蛋白mRNA提高了大约5倍。根据乳铁蛋白表达在Tet-肽动物中的缺乏，但在接受雌二醇的卵巢切除WT对照体中不缺乏，直接证实了ER肽拮抗剂的功能效用。骨骼表型的分析一旦产生了Tet-肽小鼠并且按照上述方法进行了特征分析，将雌性小鼠生长到4个月大。此时，启动转基因表达4-6周时间，并且将转基因小鼠的骨骼表型与野生型动物进行比较，野生型动物在4个月大时进行卵巢切除，并且在卵巢切除之后，再维持4-6周。在启动所述转基因或卵巢切除之后，通过每周1次进行体内DEXA分析，评估这两种动物的骨质量。当卵巢切除的野生型组动物的脑脊液BMD的变化百分比至少为-30％或者6周时宰杀这种动物，无论哪一种因素在先。这种差异需要每一组的8只动物超过80％的效能。在所述4-6周时间结束时，宰杀两组动物，并进行以下测定a)整体和子宫和乳腺重量，b)长骨的长度和骨膜和骨内膜之间的宽度，c)在骨髓细胞的来自体内的培养物中成骨细胞形成和破骨细胞形成，d)在脊椎骨切片中成骨细胞/骨细胞和破骨细胞程序死亡的倾向，e)通过动态组织形态学测定确定的骨形成和再吸收速度，和f)脊椎骨的压缩强度。在宰杀动物进行动态组织形态学分析前8天和2天，通过腹膜内注射服用30纳克/克体重的盐酸土霉素。必须指出是，TET-ON系统对四环素的敏感性比对多西环素的敏感性低100-1000倍。另外，业已发现，服用多西环素(0.5毫克/毫升饮用水)对骨重塑没有作用，并且不会影响在注射(s.c)0.5毫克四环素之后，在网状骨中形成的四环素标记的观察。例9具有诱导失活的性类固醇受体的转基因动物绝经后或阉割后的真实的和指导性的模型需要以细胞专一性形式(成骨细胞、破骨细胞和这两种细胞)和普遍形式缺失每一种性类固醇受体。业已证实噬菌体P1的Cre/loxP二元重组系统能有效介导在ES细胞(Zou，Y.R.etal.，1994，Curr.Biol.41099-1103；Gu，H.etal.，1993，Cell731155-1164)和转基因小鼠(Lakso，M.etal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA896232-6236；Orban，P.C.etal.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA896861-6865)中进行loxP位点专一性重组。制备用于显微注射的DNA结构用反向四环素受体(rTetR或TET-ON)系统进行了条件表达。在第一种结构上，编码rt-TA的基因受骨钙蛋白(OG-2)启动子的控制，以便进行成骨细胞专一性表达。将人生长激素(hGh)第一内含子区及其核定位信号(NLS)和聚腺苷酸化位点(polyA)克隆到OG-2-rtTA结构下游，以便产生转录物稳定性和最佳的蛋白表达水平。在第二种结构上，将四环素响应元件(TRE)置于Cre-hGh-poly(A)框上游。以上两种结构的每一种都需要多个克隆步骤(图9A)。通过合适的限制酶消化和PCR反应检查每一个步骤，并且对最终结构进行测序。另外，使用OB-6成骨细胞细胞系，在体外系统中证实了多西环素诱导的Cre表达的专一性和效率。业已对所述细胞进行了特征分析，并且发现能表达骨钙蛋白，以及表达ERα和ERβ。用OG-2-rtTA-polyA和TRE-Cre-hGh-polyA结构或空载体瞬时转染OB-6细胞，并且用1.5微克/毫升多西环素或用媒介物处理48小时。收获细胞，并用于提取总RNA。用Cre专一性引物进行的半定量RT-PCR分析，证实了Cre的专一性表达仅出现在用多西环素处理过的细胞群体中(图9B)。转基因小鼠的制备和鉴定用合适的限制性内切核酸酶将OG-2-rtTA-poly(A)和TRE-Cre-hGh-poly(A)DNA结构从相应的载体上切除，并且显微注射到受精的C57B1/6小鼠卵子的前核中。让卵子发育到双细胞期，并且重新植入假受精饲养母鼠的输卵管中。通过筛选OG-2-rtTA和TRE-Cre转基因的共整合鉴定母鼠。通过对尾部DNA进行PCR分析鉴定具有OG-2-rtTA和TRE-Cre结构(在上文称之为Tet-OG-2-Cre)的转基因小鼠，使用分别被设计用于扩增OG-2-rtTA和TRE-CreDNA序列部分的两套引物。为了研究以上两种DNA框是否整合到宿主基因组的相同位点，让母鼠与C57BL6小鼠交配，并筛选其后代的转基因传递。在通过上述PCR方法进行尾部DNA筛选之后，选择以上两种结构为阳性的转基因同窝崽作进一步的鉴定。通过对尾部基因引向DNA的Southern印迹分析，证实每一种整合转基因的DNA序列的完整性，并且和与每一种转基因的5’和3’末端同源的探针杂交。转基因表达的功能鉴定所鉴定的转基因动物的特征是根据Dox启动Cre表达的能力。按照文献中披露的方法(Ray，P.etal.，1997，J.Clin.Invest.1002501-2511)，用普通的水或添加了0.5毫克/毫升Dox的水饲养双重转基因同窝崽不同的时间。该方法评估了通过用Dox处理小鼠所需要的最低时间量。为了证实Cre的诱导型表达，在添加Dox之前和之后第2、4、6天宰杀小鼠，并收获组织。从颅盖、股骨、脊椎骨、子宫、乳腺、和诸如肝脏、肺、肾、脾、大脑的多种软组织中提取总mRNA，并通过Northern印迹分析评估Cre表达。用相同的方法证实取消所述双转基因小鼠的饮用水中的Dox会导致Cre产生的终止。为了监测Cre介导的重组，让Tet-OG2-Cre小鼠与可以从Jackson实验室获得的ROSA26报导小鼠杂交(Mao，X.etal.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA965037-5042)。在这些小鼠中，业已将氟氧化塞子(stopper)片段和β-半乳糖苷酶-新霉素磷酸转移酶融合基因(βgeo)整合到ROSA26基因座上。在进行Cre介导的塞子片段切除之后，βgeo的表达是由ROSA26等位基因的外显子1启动的，并且在胚胎发育和成年期间是普遍表达的。ROSA26小鼠与功能性Tet-OG-Cre转基因系的杂交导致了β-半乳糖苷酶在成骨细胞中的表达。对诸如颅盖、股骨和脊椎骨的组织进行染色，以便检查β半乳糖苷酶的表达。业已用一种类似方法评估了T细胞专一性表达(Mao，S.etal.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA965037-5042)。具有ERα的氟氧化外显子3的突变型小鼠品系第二个小鼠品系(Ind-α-ERKO)具有外显子3(653-845bp)，该外显子包括0.249kb小鼠ERαDNA结合结构域(740-989bp)的96kb(White，R.etal.，1987，Mol.Endocrinol.1735-744)，其旁侧是两个由Cre重组酶识别的loxP位点，每一个位点包括一系列34bp的串联重复。在用Cre重组酶作用之后，其旁侧为这两个loxP位点(氟氧化的)具有相同取向的所有DNA片段都被切除。通过缺失外显子3中所包含的DNA结合序列和弱的二聚体化结构域ERα失活，能破坏所述受体的转录活性。另外，外显子3包括若干潜在的受体序列，在选择消除外显子3上游片段的情况下，会导致产生其他的剪接变体。最后，Cre介导的外显子3的缺失破坏了下游ERαDNA序列的读框，并且使所述受体的抗细胞程序死亡或任何残余的活性失活，所述活性需要二聚体化和/或配体结合结构域。制备ERα突变小鼠从C57B1/6小鼠基因引向文库中分离并且亚克隆到BAC载体上的含有小鼠ERα基因的外显子3和4的86kb的基因引向基因座(图10)是由KenKorach博士(NIH)馈赠的。业已通过限制作图和序列分析对该基因引向基因座进行了进一步的鉴定，并且业已对其旁侧为5kb左臂和3kb右臂的含有外显子3(0.2kb)的HindIII/BamHI片段进行了亚克隆。在pEasy-Flox载体上构建导向结构，它包括三个loxP位点，其中两个位点的旁侧是受巨细胞病毒(CMV)启动子控制的新霉素抗性(neo1)基因，以及一个HSV-胸苷激酶(HSV-tk)框。图10表示在体外在ES细胞中制备并导向氟氧化外显子3的两步方法。在第一个步骤中，将具有左臂的氟氧化HSV-neo1选择标记上游、氟氧化外显子3和右臂以及随后的HSV-tk框的导向结构电穿孔导入C57B1/6ES细胞(从比利时的Eurogentec获得，并且通过二倍体聚合和四倍体聚合进行的种系传递测定呈阳性)，并且通过同源重组导向靶基因引向基因座的旁侧序列。在用丝裂霉素C和LIF处理过的、来自Swiss/129/Balb/C小鼠的新霉素抗性小鼠胚胎成纤维细胞的单层(同样获自Eurogentec)上生长转染过的ES细胞。按照业已完善的方法(Robertsonetal.，1986，Nature，323445-448)进行电穿孔，并用G418和鸟嘌呤筛选阳性ES克隆。通过对基因引向DNA进行Southern印迹分析证实所述导向结构通过同源重组进入了G418阳性克隆。业已报导同源重组的比例为每18个双重药物抗性克隆中有1次(Gu，H.Jetal.，1994，Science265103-106)，至每50个双重药物抗性克隆中有1次(Basparakis，M.etal.，1996，JExp.Med.1841397-1411)。在所述第二个步骤中，将具有受CMV启动子控制的Cre的质粒电穿孔导入遗传学修饰的ES细胞中。由于Cre的表达是瞬时的，所述重组事件在三个loxP位点的两个之间发生1次，产生三种可能形式的缺失。I型缺失导致了完整的外显子3-loxP-HSV-neor选择标记从ES细胞的基因组中以及由在其种系中具有氟氧化外显子3的相应ES细胞衍生的动物中缺失。通过Southern印迹分析鉴定了III型缺失。这种方法业已公开，并成功地应用于DNA聚合酶β基因片段的T细胞专一性缺失(Gu，H.J.etal.，1994，Science，103-106)。将导向ES细胞显微注射到BALB/C胚泡中。让雄性嵌合体与C57B1/6雌性进行交配。通过Southern印迹分析证实在后代中的种系传递。最后，通过传统受体结合研究测定氟氧化基因的功能完整性，并且用从诸如卵巢和子宫的传统靶组织中分离的细胞测定转录。为了获得ERα的成骨细胞或破骨细胞专一性失活，让Ind-αERKO小鼠与Tet-OG2-Cre转基因小鼠或TRAP-Cre转基因小鼠交配。让产生的后代生长到成年，并且对于Tet-OG2-Cre来说，用多西环素处理预定的时间，以便实现Cre的最大表达。然后宰杀小鼠，并且收获包括颅盖、股骨、脊椎骨、乳腺、肺、肝脏、肾和大脑在内的组织，并提取基因引向DNA。通过对从不同组织中提取的基因引向DNA进行Southern印迹分析评估Cre介导的细胞专一性外显子3缺失的效率。通过用多ERE-荧光素酶报导结构转染从ERα剔除小鼠中分离的颅盖细胞证实ERα的成骨细胞专一性失活。ERα失活在成骨细胞，而不是其他细胞中的专一性是用来自同一只小鼠的乳腺和子宫细胞取代颅盖成骨细胞进行的同一种研究证实的。Ernst和同事以前业已成功地将该方法用于证实功能性内源ERs在成骨细胞中的低水平存在(Ernst，M.，M.G.Parker，andG.A.Rodan.，1991，Mol.Endocrinol.111597-1606)。在上述实验中，通过使用由Illinois大学(Urbana-Champaign)的JohnKatzenellenbogen博士开发的一种合成化合物ERα-专一性配体丙基吡唑三醇取代17β-E2消除了通过ERβ发挥的对ERE转录的潜在作用。丙基吡唑三醇是一种结构多样性ER配体，它与由Katzenellenbogen博士小组报导的一组化合物相关(Sun，J.etal.，1999，Endocrinology140800-804)。该化合物具有突出的ERα-选择性结合亲和力(RBAs与17β-E2的亲和力对于ERα来说为63，对于ERβ来说是0.095)，并且在瞬时转染的人子宫内膜癌细胞(HEC-1)中具有高的ERα转录效力，但是即使在最高浓度的处理下也没有ERβ介导的转录活性(个人交流)。作为在剔除小鼠中证实以成骨细胞专一性方式使ERα失活的另一种方法，让剔除小鼠与ERE-lacZ报导小鼠杂交。对所产生的同窝崽和野生型动物进行卵巢切除，以便消除内源雌激素。在卵巢切除之后1周，用丙基吡唑三醇对每一种类型的小鼠进行24小时处理。在24小时处理时间之后，将小鼠宰杀，通过用β半乳糖苷酶对子宫、乳腺和骨切除染色分析ERα转录活性或这种活性的缺乏。除了制备ERA失活仅定向于成骨细胞和破骨细胞的小鼠之外，还通过让Ind-αERKO小鼠与具有Mx-Cre转基因的现有转基因小鼠(Kuhn，R.etal.，1995，Science2691427-1429)杂交获得了使能表达该基因的所有类型细胞中的ERα失活的不同的小鼠。在该小鼠中，Cre重组酶受Mx1基因启动子的控制。该基因在健康小鼠体内是沉默的，但是它在受到病毒感染时被激活。在实验中，通过服用1FN-α或β或合成的双链RNA聚肌苷酸-聚胞苷酸(pI-pC)可以将Mx1启动子的活性刺激到非常高的水平，所述化合物本身在小鼠体内是IFN诱导物。同时获得了氟氧化ERα和Mx-Cre的小鼠在用IFN或pI-pC处理时在ERα上获得了失活突变。例10筛选非基因引向雌激素样信号传导的方法通过高处理量组合筛选方法鉴定缺乏转录活性的非基因引向雌激素样信号传导的激活物，所述筛选方法能通过SRE-SEAP检测系统(正结果)和C3(补体3)转录(负结果)同时检测ERK激活。为此，用具有hERα和/或hAR的逆转录病毒、SRE-SEAP和C3-Luc质粒对HeLa细胞进行稳定转染。在本发明的另一方面，稳定转染体中hERα或hAR基因是在TET-OFF(四环素-OFF)系统的控制下进行条件表达的。SRE-SEAP测定方法通过分析转录因子(Elk-1/SRP)检测MAPK/JNK信号传导途径-诱导位于能启动分泌型碱性磷酸酶(SEAP)表达的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)启动子上游的血清响应元件(SRE)的激活。该测定方法可以通过商业途径获得。用于MEK1或MEKK1激酶的体内测定的试剂盒也可以通过商业渠道获得。一般，在转染之后24小时，用含有大约0.2％血清的培养基取代含有血清的培养基。在大约0.2％血清中培养细胞24小时，然后测定。对照样品仅用媒介物处理。一般，以每孔4-5×104的浓度将HeLa细胞铺平板在48孔平板上，并且在含有10％活性炭、10％活性炭剥离的FBS(胎牛血清)、抗生素(青霉素和链霉素)和谷氨酰胺的不含酚红的MEM培养基中培养一夜。除去培养基，用PBS洗涤2次，并且用含有转染混合物(脂转染胺，脂转染胺加上最多达到6毫克总量待转染DNA)的不合血清并且不合抗生素的培养基覆盖。用所述转染混合物培养细胞2-3小时。除去转染混合物，并且用10％活性炭剥离的FBS、抗生素和谷氨酰胺的不含酚红的MEM培养基中取代，让所述细胞恢复24小时。用新的含有2％活性炭剥离的FBS、抗生素和谷氨酰胺的不含酚红的MEM培养基取代含有10％FBS的培养基。在含有0.2％FBS培养基中培养细胞24小时。用需要的浓度处理细胞24小时。用商业购买的试剂盒，按照生产商的说明在50毫升含有0.2％FBS的细胞培养基中测定SRE-SEAP活性。在瞬时转染的情况下，通过测定细胞裂解物中Renilla荧光素酶活性对转染效率的数据进行校正。17β-雌二醇是ERK激酶和C3转录的阳性化合物对照。可以将吡唑用作ERK激活的负对照，将estren用作C3转录的负对照。选择与17β-雌二醇相比具有强的FRE-SEAP活性，但具有弱的但缺乏C3-Luc活性的化合物。选择标准可以包括根据ERK激活与C3转录的比例对感兴趣的化合物进行分类。可以进一步筛选感兴趣的化合物的成骨细胞/骨细胞抗细胞程序死亡活性。另外，可以使用组合化学的新型配体和ER的结合穴的3D模拟合成新型配体。本领域技术人员可以理解的是，本发明非常适合完成本文所提到的目的，并获得所提到过的结果和优点，以及本发明所固有的目的结果和优点。本发明所披露的实施例和方法、方案、治疗剂、分子和特定化合物是作为优选实施方案的代表提供的，是示意性的，而不是要限定本发明的范围。本领域技术人员可以想到的变化和其他用途包括在由权利要求书的范围所限定的本发明的构思内。序列表序列表<110>阿肯色大学评议会(BOARDOFTRUSTEESOFTHEUNIVERSITYOFARKANSAS)<120>分离类固醇受体的非基因引向活性和基因引向活性的方法<130>60/211,287<140>PCT/US01/18950<141>2001-06-13<150>US60/211,287<151>2000-06-13<160>17<170>PatentInversion3.1<210>1<211>15<212>PRT<213>人工的<220><223>雌激素受体alphaII肽<400>1SerSerLeuThrSerArgAspPheGlySerTrpTyrAlaSerArg151015<210>2<211>15<212>PRT<213>人工的<220><223>雌激素受体beta肽-293<400>2SerSerIleLysAspPheProAsnLeuIleSerLeuLeuSerArg151015<210>3<211>19<212>PRT<213>人工的<220><223>雌激素受体alpha，beta肽-F6<400>3GlyHisGluProLeuThrLeuLeuGluArgLeuLeuMetAspAspLys151015GlnAlaVal<210>4<211>133<212>PRT<213>人工的<220><223>GRIP蛋白<400>4HisSerArgLeuHisAspSerLysGlyGlnThrLysLeuLeuGlnLeu151015LeuThrThrLysSerAspGlnMetGluProSerProLeuProSerSer202530LeuSerAspThrAsnLysAspSerThrGlySerLeuProGlyProGly354045SerThrHisGlyThrSerLeuLysGluLysHisLysIleLeuHisArg505560LeuLeuGlnAspSerSerSerProValAspLeuA1aLysLeuThrAla65707580GluAlaThrGlyLysGluLeuSerGlnGluSerSerSerThrAlaPro859095GlySerGluValThrValLysGlnGluProAlaSerProLysLysLys100105110G1uAsnAlaLeuLeuArgTyrLeuLeuAspLysAspAspThrLysAsp115120125IleGlyLeuProGlu130<210>5<211>30<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>5gccgctagcaccatgaccatgaccctccac30<210>6<211>28<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>6gccaccggtctgactgggcagggaaacc28<210>7<211>33<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>7gccgctagcaccatgaagaacagcctggccttg33<210>8<211>29<212>DNA<213>人工的<220><223>引物<400>8gccaccggtctagtgggcgcatgtaggcg29<210>9<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>雌激素受体alpha-引物<400>9tctgccaaggagactcgctactgt24<210>10<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>雌激素受体alpha--引物<400>10ettggccaaaggttggeage20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工的<220><223>雌激素受体beta--引物<400>11gaagtgccagegageaggtg20<210>12<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>雌激素受体beta--引物<400>12tgctgggaeggeteaetageaeat24<210>13<211>18<212>DNA<213>人工的<220><223>雄激素受体--引物<400>13tgtgtggaaatagatggg18<210>14<211>18<212>DNA<213>人工的<220><223>雄激素受体--引物<400>14tacatgtggteaagtggg18<210>15<211>24<212>DNA<213>人工的<220><223>beta肌动蛋白--引物<400>15tggagaagagctatgagctgcctg24<210>16<211>26<212>DNA<213>人工的<220><223>beta肌动蛋白--引物<400>16gtgccaccagacagcactgtgtgttg26<210>17<211>399<212>DNA<213>人工的<220><223>GRIP<400>17cacagccggctgcatgacagcaaagggcagaccaaactcctgcagctgctgaccaccaag60tccgaccagctggagccttcacccttgcccagctccttgtcggacacaaacaaggactca120acagggagcttgcctgggcctgggtccacgcatggcacctcgctcaaggagaagcataag180attttgcacagactcttacaggacagcagttcccctgtggacttggccaagctgacagca240gaagccacaggcaaagagctgagccaggagtccagcagcacagctcctgggtcggaagtg300actgtcaaacaggagccagcgagccccaagaagaaagagaatgcactactgcgctatttg360ctcgacaaagatgatactaaagatattggtttaccggaa399权利要求1.用一种化合物诱导一种受体的选择性作用的用途，包括让所述受体与一种能诱导非基因引向作用而又不会明显诱导基因引向作用的化合物接触，其中，所述受体选自孕酮受体、糖皮质素受体、盐皮质素受体、视黄酸受体、维生素D受体、PPAR受体、孕烷X受体、胆酸受体、甲状腺受体、farnesoidX受体、肝脏X受体、蜕皮激素受体和COUP-TF受体。2.如权利要求1的用途，其中，所述非基因引向作用是由于所述化合物与所述受体的配体结合结构域的相互作用而出现的。3.如权利要求1的用途，其中，所述非基因引向作用是由于所述化合物激活了与雌激素受体的配体结合结构域功能等同的所述受体的一部分而出现的。4.如权利要求1的用途，其中，所述基因引向作用是由所述受体的DNA结合结构域介导的。5.用一种化合物诱导一种受体的选择性作用的用途，包括让所述受体与一种能诱导基因引向作用而又不会明显诱导非基因引向作用的化合物接触。6.如权利要求5的用途，其中，所述受体选自孕酮受体、糖皮质素受体、盐皮质素受体、视黄酸受体、维生素D受体、PPAR受体、孕烷X受体、胆酸受体、甲状腺受体、farnesoidX受体、肝脏X受体、蜕皮激素受体和COUP-TF受体。7.如权利要求5的用途，其中，所述基因引向作用是蛋白合成。8.一种用于筛选能诱导类固醇受体非基因引向作用的化合物的方法，包括评估所述化合物激活由所述类固醇受体的配体结合结构域介导的途径，而又不会明显激活所述类固醇受体的DNA结合结构域，或者激活所述类固醇受体的DNA结合结构域，而又不会明显激活由所述类固醇受体的配体结合结构域介导的功能的能力；和测定所述测试化合物的生物学活性，以便评估其诱导目标非基因引向作用而又不会明显诱导基因引向作用的能力，或其诱导目标基因引向作用而又不会诱导明显的非基因引向作用的能力。9.如权利要求8的方法，其中，所述类固醇受体不是雌激素或孕酮受体。10.如权利要求8的方法，其中，所述类固醇受体选自孕酮受体、糖皮质素受体、盐皮质素受体、视黄酸受体、维生素D受体、PPAR受体、孕烷X受体、胆酸受体、甲状腺受体、farnesoidX受体、肝脏X受体、蜕皮激素受体和COUP-TF受体。11.用一种化合物诱导一种雌激素受体的选择性作用的用途，包括让所述雌激素受体与一种能诱导不是通过激活细胞外调控的激酶而介导的非基因引向作用而又不会明显诱导基因引向作用的化合物接触。12.用一种化合物诱导一种雌激素受体的选择性作用的用途，包括让所述雌激素受体与一种能不是为了治疗骨流失或提高骨质量而诱导非基因引向作用而又不会明显诱导基因引向作用的化合物接触。13.用一种化合物诱导一种雄激素受体的选择性作用的用途，包括让所述雄激素受体与一种能诱导不是通过激活细胞外调控的激酶而介导的非基因引向作用而又不会明显诱导基因引向作用的化合物接触。14.用一种化合物诱导一种雄激素受体的选择性作用的用途，包括让所述雄激素受体与一种能不是为了治疗骨流失或提高骨质量或为了治疗与雌激素相关的癌症或子宫内膜异位而诱导非基因引向作用而又不会明显诱导基因引向作用的化合物接触。15.用一种化合物诱导一种类固醇受体的非基因引向作用的用途，包括服用除了雌激素或雄激素之外的含有环戊菲烷核的化合物，该化合物能结合所述类固醇受体，并且诱导需要的非基因引向作用而又不会诱导类固醇诱导的基因引向作用。16.一种用于筛选能诱导选择性类固醇受体响应的化合物的方法，包括让一种类固醇受体与一种测试化合物接触；测定所述化合物是否能激活一种受体的非基因引向活性；测定所述受体-测试化合物复合物的转录活性；和选择能激活所述受体的非基因引向活性，并且诱导所述受体的转录活性低于内源类固醇受体配体的10％。17.如权利要求16的方法，其中，所述非基因引向活性是抑制细胞程序死亡。18.如权利要求16的方法，其中，所述非基因引向活性是信号转导途径。19.如权利要求16的方法，其中，所述非基因引向活性是二级信号系统。20.如权利要求18的方法，其中，所述信号转导途径是蛋白激酶信号转导途径。21.如权利要求20的方法，其中，所述蛋白激酶信号转导途径是MAP激酶信号转导途径。22.如权利要求21的方法，其中，所述MAP激酶信号转导途径是Src/Shc/细胞外调控的激酶信号转导途径。23.一种评估化合物的方法，包括以下步骤生长组织培养细胞系，直到细胞生长达到合适的铺满度；用一种特定受体的合适的表达质粒和对所选择的受体有靶基因反应的表达质粒转染所述组织培养物；让转染的细胞与一种测试化合物接触；测定所述测试化合物是否能诱导非基因引向作用而又不会明显诱导基因引向作用。24.如权利要求23的方法，其中，所述受体不是雌激素或孕酮受体。25.如权利要求23的方法，其中，所述靶基因选自氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、肽激素、生长因子和嵌合蛋白。26.如权利要求23的方法，其中，所述靶基因的转录水平是通过选自下列一组的方法测定的热值测定，荧光；免疫化学，化学或放射化学方法。27.一种用于筛选用来治疗与类固醇受体相关的疾病或失调的化合物的方法，包括让表达一种选择的天然或人工类固醇受体的细胞与一种测试化合物接触；评估所述化合物是否能激活所述类固醇受体的非基因引向活性；测定由所述测试化合物所诱导的转录水平；和选择能激活所述类固醇受体的非基因引向活性而又不会明显激活所述类固醇受体的基因引向活性的化合物。28.一种用于筛选用来治疗与类固醇受体相关的疾病或失调的化合物的方法，包括让表达一种天然或人工性类固醇受体的细胞与一种测试化合物单独接触或与促-细胞程序死亡剂组合接触；评估所述化合物是否能激活所述类固醇受体的非基因引向活性；测定由所述测试化合物所诱导的转录水平；测定所述测试化合物是否能抑制与测试化合物单独接触或与前细胞程序死亡剂组合接触的细胞的程序死亡；选择能激活所述类固醇受体的非基因引向活性而又不会明显激活所述类固醇受体的基因引向活性的化合物。29.一种用于筛选能调节一种类固醇受体的非基因引向活性而又不会调节所述类固醇受体的基因引向活性的化合物的方法，包括以下步骤让能表达天然或人工类固醇受体的细胞与一种测试化合物接触；测定与所述测试化合物接触的细胞中的细胞外调控的激酶激活的量；测定与所述测试化合物接触的细胞中的转录量；筛选和雄激素或雌激素接触的细胞的转录水平相比表现出细胞外调控激酶激活和最低转录水平的与所述化合物接触的细胞。30.一种用于筛选能调节一种类固醇受体的非基因引向活性而又不会调节所述类固醇受体的基因引向活性的化合物的方法，包括以下步骤让细胞与至少一种测试化合物接触，其中，所述细胞包括a能表达类固醇受体蛋白的非内源DNA，或其功能性工程改造的或修饰过的形式，b编码与第一个报导基因连接的操纵性激素响应元件的DNA；和c编码与信号转导途径响应转录控制单位可操作地连接的第二个报导基因的DNA，这样，所述第二个报导基因的转录根据一种信号转导途径的激活而被激活，其中，所述的第二个报导基因的转录不会被所述类固醇激素激活；分析所述报导基因在所述细胞中转录的证据；和筛选能诱导所述第二个报导基因的转录，而不能诱导所述第一个报导基因转录的化合物。31.一种用于筛选能调节一种类固醇受体的非基因引向活性而又不会调节所述类固醇受体的基因引向活性的化合物的方法，包括以下步骤让细胞与至少一种测试化合物接触，其中，所述细胞包括a能表达类固醇受体蛋白的非内源DNA，或其功能性工程改造的或修饰过的形式，b编码与信号转导途径响应转录控制单位可操作地连接的报导基因的DNA，这样，所述报导基因的转录根据一种信号转导途径的激活而被激活，其中，所述的第二个报导基因的转录不会被所述类固醇激素激活；分析所述报导基因在所述细胞中转录的证据；对所述类固醇受体响应基因的转录进行定量；和筛选能诱导所述报导基因的转录，而不能诱导所述类固醇受体响应基因转录的化合物。32.如权利要求30或31的方法，其中信号转导途径响应转录控制单位选自血清响应元件、激活蛋白1、cAMP响应元件、E-框DNA结合元件、E2FDNA结合元件、糖皮质素响应元件、热激响应元件、干扰素γ激活序列、干扰素刺激的响应元件、活化T细胞的核因子、κB细胞的核因子、p53响应元件、Rb响应元件、和STAT3响应元件。33.一种用于鉴定能够激活非基因引向受体活性而又不会明显激活基因引向受体活性的测试化合物或化学信号的分析方法，该方法包括以下步骤在选择性地补充了养分的、化学上确定的培养基中生长组织培养筛选系统，其中，该组织培养筛选系统的细胞系含有一种具有至少一种鉴定的非基因引向活性的类固醇受体；将一种测试化合物或化学信号添加到所述培养基中；测定转录量；测定非基因引向活性量；筛选能够诱导非基因引向活性而又不会诱导转录的化合物。34.如权利要求33的方法，其中，所述细胞系是OB-6。35.一种筛选能诱导非基因引向活性而不会明显诱导基因引向活性的类固醇受体的配体的方法，该方法包括以下步骤让一种细胞与一种测试化合物接触，其中，所述细胞业已用以下成分转染过i)编码功能性类固醇受体或类固醇受体的遗传学变体的DNA序列；ii)响应元件-报导基因结构；和iii)血清响应元件-报导基因结构；测定所述测试化合物对所述响应元件报导基因结构转录的影响；测定所述测试化合物对血清响应元件-报导基因结构转录的影响；和选择能激活所述血清响应元件-报导基因结构的转录而又不会明显影响响应元件报导基因结构转录的化合物。36.一种筛选能诱导非基因引向活性而不会明显诱导基因引向活性的类固醇受体的配体的方法，该方法包括以下步骤让一种第一种细胞与一种测试化合物接触，其中，所述细胞业已用以下成分转染过i)编码功能性类固醇受体或类固醇受体的遗传学变体的DNA序列；ii)响应元件-报导基因结构；测定所述测试化合物对响应元件-报导基因结构转录的影响；让一种第二种细胞与一种测试化合物接触，其中，所述细胞业已用与报导基因可操作地连接的信号转导途径响应转录控制单位转染过；测定所述测试化合物对所述第二种细胞转录的影响；和选择能激活所述第二种细胞的转录而又不会明显影响第一种细胞转录的化合物。37.一种用于测定类固醇受体依赖型非基因引向活性的试剂盒，包括具有一种稳定转染的细胞系的容器，其中，所述细胞系包括一种类固醇响应报导基因结构，一种用于评估非基因引向类固醇基因活性激活的装置，和一种类固醇受体。全文摘要本发明涉及对理解类固醇非基因引向作用的机制及其与基因引向作用的关系的基本发现。业已发现(i)类固醇非基因引向作用和基因引向作用可以通过相同的类固醇受体介导；(ii)这两种作用都是配体诱导的；(iii)非基因引向作用的发生是由于配体结合结构域的配体诱导活性所致，这种作用可能是快速并且是松散的结合；(iv)基因引向作用的发生，是由于类固醇受体的DNA结合结构域的配体诱导的活性所导致的，它通常是一种较慢的、较强的相互作用的结果；和(v)配体相互作用的非基因引向作用可以从配体相互作用的基因引向作用中分离，这样就可以实施选择性的反应。本发明还首次披露了某些类固醇能够通过与不相关的类固醇受体结合诱导非基因引向作用。文档编号C12Q1/68GK1849335SQ01814082公开日2006年10月18日申请日期2001年6月13日优先权日2000年6月13日发明者S·C·马诺拉加斯,S·库斯特尼申请人:阿肯色大学评议会